Tes Biokimia Identifikasi Enterobacteriaceae 1. Fermentasi karbohidrat
Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme oleh molekul organik yang bertindak memberikan donor elektron serta satu atau lebih produk organik yang bertindak sebagai penerima elektron. Fermentasi glukosa dimulai dengan memproduksi piruvat. Produk akhir fermentasi piruvat meliputi berbagai asam, alkohol, dan H 2 atau Gas CO2. Produk akhir yang spesifik tergantung pada organisme tertentu. Setiap media terdiri dari bahan dasar yang ditambahkan karbohidrat yang dapat difermentasi. Bahan dasar tersebut termasuk di dalamnya adalah pepton dan indikator pH. Setiap karbohidrat dapat digunakan, namun umumnya yang sering digunakan adalah glukosa, laktosa, dan sukrosa. Tabung durham diletakkan terbalik dalam masing-masing tabung sebagai indikator adanya produksi gas. Produksi asam dari fermentasi karbohidrat menurunkan pH di bawah netral dan ternyata deaminasi dari asam amino pepton menghasilkan amonia (NH3), yang meningkatkan pH. Pembentukan asam dapat dilihat dari perubahan warna medium menjadi kuning. Produksi gas ditunjukkan dengan adanya gelembung pada tabung durham. Kemampuan media ini untuk mendeteksi produksi asam tergantung pada waktu inkubasi dan kemampuan fermentor untuk menghasilkan kelebihan yang relatif asam terhadap amonia yang dihasilkan dari proses deaminasi.
Negatif
Positif
2. Test IMViC
Uji IMViC merupakan sebuah uji biokimia yang berguna dalam mengidentifikasi bakteri enterobacteriaceae. enterobacteria ceae. Dalam Dal am reaksi ini metabolisme meta bolisme yang terjadi pada medium agar akan menjadi indikator positif atau negatifnya suatu reaksi yang akan diintepretasikan sesuai dengan sifat biokimia bakteri sehingga akan membantu dalam menentukan
klasifikasi dari bakteri yang diidentifikasi tersebut. IMViC sendiri terdiri dari Indole, Methyl Red, Voges Praskauer, dan Citrat. Keempatnya menjadi standar baku dalam menentukan sifat biokimiawi bakteri koliform. a. Indole
Prinsip : Beberapa bakteri dapat memproduksi indole dari pemecahan asam amino trypthopan dengan menggunakan ezim tryptophanase. Produksi indole akan dideteksi dengan menggunakan pereaksi Erlich atau reagen Kovak. Indole akan bereaksi dengan aldehyde dalam reagen dan memberikan warna merah. Sebuah lapisan alkohol merah akan terbentuk sepeti cincin di bagian atas menandakan indole positif. Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase (Leboffe, 2011). Produksi indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan. Bakteri yang memiliki enzim tryptophanase menghidrolisis tryptophan. menjadi indol, piruvat dan amonia. Hal ini digunakan sebagai bagian dari prosedur IMViC, sebuah tes yang dirancang untuk membedakan antara anggota keluarga Enterobacteriaceae. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein. Bakteri tertentu seperti misalnya Escherichia Coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam piruvat dan NH4) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme. Uji indol dilakukan dengan inokulasi organisme uji ke dalam tryptophan broth, yang mengandung tryptophan. Indol yang dihasilkan dideteksi dengan menambahkan reagen Kovac’s yang mengandung amil alkohol atau diberi kristal asam oksalat ini menghasilkan cincin berwarna merah. Lapisan alkohol berkonsentrasi warna merah berbentuk cincin terdapat di bagian atas. Hasil indol positif dinyatakan dengan adanya cincin merah hal ini disebabkan karena Indol bereaksi dengan aldehida (Sridhar, 2006).
Reaksi Uji Indole
b. Methyl Red (MR)
Prinsip : Mengetahui kemampuan bakteri dalam memproduksi dan memelihara kestabilan asam dari proses akhir fermentasi glukosa. Methy Red merupakan indikator pH, yang menunjukan indikator merah berarti pH asam yang diproduksi itu sekitar 4.4. Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH ”methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6.2.
Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens methyl red. Bila terjadi fermentasi, biakan akan tetap berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi, biakan berubah menjadi kuning setelah penambahan reagen methyl red. Uji ini sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan. Reaksi Uji Methyl Red
Gambar : Uji Methyl Red positif
c. Uji Voges Proskueur
Prinsip : VP berguna dalam mendeteksi adanya butylene glycol yang diproduksi bakteri. Acetyl-methyl carbinol (acetoin) adalah produksi lanjutan dari butylene glycol. Dalam tes ini reagen yang dipakai adalah KOH 40% dan alpha-naphthol. Setelah diinkubasi maka acetoin akan terbentuk dan akan dioxidasi oleh udara oxigen dan KOH menjadi dacetyl. Diacetyl kemudian akan bereaksi dengan guanidine yang merupakan komponen peptone saat ditambahakan alpha-naphthol akan terbentkk warna merah.
Uji Voges Proskueur digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melakukan fermentasi dengan hasil akhir 2,3 butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Pada uji ini dilakukan penambahan 40% KOH KOH dan 5% larutan alphanaphtol pada saat pengamatan. Hal ini dapat menentukan adanya asetoin (asetil metil karbinol), suatu senyawa pemula dalam sintesis 2,3 butanadiol. Reaksi kimia uji VP dapat digambarkan seperti gambar dibawah ini:
Uji positif jika terbentuk warna merah muda eosin sampai merah delima (ruby) seperti gambar dibawah ini. Uji bersifat Negatif bila kaldu MR-VP tidak memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens. Perubahan warna ini disebabkan oleh adanya asetoin. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha naphtol. Perubahan warna medium biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara karena 2,3 butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
d. Citrate
Prinsip : Tes ini mendeteksi kemampuan bakteri dalam menggunakan citrat sebagai sumber karbon tunggal dan energy. Bakteri diinoklulasi kedalam medium yang mengandung sodium citrat dan sebuah indikator pH yaitu bromthymol blue. Medium tersebut juga mengandung inorganic sodium amonium salts, yang mana akan digunakan sebagai sumber karbon utama. Penggunaan citrat melibatkan enzym citritase, dimana akan dipecah citrat menjadi oxaloacetat dan acetat. Kemudian dari oxaloacetat dipecahkan menjadi Piruvat dan CO 2. Hasil produksi dari Na 2CO3 Produksi Na 2CO3 serta pemanfaatan NH3 dari natrium citrat dan amonium garam masing-masing menghasilkan pH basa. Uji citrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan citrat sebagai satu satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium citrat -Koser , berupa medium cair , atau medium simon citrat berupa medium padat. Simon Citrat Agar merupakan medium sintetik dengan Na citrat sebagai satu satunya sumber karbon, NH 4+ sebagai sumber N dan bromthymol blue sebagai indikator pH, sedangkan medium citrat koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan citrat , maka asam akan perlahan menghilang dari medium biakan , sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan citrat sebagai satu satunya sumber karbon, sedangkan pada medium citrat koser kemampuan menggunakan citrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan. Reaksi Uji Citrate
Uji citrat positif ditunjukkan oleh perubahan warna biakan dari hijau menjadi biru karena terbentuknya natrium karbonat hasil reaksi enzimatis yang mengubah indikator bromtimol biru pada media.
Positif
Negatif
3. Uji Urease
Uji Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida terutama untuk mengetahui mikroorganisme tersebut mempunyai enzim urease atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis urea menjadi karbon dioksida dan ammonia ( NH 2 ) 2CO + H2O → CO2 + 2NH3. Uji ini menggunakan urease broth sebagai media diferensial yang dapat membedakan bakteri penghasil eksoenzim yaitu enzim yang berfungsi untuk menghidrolisa urea menjadi ammonia. Kandungan urease broth antara lain larutan buffer, urea, nutrient, serta indicator phenol red. Uji urease menunjukkan hasil positif jika terjadi perubahan warna media dari kuning menjadi merah keunguan karena amoniak yang dihasilkan menyebabkan lingkungan menjadi basa. Hasil uji urease negatif jika tidak terjadi perubahan warna dari kuning menjadi merah keunguan.
4. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji Triple Sugar Iron agar (TSIA) merupakan metode yang digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme dalam memfermentasikan laktosa, glukosa dan sukrosa serta produksi hidrogen sulfida.
Media yang diguanakan diguanakan dalam uji TSIA ini adalah TSIA agar yang yang mengandung mengandung 3 macam gula, yaitu glukosa 0,1%, laktosa 0,1%, dan sukrosa 0,1%. Selain itu, juga terdapat indicator fenol merah yang yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H 2S, ferro sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H 2S dengan bakteribakteri lainnya.Konsentrasi glukosa adalah 1/10 dari konsentrasi laktosa atau sukrosa agar fermentasi glukosa saja yang terlihat Pada uji TSIA warna media berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basa Perubahan warna media ini menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri memfermentasi glukosa. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari gelembung atau pecahnya agar di bagian tusukan. Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam yang terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H 2S dan H2S akan bereaksi dengan Fe++
yang terdapat pada media dan menghasilkan
endapan hitam.
5. Uji Motilitas
Media
uji
mikroorganisme.
motilitas Uji
digunakan
motilitas
untuk
sering
kali
menentukan digunakan
motilitas
dalam
dari
diferensiasi
suatu dari
Enterobacteriaceae (Shields dkk, 2013). Motilitas ditunjukan adanya pertumbuhan bakteri disekitar area penusukan. Pergerakan dari bakteri tersebut dikarenakan media semisolid (uji motilitas) dirancang dengan mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4% pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak.
6. Uji H2S
Pengujian ini menggunakan medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar), uji ini digunakan untuk membedakan antara kelompok Enterobacteriaceae dengan kelompok lainnya. H2S diproduksi diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang (S) seperti lis in dan metionin. Adanya H 2S dapat diamati dengan menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. Dikatakan positif apabila H2S bereaksi dengan senyawa-senyawa ini ditandai dengan terbentuknya logam sulfit yang berwarna hitam. Dan dikatakan negatif apabila tidak terbentuk logam sulfit yang berwarna hitam karena bakteri yang berada dalam medium terse but tidak dapat menghidrolisis logam-logam berat yang terkandung dalam medium. 7. Uji Oksidase
Uji oksidase berfungsi untuk menentukan adanya sitokrom oksidase yang dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu. Mikroorganisme aerobik dan anaerobik fakultatif memiliki enzim sitokrom oksidase dan oksigen sebagai akseptor elektronnya sehingga dalam uji ini akan memberikan hasil uji positif yang ditunjukkan dengan perubahan warna koloni bakteri menjadi hitam dalam waktu 30 menit setelah penambahan reagen uji (strip oksidase). Perubahan warna ini disebabkan sitokrom oksidase mengoksidasikan larutan reagen. Pada mikroorganisme anaerobik obligat akan memberikan hasil uji negatif yang ditandai dengan tidak terjadi peruabahan warna. 8. Uji Gelatin
Uji gelatin digunakan untuk mengetahui keberadaan enzim gelatinase yang dimiliki oleh bakteri uji. Media yang digunakan ialah gelatin. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh jasad renik yang mempunyai enzim gelatinase. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam lemari es. Jika gelatin telah dihidrolisis oleh jasad renik maka akan tetap berifat cair meskipun berada di dalam suhu es yang menunjukkan reaksi positif.
Uji gelatin dilakukan dengan cara mengambil sampel baketri dengan menggunakan kawat ose dan dimasukkan ke dalam nutrien gelatin yang ada di dalam tabung, kemudian tabung ditutup rapat dan disimpan dalam freezer selama 30 menit atau 24 jam.
9. Uji Reduksi Nitrat
Uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri yang menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terakhir dan juga membedakan jenis mikroorganisme yang mampu mereduksi nitrat karena memiliki enzim nitrat reduktase. Bakteri kemolitoautotrof yaitu bakteri yang memperoleh energi melalui oksidasi kimia, menggunakan senyawa anorganik sebagai donor elektron dan CO2 sebagai sumber utamanya. Bakteri Kemoorganoheterotrof adalah bakteri yang membutuhkan senyawa organik untuk pertumbuhannya dimana senyawa organik ini yang bertindak sebagai seba gai sumber karbon dan energi. Kedua jenis bakteri ini dapat menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron terminal selama respirasi anaerob. Selama proses ini, Nitrat diubah menjadi Nitrit oleh enzim Nitrat reduktase. Beberapa bakteri mereduksi nitrat menjadi nitrit saja (E.coli), sementara ada pula bakteri yang dapat mereduksi lebih lanjut menjadi nitrogen bebas (P.fluorescens) atau amonia. Nitrit tidak berwarna tetapi memberikan gelembung gas pada tabung durham, tetapi dalam suasana asam, akan berekasi dengan alfa-naftilamin dan asam sulfanilat untuk menghasilkan warna pink atau merah. Ketika organisme nitrat-positif mereduksi nitrat menjadi nitrit, warna pink akan muncul di medium ketika reagen spesifik tadi ditambahkan. (Namun, alpha-naftilamin ini bersifat karsinogenik, sehingga berbahaya untuk uji identifikasi, sebagai penggantinya digunakan asam sulfamat. Asam sulfamat ini berfungsi sebagai pengganti asam sulfanilat dan alpha-naphtylamin). Apabila setelah penambahan reagen tidak terjadi perubahan warna (nitrat negatif) maka ada 3 kemungkinan: a. Bakteri sebenarnya memiliki enzim nitrat reduktase tetapi telah mereduksi nitrit menjadi nitrogen bebas atau amonia. b. Bakteri memiliki enzim lain untuk mereduksi nitrit menjadi amonia. c. Nitrat tidak direduksi oleh bakteri
Reaksi nitrat-negatif ini selanjutnya diuji dengan penambahan serbuk zink untuk mengkonfirmasi keberadaan Nitrat yang tidak direduksi. Jika initrat memang tidak direduksi maka penambahan kurang lebih 20 mg serbuk Zink ini selama 5-10 menit akan mengubah warna medium menjadi pink atau merah sebab zink dapat mereduksi nitrat menjadi nitrit, tetapi bila tidak menunjukkan warna, berarti nitrat sebenarnya direduksi hanya saja bukan menjadi nitrit tetapi menjadi nitrogen bebas atau amonia. Hal ini berarti tetap hasil positif.
10. Uji Deaminase Fenilalanin
Uji deaminasi fenilalanin dapat digunakan dalam identifikasi bakteri saluran pencernaan. Deaminase mengkatalisasi pemindahan gugus amino (NH 2) dari asam amino dan molekul lainnya yang mengandung – NH.
Asam organik yang dihasilkan dapat
digunakan bakteri untuk biosintesis. Proses deaminasi menetralisasi amin yang menghambat pertumbuhan. Proses deaminasi fenilalanin menghasilkan asam fenilpiruvat. Reaksi asam fenilpiruvat dengan ferri klorida (FeCl 3) menghasilkan senyawa berwarna hijau. Aktivitas enzim deaminase fenilalanin ditentukan dengan cara menumbuhkan bakteri dalam media biakan yang mengandung fenilalanin dan menambahkan beberapa tetes larutan FeCl3. Warna hijau setelah penambahan reagens menunjukkan bahwa fenilalanin telah dideaminasikan. 11. Uji Dekarboksilase Lisin
Dekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu molekul organik. Proses dekarboksilasi asam amino menghasilkan CO 2. Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan bakteri dalam biakan yang mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH. Indikator yang digunakan adalah brom cresol purple (BCP). Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH media biakan dan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning. Dalam suasana asam, proses dekarboksilasi lisin dapat berlangsung sehingga terjadi pembentukan amin yang
menetralisasi suasana asam. Proses netralisasi asam ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuning menjadi ungu seperti sebelumnya. Perubahan warna ungu ini menunjukkan bahwa lisin mengalami dekarboksilasi. Uji dekarboksilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalam pencirian bakteri, terutama yang menempati saluran pencernaan.
DAFTAR PUSTAKA Djide, Natsir & Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi Farmasi. Universitas Hasanuddin. Makassar Dwijoeseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Malang Badan POM RI.2008. Pengujian Mikrobiologi Pangan. Info POM vol.9 no.2 Maret 2008 Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Ed. IV, Jakarta : DEPKES RI. Benson, Microbiological Applications, e-book. Fardiaz, S., 1993, Analisis Mikrobiologi Pangan, Jakarta : PT RajaGrafindo Persada. Irianto, K., 2006, Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme, Bandung : CV Yrama Widya. Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, Jakarta : PT RajaGrafindo Persada. http://indigoe-99.blogspot.co.id/2012/05/uji-oksidase.html https://blueskypharmacy.wordpress.com/2015/05/09/uji-abi-uji-reduksi-nitrat/
