BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 2 bulan, yaitu mulai pada minggu keempat bulan Februari sampai minggu minggu keempat bulan April 2009. 2009. Penelitian dilaksanakan dilaksanakan di Laboratorium Biologi, Jurusan Biologi, Biologi,
FMIPA, Universitas
Haluoleo. B. Subjek penelitian
Subjek penelitian ini adalah isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1 hasil skrining bakteri
penghasil
kitinase
dari
tempat
pemeliharaan
udang
(tambak),
penampungan udang, limbah pengolahan udang dan tempat pembuangan limbah padat udang yang terdapat dibeberapa daerah industri perikanan di Sulawesi Selatan dan Sulawesi Tenggara, yang dikarakterisasi sifat biokimianya dengan menggunakan berbagai uji biokimia yaitu uji fermentasi karbohidrat, uji hidrolisis pati, uji methyl red, uji Voges-Proskauer , uji oksidase, oksidase, uji katalase, uji indol, uji sitrat, uji pencairan gelatin, uji urease, uji H 2S, uji selulose dan uji protease.
C. Alat dan bahan yang digunakan 1.
Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian penelitian ini yaitu yaitu terdiri dari dari peralatan gelas dan bukan gelas serta peralatan instrumen. a. Peralatan gelas dan bukan gelas Peralatan gelas terdiri dari tabung reaksi ( pyrex), cawan petri ( pyrex), gelas
ukur
100
mL
dan
50
mL,
gelas
kimia
( pyrex)
500
mL,
pyrex) 250 mL, pipet volume ( pyrex) 5 mL dan 10 mL, Erlenmeyer ( pyrex
pipet tetes, tabung Durham, pembakar pembakar bunsen, alat penanam penanam bakteri (jarum ose) ujung bulat dan ujung runcing. Peralatan bukan gelas terdiri dari karet pengisap ( filler ), ), pengaduk magnetik, pipet mikro, rak tabung tabung reaksi dan botol semprot. b. Peralatan instrumen Peralatan instrumen terdiri terdiri dari autoklaf, neraca analitik (precisa 205 A), inkubator, mikroskop cahaya, pemanas ( thermolyne), refrigerator, entkas. 2. Bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah pepton, dekstrosa, kalium fosfat, ammonium dihidrogen fosfat, dikalium fosfat natrium klorida, natrium sitrat, magnesium sulfat, agar, brom timol biru (BTB) tripton, kalsium klorida, glukosa, laktosa, sukrosa, kalium dihidrogen fosfat, fenol merah, triple sugar iron agar (TSIA) , , gelatin, ekstrak ragi, susu skim, karboksimetilselulosa
51
(CMC), kalium nitrat, trypticase soy agar (TSA), metil merah, etanol 70% dan etanol 95 %, -naftol, hidrogen peroksida, asam sulfat pekat, larutan iodin, kalium hidroksida, manitol, maltosa, pati, dimetil-p-fenilendiamin oksalat, safranin, larutan lugol lugol iodin, Simmon Simmon sitrat agar, kalium nitrit 0,5% , asam sulfanilat, sulfanilat, -naftilamin, p-dimetilaminobenzaldehida, butanol, asam klorida pekat dan
α
aquades.
..............................
52
D. Prosedur penelitian
Secara umum, metode penelitian ini digambarkan dalam skema berikut : a. Pewarnaan Gram
Kaca penutup dan kaca objek -dibersihkan dengan alkohol 70% -dilewatkan di atas nyala lampu spirtus Isolat bakteri (1 ose) -diletakkan diatas kaca objek seluas ± 1 cm
2
-dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus -
diteteskan zat warna dasar (kristal violet ) (2 tetes) -didiamkan selama 1 menit -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan
-ditetesi dengan larutan lugol iodin dan -diamkan 1 menit -dicuci dengan alkohol 95% (2 tetes) -didiamkan selama ± 30 detik -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan -diberi larutan safranin (2 tetes) -didiamkan selama 2 menit -dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan -diamati dengan mikroskop bakteri gram positif berwarna biru keunguan sedangkan gram negatif berwarna merah
53
b. Uji sifat biokimia isolat
Sterilisasi alat yang akan digunakan -sterilisasi dengan menggunakan metode panas o lembab (autoklaf) pada suhu 121 C selama 15 menit -dikeringkan dengan menggunakan oven pada o suhu 80 C selama 15 menit
Pembuatan media uji mikroba
Pembuatan reagen uji
- disterilisasi dengan metode panas lembab (autoklaf) o pada suhu 121 C selama 15 menit media uji mikroba steril
reagen uji
Inokulasi isolat bakteri kitinolitik pada tiap-tiap media uji
Inkubasi pada suhu dan waktu sesuai tiap-tiap uji biokimia
Karakterisasi isolat bakteri dengan berbagai uji biokimia, yaitu : - uji fermentasi karbohidrat - uji hidrolisis pati -uji methyl red - uji oksidase - uji Voges-Proskauer - uji katalase - uji indol - uji sitrat - uji pencairan gelatin - uji urease - uji H2S - uji selulase - uji protease - uji nitrat
54
D. Identifikasi isolat
Isolat diidentifikasi berdasarkan pewarnaan gram untuk mengetahui bentuk sel bakteri dan sifat gram (gram negatif/gram positif) dan uji karakterisasi sifat biokimia isolat. a. Pewarnaan Gram
Kaca penutup dan kaca obyek dibersihkan dengan alkohol hingga bebas lemak, kemudian dilewatkan di atas nyala lampu spritus. Diambil secara aseptik sebanyak satu ose isolat bakteri dan diletakkan pada kaca obyek seluas ± 1 cm
2
kemudian dilakukan fiksasi di atas nyala lampu spritus. Diteteskan zat warna dasar (kristal violet ) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan, kemudian ditetesi dengan larutan lugol iodin dan diamkan selama 1 menit. Setelah kering, dicuci dengan larutan peluntur/pemucat peluntur/pemucat (alkohol 95%) sebayak 2 tetes dan didiamkan selama ± 30 detik. Selanjutnya dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah kering diberi larutan zat warna pembanding/penutup (safranin) sebanyak 2 tetes dan didiamkan selama 2 menit dan dicuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah itu diamati dengan mikroskop, bakteri gram positif tampak berwarna biru keunguan sedangkan sedangkan gram negatif berwarna merah merah (Lay, 1994).
55
b. Uji sifat biokimia isolat
Uji fermentasi karbohidrat
Langkah-langkah Langkah-langkah yang digunakan dalam uji fermentasi karbohidrat adalah menyiapkan kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol masing-masing 1%. Kaldu karbohidrat yang mengandung BTB (brom timol biru) sebagai indikator pH dan ditambahkan pepton sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi tabung Durham. Kemudian diinokulasi dengan biakan bakteri. Setelah itu o
diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30 C selama 24 jam. Selanjutnya fermentasi karbohidrat diperiksa dengan melihat pembentukan asam (warna kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham (Lay, 1994).
Uji methyl red
Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red adalah disiapkan kaldu MR-VP, lalu dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dan o
diinokulasikan biakan bakteri ke dalam kaldu MR-VP, diinkubasi pada suhu 37 C o
selama 48 jam atau pada suhu 30 C selama 72 jam . Hari berikutnya ditambahkan reagen metil merah 5 tetes, jika kaldu berwarna merah setelah penambahan reagen metil merah maka menunjukan hasil uji positif, dan jika warna kaldu berwarna kuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).
56
Uji Voges Proskauer
Kaldu MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, o
diinokulasi bakteri pada kaldu MR-VP, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Setelah itu ditambahkan 10 tetes larutan KOH 40% dan 15 tetes larutan α-naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji positif jika kaldu berwarna merah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah penambahan penambahan reagen r eagen (Lay, 1994).
Uji oksidase
Biakan ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA), diinkubasi selama o
pada suhu 30 C selama 24 jam, kemudian ditambahkan reagen uji oksidase (campuran 1:1 larutan
naftol
1% dan 1% larutan
dimetil-p-fenilendiamin
oksalat) pada koloni bakteri dan didiamkan selama 30 menit. Uji positif jika warna koloni berubah menjadi hitam (Lay, 1994).
Uji katalase
Biakan ditumbuhkan pada media NA dengan cara ditotolkan dan o
diinkubasi selama selama 24 jam pada suhu 30 C kemudian ditambahkan reagen H 2O2 3 %. Uji positif ditandai dengan pembentukan gelembung udara pada biakan dan disekitarnya (Lay, 1994).
57
Uji indol
Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, diinkubasi
selama
24
jam
pada
suhu
o
35 C,
kemudian
ditambahkan
beberapa tetes reagen Kovacs. Jika terbentuk warna merah dipermukaan medium menunjukkan hasil uji positif (Waluyo, 2008).
Uji sitrat
Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulum 0
yang tipis, kemudian diinkubasi pada suhu 35 C selama 48 jam. Jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukan uji positif (Lay, 1994).
Uji pencairan gelatin
Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yang akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasi 0
pada suhu 35 C selama 24 jam. Jika media gelatin mencair, maka langkah selanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit. Diamati pencairan gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika 0
tidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 35 C. Uji negatif jika setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).
58
Uji hidrogen sulfida ( H 2S)
Inokulasi biakan pada tabung reaksi yang telah berisi media TSIA 7 mL dengan cara menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru diinokulasi o
pada bagian slant TSIA. Inkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam. Diamati pertumbuhannya pada bagian Butt dan Slant (Lay, 1994).
Uji urease
Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme, 0
kemudian diinkubasi pad suhu 35 C selama selama 24 24 jam. Jika terjadi perubahan perubahan warna dari kuning
menjadi merah keunguan
maka menunjukkan uji positif
(Hadioetomo, 1985).
Uji selulase
Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC (karboksimetilselulase) (karboksimetilselulase) pada cawan cawan Petri dengan melubangi melubangi agar pada pada cawan cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkan di masukkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet lalu diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan posisi tidak o
terbalik pada suhu 37 C. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).
59
O
O O
O
O
(a)
( b)
Gambar 19. (a) Bentuk lubang dan (b) bentuk goresan pada media uji.
Uji protease
Inokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim pada cawan Petri
dengan membagi membagi media menjadi 4 bagian bagian dengan dengan menggunakan menggunakan
spidol pada bagian luar cawan petri, kemudian digoreskan inokulum pada 4 bagian media tersebut (Gambar 19.b). Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada o
inkubator dengan suhu 37 C. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah goresan (Akhdiya, 2003).
Uji hidrolisis pati
Biakan diinokulasi pada media NA yang mengandung pati, dengan cara melubangi agar pada cawan dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5 lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian diencerkan dalam 1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet dan diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100
L
. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada o
inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37 C. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).
60
Uji reduksi nitrat
Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada kaldu nitrat
dalam tabung tabung reaksi reaksi yang telah dilengkapi dilengkapi dengan tabung Durham, Durham, o
kemudian diinkubasi pada suhu 35 C selama 24 jam. Setelah masa inkubasi, diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media biakan. Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahan
α
warna media menjadi merah atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, warna, ditambahkan ditambahkan bubuk Zn untuk melihat melihat reduksi nitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu berubah warna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitrit dan nitrit ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004). E. Desain penelitian Tabel 6. Desain penelitian hasil perlakuan pada pewarnaan Gram terhadap isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1.
No
Reagen yang diberikan
Warna isolat SSA2.B4.1
1
Kristal violet
2
Larutan lugol
3
Larutan pemucat (Alkohol 95%)
4
Safranin
SSD2A7
Kesimpulan
61
Tabel 7. Desain penelitian hasil uji sifat biokimia isolat SSA2.B4.1 dan SSD2A7.1. No
Nama isolat
Jenis uji
Hasil uji
Keterangan
1
2
3
4
5
1.
SSD2A7.1.
1. Fermentasi karbodidrat a. Fermentasi glukosa b. Fermentasi manitol c. Fermentasi laktosa d. Fermentasi sukrosa 2. Uji indol 3. Uji Methyl red 4. Uji Voges Voges Proskauer 5. Uji sitrat 6. Uji urease 7. Uji Hidrogen Hidrogen sulfida 8. Uji katalase 9. Uji selulase 10. Uji protease 11. Uji hidrolisis pati 12. Uji pencairan gelatin 13. Uji oksidase 14. Uji nitrat
62
No
Nama isolat
Jenis uji
Hasil uji
Keterangan
1
2
3
4
5
1. Fermentasi karbodidrat a. Fermentasi glukosa b. Fermentasi manitol c. Fermentasi laktosa d. Fermentasi sukrosa
2.
SSA2B4.1.
2. Uji indol 3. Uji Methyl red 4. Uji Voges Voges Proskauer 5. Uji sitrat 6. Uji urease 7. Uji Hidrogen sulfida 8. Uji katalase 9. Uji selulase 10. Uji protease 11. Uji hidrolisis pati 12. Uji pencairan gelatin 13. Uji oksidase 14. Uji nitrat
63
