TESTELE IMUNOHISTOCHIMICE IN PATOLOGIA TUMORALA 1.Notiuni introductive : -Imunohistochimia (IHC) reprezinta combinatia dintre 2 stiinte : imunologia si histochimia, avind ca scop evidentierea proprietatilor antigenice ale unor substante intrun tesut, utilizind anticorpi monoclonali sau seruri polireactive. -Vizualizarea substantelor antigenice se poate face atit la nivel tisular, cit si la nivel celular si subcelular, pe preparate la gheata sau parafina. -Imunohistochimia sau IHC se refera la procesul de detectare al antigenilor (de exemplu al proteinelor), dintr-o sectiune a tesutului celulelor, prin exploatarea principiului legaturii dintre anticorpi, in mod special in cazul anticorpilor prezenti in tesuturile biologice. -Etimologia cuvantului provine de la imunologie - cu referire la anticorpii analizati in cadrul procedurii si histo, care inseamna tesut. Colorarea imunohistochimica este utilizata pe scara laga in diagnosticul si depistarea celulelor anormale, cum ar fi cele specifice tumorilor canceroase. Markerii moleculari specifici sunt caracteristici anumitor procese celulalre cum ar fi proliferarea sau moartea celulara (apoptoza). -IHC este utilizata si in cercetarile fundamentale realizate pentru intelegerea distributiei si localizarii biomarkerilor si a diferentierii proteinelor din diferite parti ale tesutului biologic. vizualizarea unei interactiuni anticorp-antigen poate fi realizata in diverse moduri. Deseori, un anticorp este conjugat cu o enzima, ca in procesul peroxidazei, pentru a avea lor catalizarea unei reactii in urma careia se obtine o anumita coloratie (de exemplu, imunoperioxiaza de coloratie). 2.Principalele aplicatii ale tehnicilor IHC in practica de rutina 1) Clasificarea histogenetica a tumorilor slab diferentiate sau anaplazice 2) Diagnosticul pozitiv al bolilor leucocitare 3) Tipizarea tumorilor neleucocitare 4) Detectia antigenelor virale si microbiene 5) Evidentierea markerilor de prognostic in cancer 6) Stabilirea susceptibilitatii de raspuns la tratament a unor tumori Teste imunohistochimice (IHC) ofera : - Confirmarea sau infirmarea diagnosticului histopatologic clasic de leziune - Stabilirea histogenezei tumorilor maligne nediferentiate - Distinctia intre leziuni neoplazice in situ, leziuni neoplazice invazive si leziuni pseudotumorale - Aprecierea factorilor moleculari de prognostic in tumori - Evaluarea factorilor moleculari predictivi in tumori maligne, pentru modularea terapiilor specifice - Identificarea micrometastazelor tumorale, dificil de identificat cu certitudine pe preparate histopatologice standard (coloratie H&E) - Caracterizarea moleculara a tumorilor cu punct de plecare nedeterminat - Identificarea unor agenti infectiosi in leziuni dsiplazice: HPV si Helicobacter pylori 3.Impactul IHC in diagnosticul anatomo-patologic -Diagnosticul pozitiv si diferential in tumori solide si nesolide
-Deteminarea factorilor de prognostic in cancer : -Microinvazia si pseudoinfiltratia -Micrometastazele oculte -Factori de proliferare -Proto-oncogene si anti-oncogene -Factori de crestere 4.Tehnica examenul imuno-histochimic este o metodă adjuvantă pentru examenul histopatologic care poate preciza o serie de caracteristici intrinseci ale tumorii (prezenţa unor receptori, a unor anomalii celulare specifice) utilizate pentru individualizarea tratamentelor oncologice (adică fiecare pacient să primească un anumit tip de tratament, cât mai adecvat tumorii pe care o are, cu toate caracteristicile ei). - Prin acest examen se poate stabili mai exact tipul de cancer precum şi modalitatea terapeutică cea mai eficientă. -In anumite cazuri, coloratiile imunohistochimice sunt esentiale pentru a confirma prezenta unor antigene fara de care nu se poate preciza un diagnostic exact. In acest caz, vi se va cere acordul prealabil, avand in vedere costurile suplimentare pe care le implica. -In alte cazuri, anatomopatologul va preciza un diagnostic dar va recomanda completarea lui cu teste imunohistochimice. Aceste detalii sunt foarte importante pentru conduita terapeutica ulterioara, putand sa faca chiar diferenta in succesul tratamentului. Tehnicile imunohistochimice dau adesea informatii mult mai pretioase chiar decat alte analize performante, cum este RMN-ul. Tehnica Imunohistochimica (IHC) -Biopsia de dimensiuni mici permite o fixarea rapida. Fixarea optima durează 24 de ore după care pot fi inactivaţi epitopii (locul in care se fixează anticorpii). Fixarea care depaseste 48 de ore inactivează majoritatea epitopilor, determinând posibile reacţii negative sau reacţia pozitiva paradoxala. -Fixatorul optim este formolul tamponat sau paraformaldehida. Includerea se face in parafina histologica purificata -Secţionarea presupune efectuarea de sectiuni subtiri de 5 microni care vor fi intinse pe lame degresate. -Prelucrarea histologica obisnuita pentru deparafinare. -Reacţiile IHC se bazează pe legătura Ag-Ac, situsul legării cu Ac fiind identificat fie prin marcarea directa a Aglui, fie printr-o metoda secundara de legare, prin intermediul unui lanţ de alte legături, cu Ac marcaţi prin reacţie indirecta cu 2 sau mai multe faze. -Se lucreaza cu anticorpi monoclonali, de care sunt legate una sau mai multe molecule enzimatice, ce catalizeaza transformarea unui substrat incolor intr-un produs de reactie colorat. Enzima este cuplata covalent cu portiunea Fc a anticorpului; pe ea se plaseaza substratul cromogenic. -Enzimele utilizate sunt : a.peroxidaza b.fosfataza alcalina -Substratele folosite sunt :
a.DAB (brun) sau AEC (rosu) pentru peroxidaza b.“fast red” si “fast blue” pentru fosfataza alcalina Antigenele (Ag) Antigenele sunt substanţe care determină din partea organismului un răspuns imun, cu producerea de anticorpi (Ac). Antigenele trebuie sa aibă 2 proprietăţi principale: -imunogenitate – capacitatea de a induce formarea Ac şi - reactivitate specifică – cu anticorpul a cărui formare a indus-o antigenul însuşi. Pot fi : · antigene de diferenţiere care pot fi prezente in celule embriofetale (HCG, AFP, CEA), in celule adulte normale si in celulele corespondente tumorale (filamente intermediare ale citoscheletului sau molecule de adeziune intercelulara); · antigene de citotip molecule de tip secretor (alfalactalbumina, caseina), molecule de tip neuroendocrin (cromogranin, neuronspecific enolaza), hormoni; · oncogene si produsele lor implicate in oncogeneza (p53, cerb2), cu implicaţii in tratamentul genetic al tumorilor; · factori de proliferare evidenţiabili cu IMH (Ki67, PCNA), utili intro Monitorizare mai atenta a terapiei din unele tumori, terapie altfel foarte agresiva; · antigene virale si microbiene (HPV, CMV, Pneumocistis carinii) Anticorpii (Ac) Anticorpii sunt imunoglobuline produse de plasmocite, după recunoaşterea unui Ag străin. Dintre cele 5 clase de imunglobuline, Ig G sunt cele mai frecvent utilizate in IMH. Anticorpii policlonali se produc prin imunizarea unui animal cu o molecula purificata specifica (imunogen) care conţine antigenul de cercetat. Ac monoclonal este caracterizat printr-o specificitate mare si cunoscuta pentru un antigen. Reactia dintre un Ag (sau un epitop al sau) si un Ac este nu numai foarte specifica ci si foarte stabila; formarea acestor complexe imune sta la baza identificarii componentelor antigenice celulare 5.Metode IMH (imunohistochimica) · metoda directa se foloseşte un substrat cromogen ataşat la Ac primar, direct împotriva Ag pe care vrem să-l evidenţiem tehnica este simplă, dar sensibilitatea ei este redusă si nu permite o diluare excesiva a anticorpului primar · metoda indirecta are 2 sau mai multe faze, foloseşte un substrat cromogen care este ataşat la Ac II; Ac I nemarcat, este legat in porţiunea sa Ag, de un Ac II marcat cu peroxidaza de care este legat un sistem de relevare aceasta tehnica este mai sensibila permite vizualizarea Ag existente in concentraţii mici. Pe de alta parte Ac I anti specie (antisoarece,antiiepure, anticapra ) sunt puţin numeroşi si de aceea mai uşor de obţinut. Marcajul vizual Existenta mai multor cromogeni, diferit colorati, pentru o anumita enzima permite colorarea succesiva cu diferiti Ac si pentru localizarea mai multor Ag pe aceeasi sectiune.
In toate cazurile in care se utilizeaza un sistem oarecare de imunperoxidaza, cromogenul preferabil este 3,3’ diaminobenzidina (DAB) ce determina o coloraţie maro. Alt cromogen este aminoetilcarbazolul (AEC), ce determina un precipitat roşu. -Metoda ABC: (dupa Hsu et al., 1981, modificata de G. Bussolatti & P. Gugliotta, 1983) In prima etapa, Ac primar se cupleaza cu Ag dorit; in a doua etapa de Ac primar se leaga un Ac secundar, marcat cu biotina In a treia etapa, se introduce un reactiv cu mai multe molecule de avidina marcata cu peroxidaza La locusul antigenic se leaga un complex cu multe molecule de peroxidaza, intensitatea reactiei cromogene va fi accentuata si sensibilitatea metodei mare -Metoda dextranului (DAKO EnVisionTM Systems, 1996) Permite cuplarea unui mare numar de molecule enzimatice pe un schelet polimeric de dextran hidrosolubil; cu acest complex se pot cupla Ac secundari Se obtine astfel un reactiv care poate fi utilizat in cadrul unei tehnici in 2 timpi, care aduce o mare cantitate de enzime la locul reactiei si va creste foarte mult sensi-bilitatea detectarii Ag dorit 6.Tipuri de anticorpi si antigene decelati prin metoda imunohistochimica Anticorpii anti-melanom utilizati în laborator sunt: HMB45, Melan-A, S-100, Nestinã, MAGE, vimentina, citokeratinã,NSE, p-53, ki-67, PCNA. S-100: este anticorpul cel mai vechi si intens utilizat având sensibilitate crescutã dar fiind putin specific; marcheazã leziunile melanocitare atât benigne cât si maligne, nuclear si citoplasmatic.Sunt foarte rare cazurile când într-o tumorã melanocitarã S-100 este complet negativ(ex. unii nevi albastri celulari). MelanA: este un anticorp monoclonal ce marcheazã 80-90% din melanoame; marcajul este citoplasmatic. De subliniat cã melanocitele normale cât si unele celule nevice epidermice sau dermice sunt pozitive la imunomarcaj. MelanAeste negativ în cazul diferentierii neuroide(neuronevus) si în melanomul cu celule fuziforme sau în cel desmoplastic. Citokeratina: este negativã în celulele melanoamelor. Au fost raportate cazuri de melanoame maligne ce au prezentat pozitivitate focalã pentru acest marker. NSE (Enolaza Neuron Specificã): este pozitivã în melanoame; marcajul este citoplasmatic. Afost propusã ca marker al diferenþierii neurale si neuroendocrine în tumori. În practicã, în marea majoritate a cazurilor, diagnosticul unei tumori melanocitare (pigmentatã sau acromicã) nu necesitã decât o bunã coloratie standard (HE), dacã existã activitate de jonctiune. Imunohistochimia este utilã în cazul tumorilor melanocitare acromice pentru a putea fi etichetatã corect histogeneza; dacã existã discordantã între
imunomarcaj si morfologie,aceasta din urmã va fi privilegiatã prin lumina diagnosticului clinic. Markeri imunohistochimici in tumorile epiteliale benigne CITOKERATINE - proteine ale citoscheletului epitelial – dupa catalogul lui MOLL sunt descrise 20 de tipuri de CK: -CK acide (I) (9-20) / bazice (II) (1-8) -CK cu GM mare (1, 2, 3, 9, 34-beta/E12) (celule bazale din epitelii stratificate) -CK cu GM mica (8, 18, 19, 20): epitelii simple cubo-cilindrice ANTIGENE de membrana epiteliala (EMA, HMFG2, BerEP4, B72.3): epitelii glandulare Tumorile stromale gastrointestinale, în literatura anglo-saxonă – GIST, constituie un grup relativ nou de neoplasme ale tractului digestiv, studiului cărora i se atribuie o importanţă majoră, deoarece problemele legate de diagnosticul, evoluţia şi tratamentul lor rămîn a fi actuale pînă în prezent. -Pentru a le delimita, în 1983 a fost propus termenul de GIST – gastrointestinal stromal tumors, de către Mazur şi Clark , care era incert şi nu presupunea markeri tumorali specifici. Ulterior studiile imunohistochimice au determinat antigenul membranar CD34 drept marker important al GIST, deși existau numeroase tumori similare cu CD34 – negativ. Avînd o localizare diversă, GIST prezintă un tablou clinic nespecific, deseori fiind descoperite accidental imagistic sau intraoperator. Toate tumorile stromale gastrointestinale, indiferent de localizare (esofagiana,stomacala,retroperitoneala), se pot complica prin sindrom subocluziv, ocluziv, perforaţie cu hemoragie, care nece-sită intervenţii chirurgicale de urgenţă. -La examenul imunohistochimic sunt relevante următoarele date: CD117 este pozitiv în peste 95% cazuri din GIST. El nu poate fi privit ca unicul marker al lor, din cauza expresiei sale în alte tumori de tipul limfomului anaplastic cu celule mari, fibromatozei, mastocitozei, sarcomului sinovial, rabdomiosarcomului, angiosarcomului, gliomului, germinomului, sarcomului Ewing, dar nu se întîlneşte în veritabilele tumori ale musculaturii netede sau ţesutului nervos. Astfel nu toate tumorile care exprimă KIT sunt GIST, acest antigen fiind util în diferenţierea lor faţă de alte tumori mezenchimale . Recent a fost determinat alt marker al GIST - DOG1.1, care este pozitiv în toate tumorile stromale, chiar şi în acele KIT-negative sau cu mutaţii. Multe din GIST exprimă şi nestin (90%), CD34 (60-70%). Alţi markeri imunohistochimici care se pot depista în GIST sunt: SMA (smooth muscle actin - 20-40%), h-caldesmon, CD44, vimentin, proteina S-100 (<5%), desmin (<2%) [10, 13-15]. Prezenţa antigenului CD34 este considerată un factor de pronostic nefavorabil, comparativ cu cea a CD44 . Markeri utilizaţi pentru tumorile mamare: - Markeri ai celulelor mioepiteliale: actina specifica muschiului neted (SMA), calponina, proteina p63; - Markeri epiteliali: citokeratinele (CK): CK 5/6, CK 7, CK8, CK 19, 34βE12, MNF 116; - Markeri pentru angiogeneza tumorala: CD105, VEGFR 1, VEGFR 2; - Alti markeri: caderina E, proteina S 100, vimentina, CD34, CD10, CD31, CD117, Mucina 1 (MUC 1); Ciclina D1;
- Factori prognostic: receptori estrogenici, receptori progesteronici, proteina de crestere tumorala c-erbB2, proteina BRCA 1, proteina p53; Factori de proliferare: Ki 67, PCNA. TUMORI DE TESUTURI MOI (MEZENCHIMALE): a. DIAGNOSTICUL POZITIV şi DIFERENŢIAL (stabilirea fenotipului tumoral al diferitelor tipuri de tumori stromale: fibrosarcom, angiosarcom, neurofibrom, tumora de teaca de nervi periferici, sarcom stromal; a tipului tumoral benign vs. malign) – se efectuează următorii markeri, pe lângă o parte din cei enumeraţi mai sus: - pentru tumorile stromale: Vimentina, S 100, CD 34, CD 117, - pentru tumorile neuroendocrine: Cromogranina, Sinaptofizina, - pentru tumorile musculare: Actina Muschiului Neted (SMA), Desmina, Calponina, - pentru tumorile vasculare: CD31, CD34, Factorul VIII, - pentru tumorile de nervi periferici: Proteina Gliala Fibrilara Acida (GFAP), Neurofilamente, Enolaza Neuronal Specifica (NSE), - pentru tumorile mezoteliale: Calretinina, Antigenul de Membrana Epiteliala (EMA), Citokeratina 5/6. b. FACTORI DE PROLIFERARE SI PROGNOSTIC: Ki 67, PCNA, p53. TUMORI PULMONARE: a. DIAGNOSTICUL POZITIV şi DIFERENŢIAL - se efectuează următorii markeri IHC: - Citokeratinele (CK): 7, 20, AE1/AE3, 5/6, 34βE12, - Antigenul de Membrana Epiteliala (EMA), - Antigenul Carcinoembrionar (CEA), - Proteina p63, proteina S 100, Factorul de transcriptie tiroidian (TTF 1), Mucina 2 (MUC 2). b. FACTORI DE PROLIFERARE SI PROGNOSTIC: Ki 67, PCNA, p53. c. FACTORI PREDICTIVI: Factorul de crestere al endoteliului vascular (VEGF). Pentru diagnosticul pozitiv şi diferenţial al METASTAZELOR CU PUNCT DE PLECARE NEPRECIZAT: a. Identificarea TIPULUI HISTOLOGIC: - Citokeratina 7, 20, MNF 116, 5/6, 19 – pentru adenocarcinom, - Citokeratinele AE1/AE3, citokeratina 34βE12 – pentru carcinom scuamos, - Markeri mezenchimali – pentru tumori mezenchimale (vezi mai sus), - Markeri melanocitari (melanom malign vs. nev Spitz): HMB 45, Melan A, CD 44, - Markeri pentru limfoame. b. Identificarea PUNCTULUI DE ORIGINE AL CELULELOR TUMORALE: - CA 125 - tumori de col uterin, tumori ovariene, - CK 7, CK 20 – tumori gastrointestinale, - CK 7 + Receptori estrogenici, Receptori progesteronici – tumori mamare, tumori endometriale, - TTF 1, Tiroglobulina – tumori pulmonare, tumori tiroidiene,
- α-Fetoproteina (α-FP), Gonadotropina Corionica Umana (GCH) – tumori de cordoane sexuale, - CA 19 -9 – tumori pancreatice. Pentru unele tipuri de LIMFOAME se efectuează: - pentru limfoame maligne non-Hodgkiniene: antigenul comun leucocitar (CLA), CD45RO (marker pentru limfocitele T), CD20 (marker pentru limfocitele B), CD57, CD4, CD8, proteina bcl-2 (antiapoptotica), - pentru limfomul Hodgkin: CD15 si CD30. 7.Rezultatele examenului imunohistochimic au fost utile în determinarea prognosticului, în selecţia pacienţilor cu risc crescut, în alegerea terapiei specifice dependente de caracteristicile tumorale şi individuale ale pacienţilor ca şi în dezvoltarea de noi metode terapeutice direcţionate pe ţinte moleculare. -Din studiile efectuate rezultă că examenul imunohistochimic tinde să devină cu mult succes un examen de rutină, absolut indispensabil pentru monitorizarea cazurilor de carcinom mamar. -Ceea ce în trecut reprezenta doar un domeniu de cercetare, aplicat sporadic din cauza dificultăţilor tehnice şi a costurilor mari, astăzi face parte din arsenalul investigaţiilor morfologice cu implicaţii clinice importante.
