uji biokimia BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Tujuan Percobaan Tujuan dalam percobaan ini adalah melakukan pengujian biokimia untuk identifikasi mikroba. 1.2 Latar Belakang Biokimia merupakan ilmu yang mempelajari tentang senyawa-senyawa yang ada dalam sistem hidup, penyusunan senyawa-senyawa tersebut ke dalam sel-sel dan interaksi kimia yang terjadi. Sel-sel pada makhluk hidup tersusun dari biomolekul. Untuk dapat mempertahankan hidup, hidup, sel-sel mengalami mengalami metabolisme (reaksi pada sel). Dala m metabolisme sel menyerap energi dari makanan atau nutrisinya, energi ini digunakan untuk membentuk biomolekul penyusun sel (Lehninger, 1995). Karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikrobia seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media, memproduksi memproduksi tipe metabolit tertentu yang dideteksi dengan interaksi mikrobia dengan reagen test yang menghasilkan warna reagen. Reaksi-reaksi dalam sel akan teridentifikasi dengan melakukan pengujian-pengujian tertentu. Sel akan memberikan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis lemak (Pelczar dan Chan, 1986). Secara morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Oleh karena itu percobaan ini penting dilakukan, karena dengan melakukan uji biokimia kita dapat mengidentifikasi organisme tak dikenal (Hadieotomo, 1993). BAB II DASAR TEORI Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat p enting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba mikroba seperti s eperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005) Biokimia bertujuan untuk memahami bagaimana interaksi biomolekul satu dengan lainnya membawa sifat-sifat keadaan hidup ini. Belum pernah dalam pengamatan dalam logika molekul sel hidup, kita menemukan suatu pelanggaran terhadap hukum ± hukum fisis yang telah dikenal, seiring dengan itu pula, kita belum pernah memerlukan pendefinisian pendefinisian hukum baru. Mesin organik lunak sel hidup berfungsi di dalam kerangka hukum ± hukum yang sama yang mengatur mesin buatan manusia, akan tetapi, reaksi ± reaksi kimia dan proses pengaturan sel telah maju demikian pesat, melampaui kemampuan kerja mesin buatan manusia (Lehninger, 1995). .Uji fisiologi biasanya identik dengan uji biokimia. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yang antara lain uji katalase,
koagulase, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji hidrolisis kanji, uji hidrogen sulfit dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia mikrobiologi (Lim, 1998). Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji MRVP, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H2S dan lain-lain. Salah satu uji yaitu adalah uji hidrolisis urea. Uji ini sangat penting dalam identifikasi bakteri-bakteri patogen penghuni usus, begitu pula uji yang lain sebenarnya digunakan untuk mengidentifikasi bakteri dengan karakter t ertentu, yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang lain yang hidup disekitarnya (Dwidjoseputro, 1994). Kebanyakan bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap bakteri yang masih hidup. Untuk menjaga kelangsungan hidupnya, sejumlah bakteri mampu menghasilkan enzim katalase yang memecah H2O2 menjadi air dan oksigen sehingga sifat toksiknya hilang (Pelczar dan Chan, 1986). Matinya bakteri-bakteri anerobik obligat bila ada oksigen disebabkan karena tidak adanya pembentukan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri. Ada tidaknya pembentukan enzim katalase dapat membantu pembedaan kelompok-kelompok bakteri tertentu. Pada uji katalase, kebanyakan bakteri aerob dan anaerob menggunakan oksigen H2O2 yang sesungguhnya bersifat racun bagi sistem-sistem enzim sendiri. Namun, mereka tetap dapat hidup dengan adanya racun tersebut karena akan meghasilkan enzim katalase (Hadieotomo, 1993). Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat t etap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut : katalase 2H2O2 2 H2O + O2 (Volk & Wheeler, 1993) Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap r ekasi biokimia dikatalis oleh enzim. Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh bentuknya yang unik dan oleh gugs-gugus polar (atau non polar) yang teedapat dalam struktur enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa senyawa organik maupun anorganik (Lehninger, 1995). Enzim adalah katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi (Lehninger, 1995). Enzim-enzim yang menguraikan golongan potein disebut protenase/protease, kedua nama ini dianggap sinonim. Contoh pada hidrolisis gelatin dimana protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila berada di dalam refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan tetap bersifat cair (Hadioetomo, 1993).
Gelatin diperoleh dengan mendidihkan bahan hewani yang mengandung kolagen, namun gelatin bukanlah protein yang sama tipenya dengan kolagen. Ternyata bobot molekul gelatin hanyalah sepertiga kolagen. Agaknya dalam pembentukan gelatin, molekul tropokolagen terurai dan tiap helai membuat ikatan-ikatan hidrogen dalam air, menghasilkan pembentukan gel yang khas (Fessenden & Fessenden, 1998). Di dalam sitoplasma E. coli terdapat sejumlah unsur granular. Yang paling jelas adalah ribosom yang terlihat padat pada pewarnaan; pada prokaryotis, berdiameter kira-kira 18 nm. Ribosom yang mengandung asam ribonukleat dan sejumlah molekul protein melangsungkan sintesa protein sel. Organel ini seringkali berkelompok menjadi poliribosom atau polisom. Juga di dalam sitoplasma kebanyakan bakteri terdapat granula yang mengandung simpanan nutrien; beberapa mengandung pati, yang lain mengandung lemak. Sitosol, fase cair dari sitoplasma, juga mengandung berbagai enzim yang terlarut, berbagai molekul pembangun yang berfungsi sebagai prekursor makromolekul sel, dan sejumlah garam anorganik (Lehninger, 1995). BAB III METODOLOGI PERCOBAAN 3.1 Alat Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah jarum inokulasi (jarum ose), kaca objek, tabung reaksi, botol semprot, kapas, bunsen, pipet tetes, petridish, inkubator, micropipet. 3.2 Bahan Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah E. coli, Bacillus S ubtilis, Proteus sp, H2O2 3%, alkohol, media MRVP, methyl red, media kanji, Lugol, media kasein, medium nutrient agar, minyak nabati 0,4 mL, media gelatin, CuSO4 jenuh. 3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Katalase 1. Diambil sedikit biakan E. coli, Bacillus Subtilis, Proteus sp dengan menggunakan jarum ose. 2. Disuspensikan biakan tersebut pada setetes larutan H2O2 3%, pada gelas objek. 3. Diamati segera apakah timbul gelembung-gelembung gas sampai jangka waktu 5 menit setelah pencampuran dengan H2O2 3%,. 3.3.2 Methyl ± Red ± Voges ± Proskauer (MR-VP Test) 1. Diinokulasikan bakteri E. Coli dan Bacillus Subtilis ke dalam masing-masing dua tabung reaksi yang berisi media MRVP. 2. Diinkubasi ke empat tabung pada suhu 37 oC selama 48 jam. 3. Diamati terbentuknya asetil metil karbinol dengan cara menetesi methyl red ke dalam tabung reaksi yang telah di inkubasi.
3.3.3 Hidrolisa Kanji 1. Digoreskan bakteri E. coli dan Bacillus Subtilis pada cawan petri yang berisi media kanji padat menggunakan jarum inokulasi. 2. Dimasukkan cawan petri tersebut ke dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 30 oC. 3. Ditetesi cawan petri dengan larutan lugol dan mengamati perubahan yang terjadi. 3.3.4 Hidrolisa Kasein
1. Digoreskan bakteri E. Coli dan Bacillus Subtilis pada cawan petri yang berisi media kasein padat menggunakan jarum inokulasi. 2. Dimasukkan cawan petri tersebut ke dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 30 oC. 3. Diamati bagian tepi cawan apakah jernih atau buram. 3.3.5 Hidrolisa Gelatin 1. Diisi dua buah tabung reaksi dengan media gelatin (cair) sampai setengah tinggi tabung reaksi kemudian mensterilkannya. 2. Diinokulasikan bakteri E. Coli dan Bacillus Subtilis ke dalam masing-masing dua tabung reaksi tersebut. 3. Diinkubasi ke dua tabung pada suhu 37 oC selama 48 jam. 4. Dilakukan pengamatan dan uji terhidrolisanya gelatin dengan cara mendinginkannya (0 4 oC) selama kurang lebih 10 menit. 3.3.6 Hidrolisa Lemak 1. Diinokulasi bakteri E. Coli dan Bacillus Subtilis secara goresan ke dalam cawan petri yang berisi media NA yang telah bercampur dengan minyak. 2. Diinkubasi cawan petri tersebut pada suhu 37 oC selama 72 jam. 3. Dituangkan larutan CuSO4 jenuh ke dalam petridish, diamkan selama 10 15 menit. Membuang larutan CuSO4 yang masih ada dalam cawan petri. 4. Diamati terjadinya warna mengkilat kehijauan. . DAFTAR PUSTAKA
Dwidjoseputro, 1994, Dasar-Dasar Mikrobiologi , Djambaran, Jakarta. Fessenden, R. J. dan Fessenden, J. S., 1998, Ki mia Organik Jilid 2 , Erlangga, Jakarta. Hadioetomo, R.S., 1993, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi, Gramedia, Jakarta. Lehninger. 1995. Dasar
dasar Biokimia, Jilid I. Erlangga. Jakarta.
Lim, D., 1995, Microbiology, WCB.Mc graw Hill, New York. Murray, 1995, Biokimia Harper, EGC, Jakarta. Pelczar, M.J. Dan Chan, E.C.S., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Jilid 1, Edisi kelima. Erlangga. Jakarta.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengamatan Tabel 4.1.1 Pengamatan Uji Katalase No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 1 (I) 2 (I) 1 (II) 2 (II) 1. Escherichia coli (1) (2) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) 2. Bacillus subtilis (1) (2) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) 3. Proteus sp. (1) (2) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) + (gelembung) Tabel 4.1.2 Pengamatan Uji Methyl Red ± Voges Proskuer (MR-VP Test) No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 12 1. Escherichia coli (1) (2) (warna coklat kehitaman) (warna coklat kehitaman) 2. Bacillus subtilis (1) (2) (warna coklat kehitaman) (warna coklat kehitaman)
Tabel 4.1.3 Pengamatan Uji Hidrolisa Kanji No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 12 1. Escherichia coli (1) (2) + (warna biru kehitaman) + (warna biru kehitaman) 2. Bacillus subtilis (1) (2) + (warna kebiruan) + (warna kebiruan) Tabel 4.1.4 Pengamatan Uji Hidrolisa Kasein No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 12 1. Escherichia coli (1) (2) + (jernih) + (jernih) 2. Bacillus subtilis
(1) (2) + (jernih) + (jernih)
Tabel 4.1.5 Pengamatan Uji Hidrolisa Gelatin No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 12 1. Escherichia coli (1) (2) (beku) (beku) 2. Bacillus subtilis (1) (2) + (tidak beku) + (tidak beku)
Tabel 4.1.6 Pengamatan Uji Hidrolisa Lemak No. Nama Bakteri Gambar Keterangan 12 1. Escherichia coli (1) (2) + (warna hijau mengkilap) + (warna hijau mengkilap) 2. Bacillus subtilis
(1) (2) + (warna hijau mengkilap) + (warna hijau mengkilap)
4.2 Pembahasan Praktikum yang dilakukan kali ini adalah uji biokimia yang bertujuan untuk mempelajari beberapa pengujian biokimia yang digunakan untuk karakteristik dan identifikasi mikroba. Uji biokimia ini sendiri biasanya dipakai kegiatan identifikasi bakteri atau organisme, yaitu antara lain adalah uji koagulase, uji katalase, uji MR-VP, uji nitrit, hidrolisis gelatin, uji H2S dan lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu yang penting di dalam dunia mikrobiologi. Uji biokimia ini digunakan untuk identifikasi bakteri dengan karakter tertentu. Yang mana dengan karakter tersebut ia dapat dibedakan dengan jelas dari bakteri-bakteri yang hidup disekitarnya. Uji Katalase dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob atau anaerob obligat. Adapun reaksi yang terjadi yaitu : 2 H2O2 enzim katalase 2 H2O (l) + O2 (g) Bakteri-bakteri anaerob mati apabila terkena oksigen. Hal ini dikarenakan oleh ketiadaan zat pembentuk enzim katalase. Sehingga oksigen peroksida (H2O2) meracuni bakteri itu sendiri. Ada tidaknya pembentukan enzim katalase dapat membantu kelompok bakteri-bakteri tersebut. Enzim katalase bekerja dengan menguraikan H2O menjadi molekul O2 dan H2. Enzim katalase mempunyai kestabilan yang lebih rendah terhadap panas dibandingkan dengan suatu peroksidase. Hasil pengujian terhadap ada atau tidaknya enzim katalase pada biakan Escherichia coli, Bacillus Subtilis dan Pr oteus sp, didapatkan bahwa pada biakan bakteri tersebut telah dilakukan pengujian dengan larutan hidrogen peroksida (H2O2) menghasilkan reaksi positif pada semua sampel. Hal ini dibuktikan dengan adanya gelembung-gelembung gas. Hal ini membuktikan pada biakan E-coli, Bacillus Subtilis dan Proteus sp tersebut mengandung enzim katalase. Pada uji MR-VP dilakukan untuk menguji terbentuknya asam organik. Setelah bakteri yang diinokulasikan bakteri yang akan diujikan, yaitu Escherichia coli dan Bacillus Subtilis pa da media MRVP, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 48 jam. Kemudian bakteri yang telah diinkubasi tersebut diberi methyl red beberapa tetes, methyl red ini sebagai indikator asam basa, kemudian media berubah menjadi merah, hal ini dikarenakan medium sedikit asam. Pada media MRVP bakteri Escherichia coli dan Bacillus Subtilis menunjukkan hasil negatif, karena berwarna cokelat. Bakteri yang digunakan pada uji kanji pun masih menggunakan bakteri yang sama, yaitu Escherichia coli dan Bacillus Subtilis. Uji hidrolisa kanji dimaksudkan untuk mendeteksi ada tidaknya pembentukan amilum oleh enzim amilase pada bakteri. Pada E. Coli dan Bacillus Subtilis yang telah diinokulasi dalam media kanji dan diinkubasi selama beberapa hari di tetesi dengan larutan lugol. Larutan lugol ini merupakan larutan yang umum digunakan untuk mendeteksi adanya amilum dalam suatu bahan makanan, hasil positif ditandai dengan warna hitam pada bahan tersebut. Setelah dilakukan penetesan diperoleh hasil positif dengan adanya perubahan warna menjadi hitam. Ini menandakan bahwa pada bakteri E. Coli dan Bacillus Subtilis mempunyai enzim amilase untuk menghidrolisis kanji menjadi amilum. Uji kasein bertujuan untuk mendeteksi adanya pembentukan asam bakteri yang disebabkan oleh aktivitas bakteri yang bersifat mesofilik. Bakteri ini akan memecah laktosa menjadi asam laktat. Aktivtas enzim protiolitik akan memecah protein dan merusak stabilitas kasein. Pada percobaan dan hasil pengamatan menunjukan bahwa Bacillus subtilis dan Eschericia coli positif terhidrolisanya kasein karena disekitar koloni bakteri menjadi jernih. Untuk
terhidrolisanya kasein dengan mengamati perubahan media disekitar koloni bakteri menjadi jernih (uji positif) atau tetap buram (uji negatif). Uji hidrolisa gelatin bertujuan untuk menentukan kemampuan suatu mikroorganisme membentuk enzim semacam proteolitik (gelatinase) yang dapat mencairkan gelatin merupakan hidrolisis dari asam amino. Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kalogen. Jika media memadat atau membeku setelah pendinginan, tes menunjukan negatif (bakteri tidak dapat mencerna gelatin). Jika media tetap cair setelah pendinginan maka hasil percobaan tersebut positif (bakteri dapat mencerna gelatin). Biakan bakteri yang digunakan pada uji ini adalah Escherichia coli dan Bacillus Subtilis. Setelah bakteri tersebut diinokulasi ke tabung, lalu di incubator pada suhu 300C selama 48 jam. Ketika didinginkan dengan es, ternyata hanya Bacillus Subtilis menunjukkan reaksi positif. Hal ini berarti g elatin tidak terurai oleh bakteri Escherichia coli yang tidak dapat mensintesis enzim Proteolisis, yang ditunjukkan dengan membekunya gelatin yang berisi biakan bakteri. Hidrolisa lemak dilakukan untuk mengetahui kemampuan mikroba memecah ikatan lipida. Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut : Lemak + H2O gliserol + asam lemak Media yang digunakan dalam percobaan ini merupakan media nutrien agar (NA) yang dicampur dengan minyak goreng. Penambahan minyak ini berfungsi sebagai lemak. Kemudian media tersebut diinkubasi selama 72 jam. S etelah itu biakan bakteri tersebut ditetesi dengan CuSO4 jenuh. Dan akan bereaksi positif jika membentuk warna hijau metalik pada biakan bakteri. Penggunaan larutan CuSO4 jenuh bertujuan hanya sebagai indikator untuk mempercepat reaksi. Pada bakteri E. coli diperoleh hasil yang negatif ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut dapat menghidrolisis lemak yang ada pada media.
BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan Kesimpulan yang diperoleh dari percobaan ini adalah : 1. Uji biokimia dapat dilakukan untuk mengetahui karakterisasi dan identifikasi bakteri. 2. Bakteri Eschericia coli, Bacillus subtilus, dan Proteus sp positif pada uji katalase yang ditandai dengan terbentuknya gelembung gas. 3. Bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilus negatif pada uji MR-VP yang ditandai dengan perubahan warna menjadi coklat.
4. Bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilus positif pada uji hidrolisa kanji yang ditandai dengan perubahan warna menjadi hitam. 5. Bakteri Eschericia coli negatif dan Bacillus subtilus positif pada uji hidrolisa gelatin. 6. Bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilus positif pada uji hidrolisa lemak yang ditandai dengan perubahan warna menjadi hijau mengkilat. 5.2 Saran Saran yang dapat diberikan untuk percobaan ini adalah sebaiknya para praktikan benar-benar menguasai prosedur kerja.
