Uji HA dan HI ayam a yam pedaging
TITER ANTIBODI AYAM PEDAGING TERHADAP VIRUS N e w c a s t l e d i s e a s e (ND) (ND) DENGAN UJI HEMAGLUTINASI (HA) DAN UJI HAMBATAN HEMAGLUTINASI (HI)
SEMINAR
Oleh TRILIANI FARLISA NIM. 071810401081
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL 2010
METODOLOGI PENELITIAN 1.1 Tempat dan Waktu Kegiatan Kegiatan dilakukan di Laboratorium Dinas Peternakan, Perikanan dan Kelautan Jl. Letjend Suprapto No.139 Jember-Jawa Timur. Waktu pelaksanaan kegiatan yaitu tanggal 12 Juli 2010 s.d 14 Agustus 2010. 1.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada kegiatan ini meliputi sentrifuge, tabung reaksi ukuran 10 ml, vortek, besker glass ukuran 100 ml, tabung ukur ukuran 25 ml, spuit disposable ukuran 3 cc, kapas, pipet, dosbox, rak, mikroplate V, mikropipet, mikrotip, bunsen, mikrodiluter. Bahan yang digunakan pada kegiatan ini meliputi darah ayam pedaging dan ayam petelur berumur tiga bulan, larutan larutan Alsever’s, larutan PBS (pH 7,2), alkohol 70%, alumunium foil, antigen ND yang diproduksi PUSVETMA Surabaya. 1.3 Analisis Data 1.3.1 Uji HA Uji HA dinyatakan valid apabila:
1. 2. 3.
Setelah masa inkubasi selesai eritrosit pada sumuran 12 (kontrol) mengendap sempurna. Pada baris sumuran yang berisi kotrol suspensi virus/antigen positif terjadi aglutinasi eritrosit (tidak ada endapan aliran eritrosit). Pada baris sumuran yang berisi suspensi virus/antigen negatif tidak terjadi aglutinasi eritrosit (terdapat aliran eritrosit seperti yang terjadi pada sumuran 12). Titer antigen dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada eritrosit ayam pedaging dengan nomor tertinggi (end point ) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif yang ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur. Mikroplate sumuran A1-A2, maka dilihat:
-
Sumuran yang eritrosit mengalami hemaglutinasi= n Rumus, titer antigen = 2
n
Membandingkan titer antigen pada eritrosit ayam pedaging (broiler) dan ayam petelur Gallus sp. 1.3.2 Uji HI Angka pengenceran tertinggi dan terjadi hambatan aglutinasi terjadi secara sempurna terhadap antigen 4HA Unit. Aglutinasi dapat dibaca dengan menegakkan plate. Hanya sumuran yang mengalami stream pada waktu yang sama, dapat dinilai sebagai hambatan aglutinasi.
1.4 Cara Kerja 1.4.1 Pembuatan Sel Darah Merah/Eritrosit Ayam 1. Menyediakan masing-masing 1 ekor ayam pedaging dan ayam petelur yang berumur 3 bulan ke atas. 2. Menyediakan tiga buah spuit disposable ukuran 3 cc. Mengisi spuit disposable dengan larutan Alsever’s. 3. Mengambil darah ayam lewat vena brachialis dengan menggunakan spuit disposable yang telah berisi larutan Alsever’s dengan perbandingan 1:1. 4. Memindahkan campuran darah ayam dan larutan Alsever’s pada tabung reaksi. 5. Darah disentrifuge dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit, membuang supernatant. 6. Mengisi dengan larutan PBS pada tabung reaksi yang terdapat endapan eritrosit ayam, selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit, membuang supernatant. 7. Pencucian dilakukan dengan PBS pH 7,2 sebanyak tiga kali. Mengukur endapan eritrosit yang diperoleh dengan gelas ukur untuk mebuat stok eritrosit 10%. 8. Membuat stok eritrosit ayam konsentrasi 10%, jika endapan eritrosit ayam yang didapat sebanyak 1 ml, maka PBS yang ditambahkan sebanyak 9 ml. 9. Suspensi stok eritrosit ayam dengan konsentrasi 10% ini disimpan dalam lemari es.
1.4.2 Menyiapkan Eritrosit Ayam Konsentrasi 1% 1. Mengambil 1 bagian suspensi stok eritrosit ayam pedaging dan ayam petelur 10%. 2. Kemudian menambah 9 bagian PBS. Stock ini dipakai untuk pengujian HA. 1.4.3 Pengujian HA 1. Mengisi mikroplate V sumuran 1 s.d 12 dengan 0,025 ml PBS dengan menggunakan mikropipet. 2. Menambahkan 0,025 ml suspense virus/antigen ND yang diproduksi PUSVETMA Surabaya pada sumuran pertama. 3. Melakukan pengenceran kelipatan 0,025 (doubling dilution) suspense virus dari sumuran pertama sampai sumuran ke-11 dengan mikrodiluter, sedangkan sumuran ke-12 digunakan sebagai kontrol. 4. Menambahkan PBS 0,025 ml ke dalam masing-masing sumuran 1 s.d 12. 5. Menambahkan 0,025 ml suspensi stok eritrosit ayam 1% ke dalam sumuran 1 s.d 12.
6. Menggoyang mikroplate dengan membentuk angka delapan. 7. Mendiamkan pada suhu ruang (22-25 0C) selama 30-40 menit atau pada suhu 4 0 C selama 60 menit. 8. Mengamati ada atau tidaknya gumpalan darah yang dapat menjadi aliran sel darah merah (running botton/tear drop). 1.4.4 Pengujian HI 1. Mengisi mikroplate V sumuran 1 s.d 12 dengan 0,025 ml PBS denganmenggunakan mikropipet. 2. Menambahkan 0,025 ml serum kedalam sumuran pertama 3. Melakukan pengenceran kelipatan 0,025 (doubling dilution) suspense serum dari sumuran pertama sampai sumuran ke-11 dengan mikrodiluter, sedangkan sumuran ke-12 digunakan sebagai kontrol. 4. Menambahkan 0,025 ml antigen ND dengan hasil 4 HA Unit ke dalam tiap sumuran dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang ± 60 menit pada suhu 4˚C. 5. Menambahkan 0,025 ml sel darah merah 1% ke dalam tiap sumuran 6. Menggoyangkan plate secara perlahan (angka 8), dengan tujuan mencampurkan antigen dengan serum, inkubasi selama 40- 60 menit pada suhu ruang, hingga terbentuk mengendap sempurna pada sel darah merah kontrol. 7. Titer antibodi dapat dilihat dengan cara menegakkan plate dan mengamati ada tidaknya aliran sel darah merah pada sumuran. 8. Hasil yang didapat apabila pada sumuran mengalami stream pada waktu yang sama, sehingga dapat dinilai sebagai hambatan aglutinasi.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilakukan 3 kali pengujian. Sebelum pengujian, dilakukanpengambilan sampel darah ayam dilakukan 3 hari sekali dalam tiap minggu yang nantinya, akan digunakan sebagai sediaan untuk menguji serum ayam pedaging yang telah diberi vaksin ND sehingga dapat diketahui titer antibodi terhadap virus ND. Sampel darah merah yang digunakan harus murni sehingga membutuhkan darah ayam tanpa divaksin. Ayam yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ayam kampung, karena ayam ini belum mengalami vaksinasi. Hal ini dapat mempengaruhi hasil yang dilakukan. Pengambilan sampel darah ayam melalui vena brachialis karena pada vena sayap terdapat percabangan vena sehingga aliran darah pada daerah tersebut menyatu yang memudahkan dalam pengambilan darah. Pada pengambilan darah ayam menggunakan spuit disposable 3cc sebelumnya diisi larutan Alsever’s yang berfungsi sebagai antikoagulan dalam darah (Bappenas, 2007). Pencucian eritrosit dilakukan tiga kali dengan menggunakan larutan PBS ph 7,2, larutan ini digunakan sebagai pencuci eritrosit, selain PBS larutan yang digunakan dan memiliki fungsi yang sama yaitu NaCl fisiologis. Penggunaan larutan PBS pH 7,2 ini agar eritrosit tidak mengalami difusi osmosis. Apabila eritrosit mengalami difusi dapat mengakibatkan lisis pada sel darah. Apabila eritrosit mengalami osmosis dapat mengakibatkan krenasi pada sel darah. Sehingga larutan PBS dan NaCl dapat digunakan sebagai larutan isotonis pada eritrosit. Selanjutnya eritrosit dibuat sediaan 10% yaitu 1ml eritrosit diencerkan menggunakan larutan PBS 9 ml. Apabila akan digunakan uji serologis untuk mengetahui titer antibodi ayam pedaging, eritrosit yang digunakan 1% yaitu sediaan larutan eritrosit 10% diambil 1ml selanjutnya ditambahkan 9 ml larutan PBS. Pengenceran ini
dilakukan agar eritrosit tidak terlalu pekat agar antigen dapat mengikat dan mengaglutinasi eritrosit. Uji HA dan HI selain digunakan untuk mendeteksi titer antibodi, untuk mengidentifikasi virus. Serum yang digunakan pada pengujian ini dari ayam pedaging. Serum merupakan (bagian dari komponen darah yang didalamnya terdapat antibodi). Serum berupa cairan tubuh (bagian dari plasma darah) yang memilki kekebalan terhadap adanya penyakit yang masuk kedalam tubuh dan berwarna kuning jernih, Pada serum ayam pedagingterkandung vaksin ND, sehingga dapat diketahui titer antibodi yang dimiliki oleh ayam pedaging dapat diukur dengan pengujian HI. Serum disimpan pada suhu -20 °C atau-28°C, namun serum mampu bertahan selama 3-5 hari. Pengujian pertama yaitu uji HA (Haemaglutinasi), dengan antigen yang digunakan ND, antigen ini memiliki kemampuan yang dapat mengikat (mengaglutinasi) sel darah merah pada unggas ataupun mamalia. Pada uji HA terdapat uji secara kualitatif dan kuantitatif. Pada uji HA kualitatif digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya virus, eritrosit yang digunakan 5%. Pada uji HA kuantitatif salah satu uji yang digunakan untuk mengukur titer antigen yang selanjutnya digunakan untuk uji HI, dengan menggunakan mikroplate 96. Setelah mengetahui titer antigen, langkah selanjutnya menentukan 4 HA Unit. Apabila telah mendapatkan hasil 4 HAU, maka langkah selanjutnya dapat dilakukan untuk membuat titer antigen stock sehingga dapat digunakan untuk uji HI, dengan menggunakan serum yang berbeda.
22
Rumus 4HA Unit: 2n
Keterangan: n= titer antigen Contoh: titer antigen stok 256 HAU 63 ml larutan PBS/NaCl .
256/4= 64, artinya,1 ml vol Antigen ND+
Table 3. Hasil pengujian HA dan HI ayam pedaging terhadap virus ND No. Hari dan Tanggal Uji HA (ND) Uji HI Uji 1.
2.
Senin, 26 Juli 2010 (pengujian 1)
Kamis, 29 Juli 2010 (pengujian 2)
(Menggunakan PBS) 29= 512 4HA Unit 27= 128
(menggunakan NaCl fisologis) 24= 16 24= 16 4 HA Unit 2 2= 4 (menggunakan PBS)
3.
Kamis, 05 Agustus 2010 (pengujian 3)
27= 128 25= 32 4 HA Unit 2 3= 8
Titer antibodi 26= 64 Titer antibodi 27= 128 Titer antibodi 28= 256
Titer antibodi 24= 16 Titer antibodi 23= 8
Titer antibodi 27= 128 Titer antibodi 24= 16 Titer antibodi 21= 2
Hasil dari pengujian yang pertama, pada uji HA Gambar 3.1 yang terjadi pada sumuran A ke-9 sehingga titer antigen yang didapatkan 2 9= 512. Pada uji selanjutnya Uji HI titer antigen yang digunakan adalah 4 HA Unit, angka pengencerannya 2 7= 128, artinya, 1 ml antigen ND ditambahkan dengan 127 ml PBS. Pada hasil uji HI gambar 3.2 diperoleh pada sumuran A ke-8 dengan titer antibodi (28= 256), sumuran B ke-7 dengan titer antibodi (2 7= 128) dan sumuran C ke-6 dengan titer antibodi (26= 64).
Gambar 3.1 Hasil titer antigen pada sumuran A ke-9 (2 = 512) 9
Gambar 3.2 Hasil titer antibodi pada sumuran A ke-8 (2 8= 256), sumuran B ke-7(2 7 = 128) dan sumuran ke-6 (2 6 = 64) Pengujian ke-2 pada uji HA gambar 3.3 yang terjadi pada sumuran A ke-4 sehingga titer antigen (24= 16) dan sumuran B ke-4 sehingga titer antigen (2 4= 16). Pada uji selanjutnya Uji HI titer antigen yang digunakan adalah 4 HA Unit, angka pengencerannya 22= 4 artinya, 1 ml antigen ND, namun ditambahkan dengan 3 ml NaCl fisiologis. Pada hasil uji HI gambar 3.4 diperoleh pada sumuran A ke-8 dengan titer antibodi (2 8= 256), sumuran B ke-7 dengan titer antibodi (2 7= 128) dan sumuran dengan C ke-6 titer antibodi (2 6= 64).
Gambar 3.3 Hasil titer antigen pada sumuran A ke-4 (2 = 16) dan sumuran B ke-4 (2 4=16) 4
Gambar 3.4 Hasil titer antibodi pada sumuran A ke-3 (2 3= 8) dan sumuran B ke-4 (24= 16) Pengujian ke-2 pada uji HA gambar 3.5 yang terjadi pada sumuran A ke-7 sehingga titer antigen (27= 128) dan sumuran B ke-5 sehingga titer antigen (2 5 32). Pada uji selanjutnya Uji HI titer antigen yang digunakan adalah 4 HA Unit 2 5= 32, angka pengencerannya 23= 8, artinya, 1 ml antigen ND, ditambahkan dengan 7 ml larutan PBS. Pada hasil uji HI gambar 3.6 diperoleh pada sumuran A ke-7 dengan titer antibodi (2 7= 128), sumuran B ke-4 dengan titer antibodi (2 4= 16) dan sumuran dengan C ke-1 titer antibodi (2 1= 2).
Gambar 3.5 Hasil titer antigen pada sumuran A ke-7 (2 = 128) dan sumuran B ke-5 (2 5=32) 7
Gambar 3.6 Hasil titer antibodi pada sumuran A ke-7 (2 7 = 128), sumuran B ke-4(2 4= 16) dan sumuran ke-1 (2 1= 2)
Pada pembuatan sediaan antigen 4 HAU diharapkan tiap kali akan uji selalu dibuat karena sediaan ini tidak stabil. Uji A terjadi endapan karena antigen mengikat eritrosit sehingga tidak terjadi endapan. Setiap sediaan antigen 4 HAU dapat digunakan maksimal 8 serum. Pada hasil uji HI yang terjadi sesuai dengan prinsip HI karena aglutinasi sel darah merah oleh antigen ND dapat dihambat dengan adanya antibodi spesifik terhadap virus, sehingga eritrositnya bebas dan hasil yang didapatkan berupa endapan sehingga memperoleh titer antibodi. Ayam memiliki sistem pertahanan didalam tubuhnya yang cukup berkembang sehingga ayam sangat responsive terhadap virus yang memaparnya. Sehingga uji ini perlu digunakan unuk mengetahui titer antibody yang berfungsi sebagai sistem imun atau pertahanan dalam tubuh ayam pedaging. Ayam memilki sensivitas yang sangat tinggi terhadap adanya protein asing, sehingga meskipun pemberian vaksin yang sedikit maka akan memberikan respon pembentukan antibodi. Hal ini dikarenakan ayam khususnya ayam pedaging terdapat kelenjar Harederian yang terletak di daerah nasotrakheal dan Bursa Fabricius yang memungkinkan unggas atau ayam sangat responsive terhadap adanya protein asing (Wibawan et al ., 2009). Hasil diatas telah terlihat pada pengujian HI yang digunakan pada penelitian ini menggunakan serum dari ayam pedaging yang berbeda. Hasil titer antibodi yang didapat memilki respon yang berbeda dan memiliki titer antibody yang berbeda pula pada setiap unggas (Bocah, 2009). http://triliani.blogspot.com/2011/03/uji-ha-dan-hi-ayam-pedaging.html
