1.- Determinación Cuantitativa de Glucosa en suero

PRÁCTICA No.1 “DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCOSA EN SUERO”

INTRODUCCIÓN La glucosa es la principal fuente de energía para el metabolismo celular. Se obtiene fundamentalmente a través de la alimentación, y se almacena principalmente en el hígado, el cual tiene un papel primordial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (glucemia). Para que esos niveles se mantengan y el almacenamiento en el hígado sea adecuado, se precisa la ayuda de la insulina, sustancia producida por el páncreas.1 La glucosa es un azúcar que es utilizado por los tejidos como forma de energía al combinarlo con el oxígeno de la respiración. Cuando comemos el azúcar en la sangre se eleva, lo que se consume desaparece de la sangre, para ello hay una hormona reguladora que es la insulina producida por el páncreas (islotes pancreáticos). Esta hormona hace que la glucosa de la sangre entre en los tejidos y sea utilizada en forma de glucógeno, aminoácidos, y ácidos grasos. Cuando la glucosa en sangre está muy baja, en condiciones normales por el ayuno, se secreta otra hormona llamada glucagón que hace lo contrario y mantiene los niveles de glucosa en sangre. 2 Cuando la insulina es insuficiente, la glucosa se acumula en sangre, y si esta situación se mantiene, da lugar a una serie de complicaciones en distintos órganos. Esta es la razón principal por la que se produce aumento de glucosa en sangre, pero hay otras enfermedades y alteraciones que también la provocan. 1 El tejido más sensible a los cambios de la glucemia es el cerebro, en concentraciones muy bajas o muy altas aparecen síntomas de confusión mental e inconsciencia. 2 El mantenimiento de la glucemia, o concentración plasmática de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los órganos, al ser la glucosa un metabolito energético principal. La coordinación de los procesos metabólicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relación insulina/glucagón. La ingestión de glucosa o sustancias que la produzcan (almidón, fructosa, galactosa, proteínas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilización de glucosa (por glucólisis, entre otras), aceleración de la glucogenogénesis y disminución de la glucogenólisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secreción de insulina, una hormona pancreática de tipo polipeptídico. En el caso de que la producción de insulina esté disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las células, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia); así ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo 1". El diagnóstico de la diabetes dependiente de insulina es sencillo y se basa en antecedentes, síntomas clínicos y comprobación de una hiperglucemia significativa. Las determinaciones de glucemia basal permiten el diagnóstico de la diabetes, pero constituyen valores puntuales y aislados en el tiempo que no reflejan los niveles medios de glucemia ni la duración de la misma. Por lo tanto, es necesario disponer de pruebas que indiquen el grado del control metabólico de la enfermedad a corto y medio plazo. Estas pruebas están basadas en el fenómeno de unión de la glucosa a diversas proteínas. Esta glucosilación tiene lugar por una reacción no enzimática y afecta tanto a proteínas de vida media corta (albúmina, hemoglobina, etc.) como de vida media larga (colágeno, mielina, etc.). La intensidad de la glucosilación depende de varios factores, siendo los más importantes los niveles medios de glucemia, la duración de la hiperglucemia, la vida media de las proteínas y la concentración de éstas. Como consecuencia, la medida de la glucosilación proteica constituye un buen marcador bioquímico del grado de compensación del enfermo diabético. Análisis de glucosa en sangre

El análisis de la glucosa Mide la cantidad (concentración) de glucosa presente en la sangre y sobre todo se realiza para estudiar la posible presencia de una diabetes mellitus o sacarina. Como es una enfermedad muy compleja y con grandes repercusiones de salud es un análisis muy discriminativo d iscriminativo y útil que se realiza de forma bastante rutinaria. Como se ha indicado, la diabetes dependiente de insulina cursa con un aumento de la concentración de glucosa en sangre (glucemia), que se produce de manera repentina y la hiperglucemia es severa. Una hiperglucemia superior a 140 mg/dL detectada en más de una ocasión en ayunas es un índice de posible diabetes, diagnóstico que debe confirmarse con otras pruebas. La determinación de glucosa 1

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sanguínea es una prueba muy frecuente en bioquímica y se puede llevar a cabo tanto por métodos químicos como enzimáticos, siendo estos últimos los más específicos. Hay dos tipos de métodos químicos: a) Reductimétricos, que se basan en la capacidad reductora de la glucosa. Debido a la presencia en la muestra de otros compuestos reductores, estos métodos dan cifras superiores a las correspondientes a la glucosa verdadera. b) Furfurálicos: se basan en la capacidad de la glucosa para formar furfural al sufrir deshidratación en un medio ácido. Un ejemplo es el método que emplea o-toluidina. En cuanto a los métodos enzimáticos: a) Método de la hexoquinasa: emplea las enzimas hexoquinasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Por cada molécula de glucosa se forma una de NADPH, que puede medirse espectrofotométricamente a 340 nm. Es el método de referencia recomendado por las organizaciones internacionales. b) Método de glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD): es el que se utiliza en esta práctica para medir los niveles de glucosa sanguínea de ratas diabéticas y controles. 3 Técnica

Para realizar este análisis se precisa estar en ayunas al menos las las 6 horas previas. Se puede realizar la toma en un lugar apropiado (consulta, clínica, hospital) pero en ocasiones se realiza en el propio domicilio del paciente. ∗ Para realizar la toma se precisa de localizar una vena apropiada y en general se utilizan las venas situadas en la flexura del codo. La persona encargada de tomar la muestra utilizará guantes sanitarios, una aguja (con una jeringa o tubo de extracción) . ∗ Le pondrá un tortor (cinta de goma-látex) en el brazo para que las venas retengan más sangre y aparezcan más visibles y accesibles. ∗ Limpiará la zona del pinchazo con un antiséptico y mediante una palpación localizará la vena apropiada y accederá a ella con la aguja. Le soltarán el tortor. ∗ Cuando la sangre fluya por la aguja el sanitario realizará una aspiración (mediante la jeringa o mediante la aplicación de un tubo con vacío). ∗ Al terminar la toma, se extrae la aguja y se presiona la zona con una torunda de algodón o similar para favorecer la coagulación y se le indicará que flexione el brazo y mantenga la zona presionada con un esparadrapo durante unas horas. Problemas y riesgos: 1. 2. 3.

La obtención mediante un un pinchazo de la vena puede producir cierto dolor. La posible dificultad en encontrar la vena apropiada puede puede dar lugar a varios pinchazos Aparición de un hematoma (moratón o cardenal) en la zona de extracción, extracción, suele deberse a que la la vena no se ha cerrado bien tras la presión posterior y ha seguido saliendo sangre produciendo este problema. Puede aplicarse una pomada en la zona. 4. Inflamación de la vena (flebitis), (flebitis), a veces la vena se ve alterada, bien sea por una causa meramente física o por que se ha infectado. Se deberá mantener la zona relajada unos días y se puede aplicar una pomada en la zona. Si el problema persiste o aparece fiebre deberá consultarlo con su médico. Valores normales de glucosa en la s angre:  Los

valores normales son entre 70 y 105 mg por decilitro. En los niños pequeños se aceptan valores de 40 a 100 mg/dl.  Los valores más bajos de 40-50 4 0-50 mg/dl se consideran bajos (hipoglucemia). 2  Los valores más altos de 128 mg/dl se consideran altos (hiperglucemia).





 Fármacos:

algunos pueden aumentar los niveles de glucosa en sangre u orina, otros pueden disminuir los niveles en sangre y otros pueden interferir en los resultados obtenidos con las tiras reactivas para medir la glucosuria (antidepresivos, antihipertensivos, hormonas femeninas, etc...) 1  El alcohol y analgésicos pueden disminuirla  Los tratamientos con sueros en vena, ya que contienen dextrosa (azúcar)  Embarazo Patologías relacionadas:  Puede

∗ ∗ ∗ ∗ ∗

aparecer la glucemia aumentada (hiperglucemia) en: Diabetes mellitus ∗ ∗ Enfermedades renales Feocromocitoma ∗ ∗ Hipertiroidismo Glucagonoma

 Puede

∗ ∗ ∗ ∗

aparecer la glucemia disminuida (hipoglucemia) en: Dietas excesivas Enfermedades hepáticas Enfermedad de Addison Exceso de insulina en diabéticos

Pancreatitis aguda Síndrome de Cushing Tumores de páncreas Otras situaciones antes explicadas (estrés, sueros, embarazo, medicamentos) ∗ Hipopitituarismo ∗ Hipotiroidismo 2 ∗ Insulinoma

Principio del Método de Determinación cuantitativa de glucosa IVD (Spinreact)

La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa a acido glucónico. El peróxido de hidrogeno (H2O2), producido se detecta mediante un aceptor cromo génico de oxigeno, oxigeno, fenol-ampirona en presencia de peroxidasa (POD): Reacción:

ß-D-Glucosa + O2 + H2O

H2O2 + Fenol + Ampirona Fundamento:

En el método GOD-POD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la Dglucosa a ácido D-glucónico con formación de peróxido de hidrógeno. Éste es utilizado por la peroxidasa para oxidar a la 4aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad de color será proporcional a la concentración de glucosa presente inicialmente. (En ocasiones se utilizan otros sustratos en lugar de 4aminofenazona+fenol, tales como o-dianisidina, guayacol y ABTS.) Esquema de la reacción:3 Significado Clínico

GOD POD

Acido glucónico + H 2O2 Quinona + H2O





MATERIAL: 4 4

sistemas vacutainer (aguja y jeringa) ligaduras  4 tubos vacutainer con heparina  4 tubos vacutainer sin heparina  1 gradilla  4 tubos de ensaye (13x100ml)

 Palillos  2 pipetas 1 3

Pasteur con bulbo pipeta de 100 µL pipetas de 1m l

Equipo:  Espectrofotómetro

o analizador para lecturas a 505nm.  Cubetas de 1,0 cm de paso de luz Muestras:  Suero

libre de hemólisis (El suero debe separarse lo antes posible del coagulo) *Estabilidad: La glucosa en suero o plasma es estable 3 días a 2-8°C

Reactivos: R1

Tampón R2

Enzimas GLUCOSE CAL

TRIS pH 7,4 Fenol Glucosa oxidasa (GOD) Peroxidasa (POD ) 4-Aminofenazona (4.AF) Patrón primario acuoso de Glucosa

92 mmol/L 0,3mmol/L 15000U/L 1000U/L 2,6 mmol/L 100mg/dL

Conservación y estabilidad:  Todos

los componentes del Kit. Kit. son estables , hasta la fecha fecha de caducidad indicada en la etiqueta, cuando cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8° C ,protegidos de la luz y se evita la contaminación durante el uso No usar reactivos fuera de la fecha indicada .  Indicadores de deterioro de los reactivos: ∗ Presencia de partículas y turbidez ∗ Absorbancia (A) del blanco a 505nm ≥ 0,10 Preparación:  Reactivo

de trabajo (RT): Disolver (  ) el contenido de un vial de R2 Enzimas Enzimas en un frasco de R1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido (evitar la formación de espuma). *Estabilidad: 1 mes en nevera (2-8°C) o 7 días de temperatura temperatura ambiente (15-25°C). (15-25°C).

PROCEDIMIENTO 1. Condiciones del ensayo: Longitud de ondas……………………………………505n ondas……………………………………505nm m (490-550) Cubeta …………………………………………………1cm …………………………………………………1cm paso de luz Temperatura………………………………… Temperatura……………………………………………37°C/15-25°C …………37°C/15-25°C 2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. 3. Pipetear en una cubeta: Blanco Patrón Muestra 1,0 1,0 1,0 RT(ml) Patrón (µL) -10 ---10 Muestra( µL)





( A) Muestra ( A) Patrón

× 100(Conc. patrón ) = mg / dL De glucosa en la muestra

Factor de conversión: mg/dL x 0,0555= mmol/L

Control de Calidad: Es conveniente analizar junto con las las muestras sueros control valorados: SPINTROL SPINTROL H Normal y Patológico (Ref. (1002120 y 1002210).Si los valores hallados se encuentran fuera del rango de tolerancia, revisar el instrumento, los reactivos y el calibrador. Cada laboratorio debe de disponer su propio Control de Calidad y establecer correcciones en el caso de que los controles. Valores de referencia

Suero o plasma: 60 - 110 mg/dL =3,33-6.10mmol/L LCR: 60-80 % del valor de sangre *Estos valores son orientativos .Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

CARACTERISTICAS DEL METODO linealidad de 500 mg/dL. Si Rango de medida: Desde el límite de detección de 0,04 mg/dL hasta el límite de linealidad la concentración es superior al límite de linealidad, diluir la muestra 1:2 con NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado final por 2 Precisión:

Media (mg/dl) SD CV (%)

Interserie (n=20) 96.8 96.8 241 0.81 1.43 0.83 0.59

Interserie (n=20) 98.4 248 1.55 3.73 1.58 1.50

Sensibilidad analítica: 1mg/dL = 0,0036 A Exactitud: Los reactivos de SPINREACT (y) no muestran diferencias sistemáticas significativas cuando se

comparan con otros reactivos comerciales (x). Los resultados obtenidos con 50 muestras fueron las siguientes: ∗ Coeficiente de correlación (r):0,99. regresión: y = 1,0x + 0,12. ∗ Ecuación de la recta de regresión: ∗ Las características del método pueden variar según el analizador utilizado. Interferencias: No se han observado interferencias con: hemoglobina hasta 4 g/L, bilirrubina hasta 20 mg /L, creatinina hasta 100 mg /L, galactosa hasta 1 g /L. Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la determinación de la glucosa. Notas: 1. GLUCOSE CAL: Debido a la naturaleza del producto, es aconsejable tratarlo con sumo cuidado ya que se puede contaminar con facilidad. 2. La calibración con el Patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos .En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos. 3. Usar puntas de pipetas desechables limpias para su dispensación. 4. SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este reactivo en distintos analizadores.







Tabla de determinaciones en glucosa (total de resultados): Glucosa (mg/dl)

Sujeto

SILVIA MIRNA ITZEL JOSUE PACO BRAULIO DIANA Media Desviación estándar Coeficiente de variación

Determinación cuantitativa de glucosa

70.33 79.39 96.33 405.198 76.45 94.47 101.73 131.9854286 121.0310373 91.70030252

140 130

) l d 120 / g 110 m100 ( a 90 s o c 80 u l 70 G 60 50 SIL VI VIA

MIRNA

ITZ EL

JOSUE

PA CO CO

BRA ULIO

Sujeto Serie1 Serie1

Líne Línea a de tende tendenci ncia a

Con estos datos el coeficiente de variación es muy alto, lo que indica que los valores son muy dispersos y la linealidad de la recta se pierden con estos datos debido a que uno de los datos se sale de los parámetros, incluso realizando la gráfica de Levey-Jennings por lo cual se eliminará este dato y realizar de nuevo los parámetros estadísticos. Gráfica de Levey Jennings para determinación de glucosa 547.86 UCL

495.079

CL

131.985

447.86

347.86

247.86

l d / g m n 147.86 ó i c a r t n e 47.86 c n o C -52.14

-152.14 LCL

-231.108

-252.14

-352.14 1

2

3

4

5

6

sujetos



Tabla de determinaciones en glucosa (resultados con eliminación de un dato):

DETERMINACIÓN CUANTITATI CUANTITATIVA VA DE GLUCOSA 105

7

DIA NA NA







PACO BRAULIO DIANA

76.45 94.47 101.73

Media

86.45

Desviación estándar σ Coeficiente de variación

Grados de libertad (n -1) x+σ x-σ 2σ x - 2σ x + 2σ 3σ x + 3σ x - 3σ Intervalo de confianza para ± 2σ

12.68945389 14.6783735

5 99.13945389 73.76054611 25.37890778 61.07109222 111.8289078 38.06836167 124.5183617 48.38163833 61.08 - 111.83 (mg/dl)

Al haber eliminado el dato que se salía de los parámetros, el coeficiente de variación disminuyó en un 84%, dándonos un resultado del 14.68% y si tomamos ±2σ como valor de referencia al 95% de confianza en nuestros valores entonces los valores de confianza para nuestros datos serán de 61.08 – 111.83 ± 14.68%. Para observar el comportamiento de nuestros datos se realizó el gráfico de Levey-Jennings en el cual los datos se observan de la siguiente manera: Determinación cuantitativa de glucosa; Gráfica de Levey Jennings 135.65

125.65

UCL

124.52

115.65

105.65

l d / g m 95.65 s e n o i c 85.65 a r t n e

CL

86.45





6.- Rechace cuando las últimas 10 observac iones de control caigan en el mismo lado de la X. No reporte. *13s y R4s por lo regular son errores aleatorios. *22s, 41s y 10X son errores sistemáticos. Como se pude observar en el gráfico de Levey-Jennings realizado con nuestros datos y aplicando las reglas de Schewart, de los 6 datos solo 2 caen debajo de ± 1σ; es decir, quedan en el límite de ± 2σ, lo cual nos indica que tenemos un buen intervalo de confianza en nuestros datos. Aunque con un coeficiente de variación muy alto, esto posiblemente a que las determinaciones fueron muy pocas (sólo 6), cuando para métodos enzimáticos como el utilizado se acepta un CV de ± 10%, sin embargo como nuestros valores cayeron dentro del rango de ± 2σ, nuestros resultados entonces son aceptables ya que no violan ninguna de las reglas de Schewart . Pruebas de hipótesis:

Una hipótesis estadística es una proposición o supuesto sobre los parámetros de una o más poblaciones. Los procedimientos de prueba de hipótesis dependen del empleo de la información contenida en la muestra aleatoria de la población de interés. Si esta información es consistente con la hipótesis, se concluye que ésta es verdadera; sin embargo si esta in formación es inconsistente con la hipótesis, se concluye que esta es falsa. ∗ ∗

La hipótesis nula, representada por Ho, es la afirmación sobre una o más características de poblaciones que al inicio se supone cie rta (es decir, la "creencia a priori"). La hipótesis alternativa, representada por H1, es la afirmación contradictoria a H o, y ésta es la hipótesis del investigador.4

La hipótesis nula se rechaza en favor de la hipótesis alternativa, sólo si la e videncia muestral sugiere que H o es falsa. Si la muestra no contradice decididamente a H o, se continúa creyendo en la validez de la hipótesis nula. Entonces, las dos conclusiones posibles de un análisis por prueba de hipótesis son rechazar H o o no rechazar H o H 0 0 = 60 – 110mg/dl H 1 = 61.08 – 111.83 ± 14.68% ∗ ∗

Hipótesis Nula: H 0 = H 1 Hipótesis Alterna: H 0 ≠ H 1

Para determinar si la hipótesis nula es igual a los resultados de nuestros datos, se utilizará la fórmula de la t de student T de student

Sus aplicaciones en la inferencia estadística son para estimar y probar una media y una diferencia de medias (independiente y pareada). Características:





Z =

Donde:

X −

µ

σ

n

χ

2

=

S 2 (n −1) σ

2

Al sustituir en la fórmula X −

µ

σ

t =

X − µ

n σ

n ( X −

σ

2

S (n − 1)

n S

2

(n −1)

=

σ

µ )

σ

n ( X −

s

=

σ

s

= t =

Por lo tanto:

µ )

X − µ s n

con n = n-1 grados de libertad

Si se observa la tabla, el área sombreada de la curva es de la cola derecha, es por esto que se tiene que hacer la resta de 1 - α. La manera de encontrar el valor de t es buscar el valor de α en el primer renglón de la tabla y luego buscar los grados de libertad en la primer columna y donde se intercepten α y υ se obtendrá el valor de t. 6 Aplicación:

= 86.45 =n–1=6–1=5 σ = 12.69 del inserto ( µ) = 85 υ

t =

x − µ σ

n

=

86.45 − 85 = 0.203504758 12.69 5

Por lo tanto para σ la probabilidad acumulada es de 0.600, es decir: El valor t con υ = 5 grados de libertad que





CONCLUSIÓN Por medio de esta práctica, se lograron determinar en distintos individuos cuantitativa e individualmente la glucosa en suero por medio del Kit. spinreact especializado para esta finalidad con la técnica de espectrofotometría, en donde se realizó una reacción en la cual la glucosa del suero de la sangre fue oxidada a acido glucónico por medio del catalizador contenido en el reactivo R2 del kit que contenía glucosa oxidasa; esta reacción además de darnos como producto al acido glucónico, también nos dio peróxido de hidrógeno el cual fue el reactivo que fue determinado determinado en nuestra técnica (su producción) mediante el aceptor cromogénico de oxigeno, fenol-ampirona fenol-ampirona (contenido en el R1) en presencia de peroxidasa (enzima contenida en el R2) dándonos un color rojizo en la solución el cual era proporcional a la concentración de glucosa presente en el suero. En base a los a los datos obtenidos de las muestras de los sujetos a prueba y con los valores de referencia obtenidos, se puede decir que el 100% de nuestros sujetos de prueba (excepto el valor de 405.98 que fue eliminado para los fines de obtener nuestros valores de referencia; este valor pudo haber sido un error de tipo sistémico o aleatorio, o en su defecto algún problema de glicemia en el sujeto, por lo que para asegurarse de esto sería recomendable un nuevo análisis de la muestra del sujeto en cuestión), entran dentro de nuestros valores de referencia por lo que se puede decir que son sujetos sanos y que no tienen ningún problema de glicemia.

REFERENCIAS 1

http://www.saludalia.com/docs/ http://www.saludalia.com/docs/Salud/web_saludalia/pr Salud/web_saludalia/pruebas_diagnosticas/doc uebas_diagnosticas/doc/doc_glucosa.htm /doc_glucosa.htm http://www.tuotromedico.com http://www.tuotromedico.com/temas/glucosa_en /temas/glucosa_en_sangre.htm _sangre.htm Kaplan A. glucose. Kaplan A et al. Clin Chem The C.v. Mosby Co. St. Louis Toronto. Princeton 1984; 1032-1036 Trinder P. Ann Clin Biochem 1969; 6:24-33 Young DS. Effects on drugs on Clinical Lab. Tests, 4 th ed AACC Press, 1995 Young DS. Effects of disease on Clinical Lab. Tests, 4 th ed AACC 2001 Burtis A et al. Tietz Textbook of clinical chemistry, 3er ed AACC 1999 Tietz N W et al. Clinical Guide to laboratory Tests, 3er ed AACC 1995 3 http://www2.uah.es/ana_garcia/Hb http://www2.uah.es/ana_garcia/Hbs-glicosiladas.pdf s-glicosiladas.pdf 4 http://www.itchihuahua.edu.mx/ac http://www.itchihuahua.edu.mx/academic/industrial/est ademic/industrial/estadistica1/cap02.h adistica1/cap02.html tml 5 http://www.itchihuahuaii.edu.mx/a http://www.itchihuahuaii.edu.mx/academico/CB/MEG cademico/CB/MEG/documentos/1. /documentos/1.8.htm 8.htm 6 http://www.itch.edu.mx/acad http://www.itch.edu.mx/academic/industrial/est emic/industrial/estadistica1/cap03.ht adistica1/cap03.html ml 2

1.- Determinación Cuantitativa de Glucosa en suero

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