Uji fisiologi dilakukan untuk mengidentifikasi organisme yang tidak dikenal. Dengan perlakuan berbeda-beda pada masing-masing uji, sel akan memberikan respon sesuai dengan kemampuan yang dimilikinya, misalnya menghasilkan enzim katalase, enzim gelatinase atau kemampuan untuk menghidrolisis lemak (Pelczar 1986). Beberapa uji yang dilakukan pada percobaan ini, yaitu uji fermentasi karbohidrat, uji Voges-Proskauer (VP), hidrolisis pati, uji indol, hidrolisis urea, uji penggunaan sulfat. Uji fermentasi karbohidrat dilakukan menggunakan kaldu glukosa dalam tabung durham dengan indikator merah fenol. Hasil positif pada uji ini diperoleh jika warna berubah menjadi kuning, artinya bakteri memfermentasi glukosa membentuk asam, dan gas pada tabung menandakan terbentuknya gas (Hadioetomo 1993). Fermentasi merupakan proses menghasilkan energi dalam sel pada keadaan anaerob (Sunatmo 2009). Uji ini dilakukan pada bakteri E. coli dalam kaldu glukosa. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa warna medium berubah menjadi kuning dan adanya gas pada tabung kecil. Berdasarkan literatur, percobaan tersebut positif sehingga dapat disimpulkan bahwa bakteri E. coli adalah bakteri fermentatif terhadap glukosa. Uji katalase dilakukan menggunakan biakan bakteri yang ditambahkan hidrogen peroksida.
Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya  beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase (Volk 1993) . Hasil positif diperoleh jika terbentuk gelembung gas. Gelembung tersebut merupakan hasil dari aktivitas enzim katalase merubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Herland 2009). Selain itu, dilakukan juga uji
oksidase dilakukan menggunakan reagen uji oksidase dan biakan yang ditetesi pada kertas oksidase. Hasil positif diperoleh jika warna kertas berubah menjadi biru keunguan. Kedua uji ini dilakukan pada S. Aureus. Berdasarkan pengamatan, terbentuk gelembung gas pada uji katalase dan kertas oksidase berubah menjadi biru keunguan. Hal tersebut sesuai dengan literatur sehingga dapat dinyatakan bahwa S. Aureus dapat menghasilkan katalase dan oksidase dalam proses metabolismenya. Uji VP (Voges-proskauer) dilakukan dengan menambahkan reagen Barrit yang merupakan indikator adanya 2,3-butanadiol. Hasil positif diperoleh jiga teramati medium berwarna merah, artinya terbentuk 2,3-butanadiol dan reaksi VP positif. Uji ini biasa dilakukan untuk membedakan bakteri usus seperti E. coli, E. aerogenes, dan K. pneumoniae (Murray 1995). Uji VP dilakukan terhadap biakan Bacillus sp.. hasil pengamatan menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan medium menjadi merah atau hasilnya negatif. Dengan demikian, Bacillus sp. tidak menghasilkan 2,3butanadiol. Uji MR (methyl-red) dilakukan pada bakteri yang dapat meragi glukosa dalam medium MR dan menghasilkan asam laktat, asetat, suksinat, format, CO2, H2, dan Etanol. Merah metil berfungsi sebagai indikator pH. Jika bakteri dapat meragi glukosa dan menghasilkan asam-asam tersebut, medium akan berwarna merah. Hal ini menandakan bahwa organisme yang bersangkutan adalah peragi asam campuran (Hadioetomo 1993). Uji MR dilakukan terhadap E. coli. Hasil menunjukkan bahwa warna medium tetap berwarna kuning, tidak menjadi merah. Hasil ini tidak sesuai dengan literatur karena E. coli seharusnya menghasilkan asam dan mengubah warna medium menjadi merah.
Uji indol digunakan untuk melihat kemampuan k emampuan bakteri bakte ri mendegradasi mendegradas i asam amino am ino triptofan secara enzimatik. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol
dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein (Volk dan Wheeler, 1993). Uji Indol dilakukan pada E. coli dan ... hasilnya menunjukkan bahwa terbentuk lapisan merah di permukaan medium E. coli (hasil positif), sedangkan hasil negatif pada .... Dengan demikian, dapat dinyatakan bahwa E. coli dapat menghidrolisis triptodan menjadi indol dan asam piruvat melalui kerja enzim triptofanase, sedangkan ... tidak dapat. Uji hidrolisis urea dilakukan untuk melihat bakteri mampu menghasilkan enzim urease. Timbulnya warna merah keunguan berarti reaksi positif dan negatif warna tidak berubah (Raihana 2011). Hasil positif merah keunguan terjadi karena berubahnya warna indikator pH (fenol) akibat dihasilkannya amonia dari aktivitas enzim urease (Hadioetomo 1993). Uji ini dilakukan pada Proteus. Hasilnya medium agar miring urea berubah warna menjadi merah. Artinya, pH medium menjadi basa yang disebabkan oleh terbentuknya amonia oleh bakteri P roteus melalui kerja enzim urease. Uji hidrolisis pati dilakukan pada bakteri yang dapat menghidrolisis pati menjadi molekul maltosa, glukosa, dan dekstrin dengan menggunakan enzim amilase. Pada uji ini digunakan larutan iodium gram yang merupakan indikator pati. Adanya pati memberikan warna biru pada medium. Bagian dari medium yang telah menjadi jernih merupakan bagian dimana sudah tidak ada lagi pati karena pati sudah terhidrolisis oleh bakteri dengan bantuan enzim amilase (Hadioetomo 1993). Uji hidrolisis pati dilakukan pada Bacillus. Hasilnya, terdapat zona bening pada cawan agar (hasil positif). Zona bening menandakan sudah tidak adanya pati karena pati sudah terhidrolisis menjadi maltosa, glukosa, dan dekstrin. Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satusatunya sumber karbon. warna biru menunjukkan reaksi positif, warna hijau menunjukkan reaksi negatif(Raihana 2011). Warna biru diperoleh karena adanya indikator BTB yang menandakan keadaan alkalin (basa) (Hadioetomo 1993). Uji ini dilakukan pada Proteus dan ,,, . hasil kedua menunjukkan bahwa medium berubah warna menjadi biru. Dengan demikian, dapat dinyatakan bahwa proteus dan .. menggunakan sitrat sebagai sumber karbon satu-satunya untuk proses metabolismenya. Uji hidrogen sulfida dilakukan menggunakan medium TSIA. Hasil positif jika agar TSIA berubah warna menjadi hitam kecoklatan yang menandakan bahwa dihasilkannya H2S oleh bakteri. Uji ini dilakukan untuk menentukan bakteri yang menghasilkan hidrogen sulfida dari asam amino sistein melalui kerja enzim sisteina desulfurase (Pelczar 1986). H2S yang dihasilkan akan bereaksi dengan plumbum asetat yang menghasilkan plumbum sulfida berwarna hitam (Hadioetomo 1993). Pada uji ini digunakan Proteus. Hasilnya, teramati bagian berwarna gelap kehitaman di bagian bawah tabung (Hasil positif). Dengan demikian, dapat dinyatakan bahwa Proteus dapat menghasilkan H2S dari sistein.
