LAPORAN VIROLOGI
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS PADA ENTOK (C ai r i na mo moschata schata)
Oleh: Lufna MelindaTandiayuk, SKH
B04164133
PPDH ANGKATAN I TAHUN 2016/2017 KELOMPOK C1
Dosen Pembimbing: Dr. Drh. Okti Nadia P., Msi., MSc.
PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2017
PENDAHULUAN Latar Belakang
Dewasa ini, permintaan akan protein hewani terus meningkat sejalan dengan pertumbuhan penduduk di Indonesia. Unggas merupakan salah satu ternak alternatif dalam pemenuhan protein hewani. Entok atau itik manila merupakan unggas air penghasil daging. Akan tetapi keberadaan entok sebagai salah satu komoditas unggas konsumsi masih belum populer di masyarakat. Entok atau muscovy duck adalah unggas air yang termasuk dalam keluarga atau genus Cairina (Cairina moschata) berasal dari Meksiko, Amerika Tengah dan Amerika Selatan. Berikut merupakan taksonomi entok menurut Rose (1997): Kingdom Subkingdom Filum Subfilum Kelas Ordo Famili Genus Species
: Animalia : Metazoa : Chordata : Vertebrata : Aves : Anseriformisales : Anatidaceae : Cairina : C. moschata
Kandungan gizi dari unggas air : itik, entog dan mandalung tidak kalah dibanding ternak lain, sehingga dapat dijadikan sebagai produk alternatif pe ngganti daging sapi maupun ayam yang telah populer sebelumnya (Damayanti 2006). Populasi entok mengalami peningkatan setiap tahunnya di Indonesia. Pada tahun 2015, populasi entok sebesar 7.97 dan meningkat pada tahun 2016 sebesar 8.26 j uta (Deptan 2016). Penyakit merupakan salah satu masalah utama bagi para pengusaha perunggasan. Tidak sedikit pengusaha yang harus gulung tikar akibat serangan penyakit. Beberapa penyakit yang sering menyerang unggas adalah New Castel Disease (ND)/ tetelo, Avian influenza (AI), Infeksius Bronkhitis (IB), Infeksius Bursal Disease (IBD)/ gumboro, coryza atau snot , koksidiosis, salmonellosis, dan penyakit unggas lainnya. Avian Influenza (AI) merupakan penyakit yang sangat penting dalam sektor perunggasan. AI dapat menyebabkan kematian unggas secara tiba – tiba dalam jumlah yang besar. AI diklasifikasikan ke dalam Famili Orthomyxoviridae, genus Influenzavirus A. Avian infleunza pertama kali dilaporkan pada tahun 1878 seba gai wabah yang menyerang ayam dan burung di Italia. Centanini dan Savonucci berhasil mengidentifikasi penyebab penyakit pada ta hun 1901, sedangkan ciri dari virus influenza tipe A baru dapat dijelaskan pada tahun 1955 oleh Schafer (Saif et al. 2008).
Infectious bronchitis (IB) juga merupakan yang penting dalam sektor peternakan unggas. Penyakit IB, disebut juga Avian Infectious Bronchitis Organisme yang tergolong kedalam virus RNA utas tunggal dan famili dari Coronaviridae (Jordan 1990). Menurut Swayne et al . (2013), Kasus IB pada ayam dewasa dicirikan dengan tingkat produksi telur menurun yang diikuti dengan penurunan kualitas telur yakni kerambang menjadi pucat karena penurunan pigmen, lembek, dan aspek tidak rata. Hal ini sangat berpengaruh terhadap perekonomian karena menyebabkan penurunan produksi dan kualitas telur. Isolasi dan propagasi virus pada telur ayam berembrio masih merupakan gold standard untuk mengisolasi AI dan IB, karena hasilnya yang akurat namun metode tersebut memerlukan waktu yang cukup lama. Uji Haemaglutinasi (HA test ) dan Uji Haemaglutinasi Inhibition (HI test ) masih merupakan gold standard untuk identifikasi virus AI dan ND (virus yang dapat mengaglutinasikan sel darah). Agar Gel Precipitation Test (AGPT) merupakan uji lanjutan untuk identifikasi virus khusnya virus yang tidak mampu mengaglutinasikan sel darah.
Tujuan Mengetahui jenis virus yang menginveksi entok dengan cara isolasi dan identifikasi virus. TINJAUAN KASUS Anamnesa
Hewan yang digunakan adalah entok yang merupakan ternak warga di daerah Cibeurum. Entok yang diperiksa terlihat sehat dan tidak memperlihatkan gejala klinis apapun. Entok dipelihara dengan cara diumbar bersamaan dengan unggas air lainnya yaitu angsa. Entok juga dipelihara bersamaan dengan hewan lainnya yaitu, ayam kampung, domba, dan beberapa burung hias. Menurut pemilik entok, semua ternak yang dimiliki tidak perna dilakukan vaksinasi. Pada lokasi pemeliharaan entok disediakan sebuah kolam sebagai tempat entok untuk berenang. Tidak terdapat batas yang jelas antara lingkungan sekitar dan tempat entok diumbar, sehingga kemungkinan entok untuk berinteraksi dengan lingkungan sekelilingnya sangat luas. Berikut Signalement Entok: Nama : Ento Jenis Hewan : Entok Jenis Kelamin : Jantan Umur : ± 1,5 tahun Warna bulu : Hitam-putih Tanda Khusus : -
METODOLOGI Pengambilan Sampel
Sampel diambil dari kloaka entok dengan cara swabbing menggunakan cotton bud . Selanjutnya cotton bud dimasukan ke media BHI kemudian ditambahkan antibiotik penicillin streptomycin 10000 IU/ml inokulum. Pengambilan sampel juga perlu disertai dengan recording . Recording berisi keterangan jenis hewan, jenis kelamin, umur, nama pemilik, riwayat penyakit (tanggal mulai sakit, gejala klinis, jumlah penderita), diagnosa klinis, jenis material yang dikirim, vaksinasi (tanggal vaksinasi, jenis vaksin), kontak dengan hewan/vektor, dan riwayat pengobatan. Waktu dan Tempat
Pengambilan sampel dilakukan di kandang warga di daerah Cibeurum pada tanggal 24 Januari 2017. Pengujian sampel swab kloaka entok. Isolat virus dilakukan di Laboratorium Riset, Rumah Sakit Hewan Pendidikan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor pada tanggal 31 Januari – 1 Februari 2017. Metode Pembuatan NaCl 0,85%
Garam NaCl, aquadestilata, timbangan, gelas ukur dan botol erlenmeyer disiapkan. Untuk membuat 1 liter NaCl fisiologis 0,85%, 8.5 gram garam NaCl ditimbang lalu masukan ke dalam botol erlenmeyer berukuran 1 liter lalu diisi dengan aquadest sampai 1 liter kemudian diaduk hingga semua garam terlarut. Selanjutnya NaCl fisologis disteriliasi menggunakan autoclav (suhu 121 OC selama 15 menit) sebelum digunakan. Pembuatan Na-sitrat 3,8%
Garam Na-sitrat, aquadest, timbangan, gelas ukur dan botol erlenmeyer disiapkan. Untuk membuat 100 ml Na-citrat 3.8%, 3.8 gram garam Na-sitrat ditimbang dan dimasukan ke dalam botol erlenmeyer berukuran 100 ml lalu diisi dengan aquadest sampai 100 ml kemudian diaduk hingga semua garam terlarut. Selanjutnya NaCl fisologis disteriliasi menggunakan autoclav (suhu 121 OC selama 15 menit) sebelum digunakan. Perhitungan Dosis Antibiotik
Dosis antibiotik yang digunakan untuk media transport sampel adalah sebasar 10.000 IU/ml, untuk perhitungannya sebagai berikut. 10.000 200.000
× 0,8mL = 0.04 mL
Pengambilan Sampel Swab Kloaka
Sampel yang diambil merupakan sampel usapan kloaka. Cotton bud dimasukan ke kloaka dan diusapkan ke dinding kloaka. Usapan kloaka dan trakea dilakukan sebanyak 2-3x. Hasil usapan kloaka dan trakea dimasukkan ke dalam microtube yang berisi BHI dan antibiotik (Penisilin 10.000 IU/mL dan Streptomicin 10 000 µl/mL) sebanyak 1 ml. Mikrotube dimasukkan ke dalam coolbox dan dibawa ke laboratorium. Setelah sampai di laboratorium, sampel dimasukkan ke dalam freezer sebelum diinokulasikan ke telur ayam bertunas (TAB). Selanjutnya sampel disimpan dalam suhu 4 oC selama 4 hari namun bila ingin disimpan dalam jangka waktu yang lama maka disimpan pada suhu -80 oC (OIE 2011). Pengambilan Sampel Serum Serum merupakan salah satu bahan uji yang banyak digunakan pada identifikasi virus. Serum juga salah satu specimen uji untuk mendiagnosa penyakit yang menyerang hewan. Adapun beberapa alat dan bahan yang dibutuhkan yaitu, tabung standart 10 ml , Syring 3 ml/ syring 1 ml, Kapas beralkohol, dan Kapas t anpa alkohol. Ambil darah dari hewan contoh melalui vena brachialis (vena sayap) pada unggas atau jantung pada ayam DOC menggunakan syryng steril. Buka jarum syring dan masukan darah ke dalam tabung reaksi atau syryng diletakkan secara horizontal. Biarkan darah dalam suhu ruang hingga membeku, kemudian simpan darah beku tersebut dalam lemari pendingin ( suhu 4 oC) semalam atau dilakukan sentrifugasi maka akan diperoleh cairan bening berwarna kekuningan. Cairan tersebut adalah serum, pisahkan serum dari darah dan simpan pada suhu -20 4 oC sampai saat akan digunakan. Pembuatan Suspensi RBC
Suspensi sel darah merah unggas digunakan untuk uji titrasi dan identifikasi virus. Konsentrasi suspensi RBC yang digunakan adalah 5% dan 1%. Bahan yang diperlukan adalah ayam dalam kondisi sehat dan cukup ukurannya , Na-sitrat 3,8% steril, dan NaCl fisiologis steril. Alat yang diperlukan adalah tabung standar 10 ml, pipet pasteur, sentrifuse , syringe 3 ml, kapas beralkohol, dan kapas tanpa alkohol. Darah ayam diambil melalui vena brachialis (vena sayap) setelah daerah bagian yang akan diambil darahnya dihapushamakan menggunakan kapas beralkohol. Syringe yang digunakan adalah 3 mL. Kedalam syringe diambil 0.5 mL larutan Na Citrat, dengan harapan darah yang diambil sebanyak 2 mL (Na-citrat dan darah adalah 1 : 4). Sentrifuse dilakukan pada darah utuh ( whole blood ) dengan kecepatan 1000-1500 G selama 10 menit, kemudian dibuang supernatannya, endapan yang merupakan sel darah merah dicuci/dibilas dengan menambahkan NaCl fisiologis dengan volume sebanyak dua kali supernatan yang dibuang atau empat kali volume sel darah merah. Suspensi tersebut kemudian dihomogenkan dan dilakukan sentrifuse kembali dengan kecepatan 1000-1500 G selama 10 menit (langkah ini disebut pencucian sel darah merah). Langkah ini diulangi sampai dua kali. Pada pencucian ketiga supernatan dibuang sehingga didapatkan suspensi sel darah merah 100%.
RBC 5% dan 1 %
Suspensi darah 100% yang diperoleh dibuat menjadi 5% untuk penyimpanan RBC. Volume RBS 100% diukur kemudian diencerkan dengan NaCl fisiologis 0,85% dengan perbandingan 1 : 19. 1 bagian RBC 100% dengan 19 bagian NaCl fisiologis 0,85%. RBC 5% dapat disimpan 1- 3 hari atau sampai darah lisis. Untuk menentukan RBC masih dapat digunakan (tidak lisis) dapat dili hat dari bagian supernatan. Apabila bagian supernatan telah berwarna merah, maka RBC tidak dapat digunakan lagi sebab telah lisis. Darah lisis dapat mengganggu dalam pembacaan hasil uji, sehingga harus dibuat sediaan RBC yang baru. RBC 5% dibuat menjadi 1% untuk keperluan uji haemaglutination test (HA Test ) dan haemaglutination inhibition test (HI Test ). Pembuatan RBC 1% dari RBC 5% adalah dengan mengencerkan RBC 5% dengan NaCl fisiologis pada perbandingan 1 : 4. 1 bagian RBC 5% dengan 4 bagian NaCl fisiologis 0,85%. Tahapan membuat RBC 5% dilakukan rumus: RBC
100
5
1 ml RBC 1 : 9
5 NaCl 0,85%
0
95
19 ml NaCl 0.85%
Tahapan membuat RBC 1% dilakukan rumus: RBC
5
1
1 ml RBC
4
4 ml NaCl 0.85%
1 NaCl 0,85%
0
1
: 4
Inokulasi Sampel
Telur ayam berembrio (TAB)/ Telur Embryo Tertunas (TET) yang digunakan harus berasal dari breeding flock yang bebas patogen tertentu ( spesific pathogen free/ SPF) atau minimal menggunakan telur spesific antibody negative (SAN). Telur yang digunakan diinkubasikan pada suhu 37-38 °C dan kelembaban relatif 60-70 %. Sebelum diinokulasi telur diperiksa dengan teropong ( candling ) untuk mengetahui kondisi telur, menandai kantong udara dan pembuluh darah, serta memastikan tidak adanya kelainan. Kelainan yang terjadi misalnya tidak adanya kantung udara, infertile (tidak dibuahi), embrio lemah atau mati. Sebelum diinokulasi, telur-telur yang akan digunakan terlebih dahulu disterilkan menggunakan alkohol 70% pada daerah yang hendak diinokulasi. Kemudian telur dibuat lubang menggunakan bor tepat dibagian kantong udara diatas kepala embrio (rute inokulasi ruang alantois). Syringe yang digunakan sebaiknya berukuran 1 ml, dengan jarum ukuran No. 25 gauge. Umumnya dosis
inokulasi tiap telur adalah 0.1-0.2 ml. Setelah inokulasi, lubang tempat inokulasi ditutup dengan isolasi. Setelah ditutup, telur-telur tersebut dieramkan dalam inkubator 37-38 °C dan amati tiap hari sampai hari ke tiga. Telur yang tidak mati dimatikan pada hari ke tiga. Telur dimatikan dengan cara dimasukkan kedalam refrigerator .
Gambar 1 Inokulasi virus dengan rute ruang alantois (Siregar 1988)
Panen Hasil Inokulasi Sampel
Telur TAB yang telah dieramkan selama 3 hari di dalam inkubator diletakan dengan posisi kantong udara di atas dan dibuka dari kantong udara. Cairan alantois disedot dengan syringe 3 ml dengan hati-hati agar tidak merusak dan menyedot kuning telur. Panenan cairan allantois kemudian di sentrifugasi dingin untuk memurnikan hasil panenan sehingga bagian kuning telur yang ikut dalam pemanena dapat dipisahkan dan didapatkan cairan allantois murni. Cairan alantois yang didapat dimasukan ke dalam microtubej steril dan diberi label lengkap. Selanjutnya cairan alantois siap diuji agltinasi cepat, HA, HI, dan AGPT. Pengujian Rapid Agglutination Test
Bahan dan alat yang digunakan untuk rapid test adalah virus hasil panen dari ruang allantois, suspensi sel darah merah ayam 5 %, gelas obyek dan tusuk gigi. Gelas obyek yang bersih dan bebas lemak disiapkan kemudian diteteskan suspensi RBC 5% dan ditambahkan setetes cairan allantois. Campuran virus tesebut kemudian diaduk dengan tusuk gigi lalu dibiarkan sesaat dan diamati terjadinya aglutinasi. Sebagai kontrol positif suspensi RBC 5% diteteskan dan setetes s uspensi virus ND atau AI, serta kontrol negatif suspensi RBC 5% diteteskan dan setetes NaCl Fisiologis 0.85%. Diaduk dan diamati bentuk larutan yang teraglutinasi. Hasil uji positif dapat dilanjutkan dengan uji haemaglutinasi (HA test ) untuk mengetahui titer virus yang diperoleh.
H aemagglutination Assay Test (HA Test ) Micro titrasi Sebanyak 25 µl NaCl dimasukkan ke sumur microplate berbentuk V (V bottom microplate) baris pada A−F, kolom 2−12. Kemudian antigen virus dimasukkan ke dalam sumur A1−E1 sebanyak 50 µl. Tambahkan sebanyak 25 µl
NaCl dimasukkan ke dalam sumur B2, 75 µl NaCl dimasukkan ke dalam sumur C2, 125 µl NaCl dipipet ke dalam sumur D2, dan 175 µl NaCl dipipet ke dalam sumur E2. Antigen virus sebanyak 25 µl dipindahkan dari sumur A1−E1 ke dalam sumur A2−E2 menggunakan pipet multichannel dan dihomogenkan 10 kali dengan memipet naik turun. Selanjutnya dari sumur A2-E2 dipindahkan 25 µl ke sumur A3-E3. Langk ah ini diulangi hingga kolom A12−E12. Setelah dihomogenkan 10 kali, dari A12−E12 dibuang 25 µl suspensi. Selanjutnya 25 µl NaCl dan 25 µl RBC 1% dimasukkan ke dalam setiap sumur. Sumur F1 – F12 merupakan kontrol negatif dan sumur A1-E1 sebagai kontrol positif adanya aglutinasi. Microplate di kocok selama 10 detik. Kemudian diinkubasi selama 60 menit pada suhu 4°C. Hasil diamati setelah sumur kontrol positif terlihat adanya reaksi penghambatan aglutinasi dengan memiringkan microplate (OIE 2012).
H aemagglutination I nhibition Test (H I Test) Mi cro titrasi Sebanyak 25 µl NaCl dimasukkan ke dalam sumur microplate A1-A12 dan B1-B12 berbentuk V (V bottom microplate), kemudian 25 µl sampel serum dimasukkan ke dalam lubang pertama (A1 dan B1) dan dilakukan pengenceran menggunakan mikro pipet dengan menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 10 kali sampai sumur ke 10, lalu 25 µl pada sumur ke-10 dibuang. Sebanyak 25 µl suspensi virus standar ND dimasukkan ke dalam sumur A1 – A10, A12 dan virus standar AI dimasukkan ke dalam sumur B1 – B10, B12 lalu dihomogenkan. Sumur dan di inkubasi pada suhu 4°C. Setelah 60 menit ditambahkan RBC 1% sebanyak 25 µl kedalam seluruh sumur. Sumur A11 dan B11 hanya berisi RBC 1% dan NaCl Fisiologis 0.85% sebagai kontrol positif dan sumur A12 dan B12 sebagai kontrol negatif. Microplate digoyang selama 10 detik agar larutan homogen dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 60 menit. Uji AGPT ( Agar Gel Precipitation Test )
Bahan yang perlu dipersiapkan yaitu agarose 1 %, Sodium azide 0,001 gr , PBS 2,5 mL, dan Aquades 2,5 mL. Bahan-bahan dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer dan dipanaskan hingga larut, yang menyebabkan cairan menjadi bening. Setelah itu menyiapkan 10 buah objek gelas yang sudah dibersihkan atau steril. Kemudian meneteskan bahan-bahan AGPT sebanyak 4 mL pada masing-masing gelas objek dan ditunggu hingga agarose mengeras. Setelah mengeras dilakukan pelubangan dengan menggunakan punhcher. Sisa pembuatan lubang kemudian dibuang. Pada bagian lubang tengah dimasukkan antibodi standar AI/IB/ND sebanyak 20-25 µL dan pada lubang pinggir dimasukkan antigen yang duji yang berasal dari cairan allantois. Setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu ruang selama 24-72 jam. Prinsip pengujian AGPT yaitu pembentukan ikatan antara antigen dan antibodi yang akan terlihat membentuk garis.
Antigen yang diuji Antibody standar Gambar 2 Skema pengujian AGPT
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel serum yang diperoleh dilakukan pengujian terhadap keberadaan antibodi AI dan ND. Uji yang digunakan adalah haemagglutination inhibition test . Sampel serum diencerkan dan direaksikan dengan antigen AI dan ND yang telah diketahui. Hasil uji yang dilakukan diperoleh adanya titer antibodi AI sebesar 2 HAU dan 4 HAU antibodi ND. Titter yang diperoleh sangat kecil sehingga kemungkinan antibodi yang terdeteksi berasal dari infeksi yang sudah lama atau baru saja terinfeksi sehingga pembentukan antibodi belum sempurna. ND AI
Gambar 3 hasil uji haemagglutination inhibition sampel serum. + menandakan terjadi aglutinasi. Telur Embryo Tertunas yang digunakan ada 3 butir, 2 butir telur yang diinokulasikan suspensi virus, dan 1 butir merupakan kontrol. Kedua telur diinokulasi dengan inokulum yang sama. Kedua telur mati pada 24 jam post inokulasi dan telur tidak berbau atau busuk yang menandakan kematian bukan oleh infeksi sekunder (bakteri). Kematian yang cepat pada embrio dapat disebabkan oleh keganansan tipe virus. Hasil yang didapat dari inokulasi suspensi virus terhadap TET tidak hanya menghasilkan cairan alantois, melainkan dapat diamati perubahan embryo pada TET yang diinokulasi dengan TET kontrol sebagai perbandingannya. Embrio t elur 1 dan 2 terlihat adanya pendarahan diseluruh tubuh embrio dan adanya penggumpalan pada beberapa bagian kuning telur dibandingkan dengan embrio kontrol. Ukuran embrio dari telur 1 dan 2 tidak dapat dibandingkan dengan kontrol sebab ukuran telur kontrol yang digunakan lebih kecil dari telur yang diinokulasikan meskipun umur kedua telur sama. Menurut Putra et al. (2012), beberapa penyakit ayam yang dapat menyebabkan kematian embrio ayam antara lain virus avian influenza (AI), virus infectious bronchitis (IB), virus infectious laryngotracheitis (ILT),dan virus infectious bursal disease (IBD). Telur ayam berembrio yang diiokulasi dengan virus AI dapat menyebabkan kematian embrio selama 18-24 jam pasca inokulasi.
Untuk telur ayam berembrio yang diinokulasi oleh virus IB, embrio akan bertahan sampai 90% terhadap infeksi virus ini sampai 19 hari pasca inokulasi. Inokulasi telur bayam berembrio dengan virus ILT, embrio akan mati pada 2-12 hari pasca pasca inokulasi. Untuk virus IBD yang diinokulasikan pada telur ayam berembrio akan menyebabkan kematian pada 3-5 hari pasca inokulasi.
Embrio 1
Kontrol
Embrio 2
Gambar 4 embrio dari telur yang telah diinokulasi dan kontrol (tidak diinokulasi). Metode uji laboratorium yang digunakan untuk mendiagnosa keberadaan virus dari panen cairan allantois adalah rapid agglutination test, uji HA, dan HI. Uji ini dilakukan untuk melihat keberadaan virus yang dapat mengaglutinasikan sel darah merah. Beberapa virus memiliki sifat dapat mengaglutinasi sel darah merah. Kemampuan ini merupakan aktivitas biologik yang dapat dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak (Merchant dan Parker 1994). Virus yang terdeteksi oleh uji HA adalah virus yang dapat mengaglutinasi sel darah merah. Hemaglutinasi biasanya disebabkan oleh virion itu sendiri (partikel virus keseluruhan), namun ada juga yang disebabkan oleh hemaglutinin yang dihasilkan selama pembiakan virusnya. Virus dapat mengaglutinasi sel darah merah karena mempunyai protein hemaglutinin pada permukaanya. Hemaglutinin secara spontan akan melekat, sehingga membentuk sebuah jembatan antara dua sel darah merah. Virus yang memiliki kemampuan mengaglutinasi sel darah merah diantaranya virus Dengue Hemmorhagic Fever (DHF), Penyakit Mulut dan Kuku (PMK), rabies, pox, Virus AI, dan ND sedangkan virus-virus yang tidak dapat mengaglutinasi sel darah merah antara lain IB dan Infectious Laryngo-Tracheitis (ILT). Cairan allantois yang telah murni kemudian diuji dengan rapid agglutination. Hasil rapid agglutination test terlihat negatif. Hasil negatif dari rapid agglutination test belum dapat dipastikan negatif. Hasil negatif palsu dapat terjadi akibat titer virus yang ada sangat kecil sehingga tidak dapat mengagglutinasikan semua sel darah dan terlihat negatif secara kasat mata. Untuk pengujian lebih lanjut dilakukan pengukuran titer virus dengan haemagglutination assay test . Uji HA ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi virus dan untuk mengetahui titer virus dari suatu sampel (Wibowo et al. 2013). Titer virus dapat diketahui dengan melihat sumur
terakhir pada pengenceran tertinggi (end point ) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif dan ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur. Hasil HA test memberikan hasil titer virus 4 HAU/25 µl cairan allantois. Keberhasilan dari uji HA menandakan adanya kemampuan virus untuk mengagglutinasikan sel darah. Virus yang menyerang unggas yang mampu mengagglutinasikan sel darah diantaranya adalah AI dan ND. Untuk membedakan virus AI dan ND dilakukan uji lanjutan yaitu haemagglutination inhibition test. Haemagglutination inhibition test dilakuan dengan mereaksikan serum standar yang telah diketahui (AI dan ND) dengan antigen (cairan allantois). Apabila terjadi penghambatan agglutinasi menandakan adanya ikatan antigen-antibodi. HI test tidak sempat dilakukan akibat beberapa jam setelah pemanenan titer virus pada cairan allantois menurun (dibawah 4 HAU). Penurunan titer diketahui dengan pengujian HA test kembali sebelum HI untuk memastikan kembali titer virus yang ada. Titer virus 4 HAU tidak dapat digunakan dalam uji HI sebab hasil yang diperoleh dapat menjadi bias. Penurunan titer virus dapat disebabkan sewaktu pemanenan virus bagian cairan allantois tercampur dengan bagian telur yang lain dan tidak langsung dimurnikan. Uji lebih lanjut yang dapat dilakukan untuk menunjang diagnosa adalah agar gel precipitation test .
Gambar 5 hasil uji HA pada awal pengujian (4 HAU/25 µl cairan allantois) Hasil agar gel precipitation test yang dilakukan terhadap AI, ND, dan IB memberikan hasil positif terhadap AI dan IB yang ditandai dengan terbentuknya garis. Antigen maupun antibodi akan berdifusi dengan arah saling berlawanan dan akhirnya bertemu membentuk garis presipitasi di antara sumuran antigen dan antibodi (Wibowo 2003). Hasil positif terhapat AI dan IB memberikan kesimpulan bahwa entok terinfeksi oleh virus AI dan IB.
-
S1
S2
S1
+
S2
S1
+
S2
IB ND AI Gambar 6 hasil uji AGPT yang memberikan hasil positif pada Virus IB dan AI, serta negatif pada virus ND.
Menurut Mackenzie (2006), infeksi AI dilaporkan mengakibatkan kematian yang besar pada burung liar, angsa, ayam kampung, kalkun, dan itik. Namun pada entok yang diperiksa tidak terlihat adanya gejala klinis akibat infeksi AI. Menurut Hewajuli & Dharmayanti (2012), tipe virus AI yang sering menginfeksi unggas air adalah low pathogenic avian influenza (LPAI) yang bersifat subklinis. Tipe virus highly pathogenic avian influenza (HPAI) pada unggas air kejadiannya bersamaan dengan wabah AI pada unggas peliharaan. Unggas air dan burung liar merupakan reservoir yang unik untuk virus Avian Influenza dikarenakan burung air dan unggas air merupakan reservoir semua subtipe H dan N. Virus Avian Influenza berkembang biak dalam saluran pencernaan unggas air tanpa m enimbulkan gejala klinis (Olsen et al . 2006). Unggas air khususnya ordo Anseriformes (itik, entok, dan angsa) merupakan reservoir alami virus influenza tipe A. Unggas air tidak sakit tetapi dapat menyabarkan virus AI ke unggas lain dan manusia (Hewajuli & Dharmayanti 2012). Tipe virus dan sifat entok sebagai reservoir merupakan salah satu penyebab dapat diisolasinya virus AI pada entok meskipun tidak ada gejala klinis yang tampak. Infectious Bronchitis (IB) merupakan penyakit saluran pernafasan atas dan urogenital pada ayam yang bersifat akut dan menular. Penyakit IB disebabkan oleh virus yang termasuk kedalam famili Coronaviridae dan hanya memiliki satu genus yaitu Coronavirus (Indriani dan Darminto 2004). Virus IB umumnya menyerang ayam dan kalkun. Adanya temuan kasus IB pada entok dapat menjadi catatan tambahan spesies unggas yang dapat terinfeksi oleh virus IB. Menurut Lister et al. (1985); Guy (2000); Ismail et al. (2003); Shengwang (2005), pada sebuah penelitian virus IB juga dapat diisolasi pada merpati dan dilaporkan pula bahwa virus IB dapat berreplikasi dan menginfeksi dari satu spesies unggas ke spesies unggas yang lain. Meskipun demikian, tidak ditemukan tanda-tanda klinis dari kebanyakan kasus yang dilaporkan. Hal ini dapat mendukung tidak ditemukannya tanda klinis pada entok yang terinfeksi virus IB. SIMPULAN
Berdasarkan teknik isolasi dan identifikasi dengan Rapid Agglutination Test, Haemagglutination Assay Test (HA Test ) Micro titrasi, Haemagglutination Inhibition Test (HI Test) Micro titrasi, dan Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
entok didiagnosa terinveksi virus avian influenza (AI) dan virus infectious bronchitis (IB) yang tidak diikuti oleh gejala klinis. SARAN
Dibutuhkan uji molekuler lebih lanjut untuk membuktikan keberadaan virus AI dan ND pada sampel. DAFTAR PUSTAKSA
[OIE] Office International des Epizooties. 2010. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Perancis: OIE. [OIE] Office International des Epizooties. 2012. Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terresterial Animal Chapter 2.3.4. Avian Influenza pp.1-21; Capter 2.3.14. Newcastle Disease Pp. 1-9. Perancis: OIE. Damayanti AP. 2006. Kandungan Protein, Lemak Daging dan Kulit Itik, Entog dan Mandalung Umur 8 Minggu. J. Agroland 13 (3) : 313 – 317. Deptan. 2016. Populasi Itik Manila Menurut Provinsi 2012 – 2016. [Internet]. [07 Feb 2017].Tersedia pada www.pertanian.go.id. Guy JS. 2000. Turkey Coronavirus is More Closely Related to Avian Infectious Bronchitis Virus Than to Mammalian Coronaviruses. Avian Pathol . 29: 207 – 212. Hewajuli DA & Dharmayanti NLPI. 2012. Hubungan AI dan Unggas Air dalam Menciptakan Keragaman Genetik serta Peran Unggas Air Sebagai Reservoir pada Penyebaran Virus AI. Wartazoa. 22 (1): 12 – 23. Ismail MM, Tang AY, Saif YM. 2003. Pathogenicity of Turkey Coronavirus in Turkeys and Chickens. Avian Dis. 47: 515 – 522. Jordan. 1990. Poultry Diseases. Ed ke-3. London: Bailliere Tindall Lister SA, Beer JV, Gough RE, Holmes RG, Jones JMW, Orton RG. 1985. Outbreaks of nephritis in pheasants (Phasianus colchicus) with a possible coronavirus aetiology. Vet Rec. 117: 612 – 613. Mackenzie D. 2006. The bird flu threat. New Scientist . ivii. Specia Sup, 7 January. Merchant P. 1994. Veterinary Bacteriology and Virology. Iowa (US): Iowa State University Pr. Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, Waldenstrom J, Osterhaus ADME, Fouchier RAM. 2006. Global patterns of influenza a virus in wild birds. Science 312: 384 – 388. Putra HH, Wibowo MH, Untari T, Kurniasih. 2012. Studi lesi makroskopis dan mikroskopis embrio ayam yang diinfeksi virus Newcastle disease isolat lapang yang virulen. JSV 30(1):57-67. Rose SP, 1997. Principles of Poultry Science. Inggris (GB): Cab International. Saif YM, Fadly AM, Glisson JR, McDouald LR, Nolan LK, Swayne DE. 2008. Disease of Poultry. Iowa (US): Blackwell Publishing. Setiawan W. 1998. Beternak tik anila (entok). Jakarta (ID): Musi Perkasa Utama.
Shengwang L, Jianfei C, Jinding C, Xiangang K, Yuhao S, Zongxi H, Li F, Xuehui C, Shoulin G, Ming L. 2005. Isolation of avian infectious bronchitis coronavirus from domestic peafowl (Pavo cristatus) and teal (Anas). J Gen Virol . 18:719 – 725. Siregar AGA. 1988. Penuntun Praktikum dan Serologi.Bogor: IPB. Swayne DE, Glisson JR, McDoudald LR, Nolan LK, Suarez DL, Nair V. 2013. Disease of Poultry. Danvers (US): Wiley-Blackwell Publishing. Wibowo HM. 2003. Identifikasi serologis virus infectious laryngotracheitis isolat mangestoni farm dengan uji agar gel presipitasi dan uji netralisasi. J Sains Vet. 21 (2) : 1-5. Wibowo SE, Asmara W, Wibowo MH, Suttrisno B. 2013. Perbandingan tingkat proteksi program vaksinasi Newcastle Disease pada Broiler. JSV .31 (1): 1626.
