TEMA5. DIAGNOSTICO DE VESTIGIOS DE SANGRE EN EL LABORATORIO DE BIO IOL LOGÍA FORENSE. PRUEBAS DE ORIENTACIÓN Y CERTEZA, TÉCNICAS ANALÍTICAS DE ELECCIÓN. INTERPRETACIÓN Y SU VALORACIÓN BIOLÓGICA FORENSE. Actualmente se estudia un número suficiente de marcadores para distinguir unas muestras de otras. La mayoría de laboratorios forenses utilizan los mism mismos os ma marc rcad ador ores es co con n el fin fin de inte interc rcam ambi biar ar dato datoss sin sin tene tenerr que que reanalizar las muestras.
CONCEPTO DE MUESTRAS DUBITADAS E INDUBITADAS I NDUBITADAS Para que una pericia genético biológica sea concluyente es imprescindible desarrollar el análisis en dos tipos de muestras: a)
son rest restos os biol biológ ógic icos os de Muestr Muestras as dub dubita itada das s o evide evidenci ncias as: son
procedencia desconocida, es decir, no sabemos a quién pertenecen (por ejemplo las muestras muestras recogidas en la escena del delito o de un cadáver cadáver sin identificar). b)
Muestras indubitadas o de referencia: son restos biológicos de
procedencia conocida, es decir, sabemos a quién pertenecen (por ejemplo la tomada de un cadáver cadáver identific identificado ado,, o las muestras muestras tomada tomadass a sangre tomada familiares de un desaparecido). La analí analíti tica ca de ADN se ha deno denomi mina nado do en múlt múltip iples les oc ocas asio iones nes «hue «huella lla genética»; este término no debe llevarnos a confusión pues, si bien es verdad que cada individuo presenta un ADN diferente (como en el caso de las las huel huella lass dact dactil ilar ares es), ), no exis existe te una una base base de dato datoss form formad ada a por por las las características genéticas de cada individuo que vive en España (a diferencia de la huella dactilar, de la cual existe un registro del índice derecho de todas las persona con DNI). Por este motivo, sólo podremos identificar las evidenc evidencias ias biológ biológica icass si dispon disponemos emos de muestr muestras as de referen referencia cia para para su comparación. Loss tipo Lo tiposs de mues muestr tras as dubi dubita tada dass má máss frec frecuen uente teme ment nte e anali analiza zada dass por por técnicas técnicas genético genético moleculares moleculares son: sangre (habitualmente en forma de manc ma ncha ha), ), seme semen n (lav (lavad ados os vagi vagina nale less o ma manc ncha hass sobr sobre e pren prenda dass de la
víctima), saliva (colillas de cigarrillo, chicles, sobres y sellos), pelos, uñas, tejid tejidos os bland blandos os,, resto restoss óseo óseoss y dent dentar ario ioss (est (estos os últim últimos os rela relaci cion onad ados os fundamentalmente con la identificación de cadáveres). El tipo de muestras indubitadas más habituales son sangre y saliva (frotis bucal). No es necesario que las muestras de referencia sean del mismo tipo que las evidencias, es decir, podremos comparar distintos tipos de restos biológicos entre sí ya que el ADN es igual (salvo excepciones) en todos tejidos de un mismo individuo. Podemos diferenciar tres etapas principales en el análisis de una muestra fore forens nse: e: (i) prue prueba bass prel prelim imin inar ares es para para det determi ermina narr la natu natura rale leza za y el organismo de procedencia de la muestra; (ii) análisis del ADN presente en la muestr muestra a con fines fines identi identific ficado adores res y (iii) (iii) anális análisis is e interp interpreta retació ción n de los resultados obtenidos.
Existen fundamentalmente preliminares:
tres
tipos
de
pruebas
a) Orientativas: se trata de técnicas que nos revelan la posible naturaleza de la mancha pero no nos la aseguran, es decir, sirven sólo para descartar, pero no para concluir. Por ejemplo, la llamada reacción de Adler es una sencilla prueba colorimétrica que si resulta positiva nos orienta a pensar que estamos ante una mancha de sangre, pero sin poder asegurarlo pues existen otras sustancias (jugos vegetales, óxido, lejía) que también dan positiva esta reacción. Si la prueba resulta negativa podremos asegurar que el resto que estamos analizando no es sangre. Estas pruebas son sencillas de realizar, son de bajo coste, muy rápidas, y nos ayudan a seleccionar las manchas a analizar. b) De certeza: nos permiten determinar el tipo de resto biológico analizado con co n segur egurid idad ad.. La detec etecci ción ón de hemo hemog globi lobina na en la mues muesttra para para determinación
de
sangre
o
la
visualización
al
microscopio
de
espermatozoides para la determinación de semen son algunos ejemplos. c) Específicas: nos nos perm permit iten en dete determ rmin inar ar el tipo tipo de orga organi nism smo o al que que pertenece el resto biológico. Una vez que hemos determinado el tipo de muestra que hemos de analizar, interesa saber si se trata de una muestra humana o no. Existen principalmente dos tipos de pruebas específicas: unas
basadas reacciones antígeno-anticuerpo y otras basadas en el estudio de ciertas regiones del ADN, si bien, en cierto tipo de muestras (pelos, restos óseos) óseos) puede realizarse realizarse un estudio estudio de las características características morfológicas morfológicas para determinar el tipo de organismo. En el caso de que nos encontremos ante una muestra de origen animal, normalmente los análisis terminarán en este punto a no ser que el objetivo sea precisamente precisamente determinar la especie especie (por ejemplo, en caso de delitos ecológicos y de caza furtiva). En el caso de muestras de origen humano se procederá a realizar la segunda etapa del estudio destinada a individualizar la muestra mediante técnicas de ADN. Conviene Conviene señalar señalar que en determinadas determinadas ocasiones ocasiones no es posible posible determinar determinar el tipo tipo de resto resto bioló biológi gico co halla hallado do por por la esca escasa sa ca cant ntid idad ad de mues muestr tra a disponible. En estos casos se suele proceder directamente a realizar los estudios de ADN para intentar individualizar la muestra.
ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Una vez que se ha finalizado el estudio molecular propiamente dicho se procede procede al análisis análisis de los resultados obtenidos. obtenidos. Podemos Podemos encontrarnos encontrarnos con dos situaciones: 1. Que dispongamos de muestras indubitadas de referencia para cotejar con las evidencias. 2. Que no tengamos acceso a muestras de referencia para comparar. En el caso de que nos encontremos ante la primera situación, el resultado de la comparación entre muestras dubitadas e indubitadas puede ser de dos tipos: 1.1 Coincidencia o compatibilidad: el perfil genético evidenciado en ambos tipos
de
muestras
es
coincidente
(crimina inalíst ística)
o
compatibl ible
(pat (patern ernida idade des) s) . En este este ca caso so se ha de valor valorar ar esta estadí díst stic icam amen ente te si la coincidencia es debida al azar o a que realmente la evidencia biológica pertenece al individuo de referencia. Es evidente que este análisis depende «a priori» del número de marcadores analizados analizados en las muestras muestras y una vez realizado el análisis, de lo frecuente o no que sean los alelos de cada marcador (por ejemplo, en el hipotético caso de que estudiáramos el grupo sanguíneo, el grupo 0 es muy frecuente en nuestra población por lo que este resultado se ha de valorar con menor «fuerza» que si obtenemos un
grupo AB, mucho menos frecuente). Por esta razón, los laboratorios analizan de rutina en cada muestra una batería de marcadores con elevado poder de discriminación. 1.2 No coincidencia o incompatibilidad: el perfil genético evidenciado en las muestras dubitadas no coincide con el de la muestra indubitada; o bien, en casos de paternidad, el supuesto padre no comparte alelos con el hijo (incompatibilidad). En estos casos no es necesario realizar una valoración estadística pues la exclusión se informa con seguridad. En los los ca caso soss dond donde e no disp dispon onem emos os de mues muestr tras as de refe refere renc ncia ia para para compar comparar ar con las evidenc evidencias ias podemos podemos introd introduci ucirr los perfil perfiles es genéti genéticos cos obtenidos en una base de datos de perfiles anónimos. Esto nos permitirá relacionar distintos delitos entre sí, facilitando así la investigación policial y judic judicial ial en hechos hechos reincid reincidente entess como como violaci violaciones ones y robos. robos. Actual Actualment mente e algunos laboratorios poseen sus propias propias bases de datos de evidencias, pero sería deseable que se unificaran criterios así como la información contenida en cada una de ellas con el fin de intercambiar datos de forma rutinaria. Por otro lado, en otros países ya existe una legislación sobre la introducción de perfiles genéticos de carácter indubitado relacionados con prácticamente todos o cierto tipo de delitos (según el país); en España sería necesario que existiera un marco legal con el fin de evitar la pérdida de información que proporcionarían dichos perfiles. Además de las bases de datos de perfiles genéticos anónimos obtenidos a partir de las evidencias, evidencias, existen existen bases de datos de perfiles procedentes procedentes de cadáveres sin identificar y de familiares de desaparecidos que dieron su consentimiento para el análisis de su ADN. Con estas bases de datos los laborat laboratori orios os preten pretenden den facilit facilitar ar la difícil difícil tarea tarea de identi identific ficar ar cuando cuando no existen otros medios que el análisis genético
PROBLEMÁTICA PROBLEMÁTICA DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS Ya Ya hemo hemoss vist visto o que, que, ac actu tual alme ment nte, e, para para dete determ rmin inar ar a qué qué indi indivi vidu duo o pertenece una muestra biológica, se recurre al estudio de sus polimorfismos de ADN y ya hemos descrito todas las fases analíticas que se han de realizar reali zar (ext (extra racc cció ión, n,
cuan cuanti tifi fica caci ción ón,,
ampl am plif ific icac ació ión n
y
tipa tipaje je), ),
pero pero
cree creemo moss
conveniente apuntar la problemática del día a día del laboratorio en las diferentes etapas del análisis de estos polimorfismos.
Las muestras indubitadas que pertenecen a individuos vivos no suelen dar prob proble lema mass en el anál anális isis is gené genéti tico co si fuer fueron on reco recogi gida dass y envi enviad adas as al labor laborat ator orio io en co cond ndic icio iones nes ópti óptima mas. s. Sin Sin embar embargo go,, las las evid eviden enci cias as co con n cará ca ráct cter er dubi dubita tado do pued pueden en sufri ufrirr una una serie erie de mo modi difi ficcac acio ione ness que que depen depende derá rán n no sólo sólo del del tiem tiempo po tran transc scurr urrid ido o hast hasta a el mo mome ment nto o de su estu estudi dio, o, sino sino de las las co cond ndic icio ione ness am ambi bien enta tale less a las las cual cuales es se vier vieron on sometidas, de la cantidad de muestra, del soporte en el cual se encuentran, del lugar de procedencia y del tipo de muestra biológica. De todos los tipos de muestras biológicas que se analizan diariamente en el laboratorio forense, quizá sean las de sangre las más agradecidas. Sin embargo algunas veces también dan problemas. podemo moss halla hallarl rla a bien bien en esta estado do líqu líquid ido o o en forma forma de La sangre sangre pode manc ma ncha ha.. La sangr sangre e líqui líquida da bien bien co cons nser erva vada da no ofrec ofrece e ning ningún ún tipo tipo de problema, pero no es raro que al laboratorio llegue sangre putrefacta bien porque se ha estropeado durante el transporte o bien porque pertenece a un cadáver en el cual se ha iniciado la descomposición. Para evitar el primer problema es conveniente realizar una mancha sobre una gasa antes de proceder al transporte de la muestra y para el segundo no queda más remedio que tratar de buscar otra muestra para el análisis, bien sea un teji tejido do bland lando o, uña uñas, o un res resto óseo óseo,, dep depend endiend iendo o del del est estado ado de conservación del cuerpo. Por el contrario, la sangre en forma de mancha se cons co nser erva va má máss fáci fácilm lmen ente te y pued puede e anal analiz izar arse se tras tras vari varios os años años si las las condiciones de secado fueron adecuadas. Quizá las manchas sobre cueros, maderas tratadas, restos vegetales y tierras sean de las más críticas pues esto estoss ma mate teria riales les tien tienen en difer diferen ente tess grad grados os de abso absorc rció ión n y en ellos ellos se encuentran presentes gran cantidad de inhibidores de la PCR como los taninos, que impiden que la reacción funcione. La investigación de manchas de sangre sigue ocupando un lugar preferente en Criminalística. Tradicionalmente, se ha venido realizando un sistema de investigación que incluye la realización de los siguientes diagnósticos [1]: 1.- Orientación. 2.- Certeza. 3.- Especie.
4.- Individual (grupos, ADN, sexo). 5.- Otros (antigüedad, lugar de procedencia, etc.).
MANCHAS: Según la clasificaciónde Simonin se dividen en: . Manchas de proyección . Manchas de escurrimineto . Manchas de contacto . Manchas de impregnación . Manchas de limpieza ASPECTO: Ennegrece con el tiempo. Si no son visibles se emplea Luminol. Ventajas Efecto luminiscente en la oscuridad. No altera la mancha. Luego puede seguir su análisis sin ningún problema. Desventajas Sensib Sensible le al tiempo tiempo (usar (usar inmedia inmediatam tament ente e
a la prepara preparació ción). n). Produc Producto to
comercial (costo elevado
PRUEBAS DE CERTEZA Específicas y poco sensibles. Manifiesta elementos formes o hemoglobina. 1. Técnicas Técnicas microsco microscopicas: picas: muestra muestra elemento elementoss formes de la sangre. sangre. 2. Tecnicas Tecnicas microquimica microquimicass o cristalogra cristalograficas. ficas.
Cristales deTeichman
Cristales deTakayama (En caso Teichman sea negativo)
3. Téc Técnic nicas as crista cristalog lográf ráfica icas: s: 4. Técnicas Técnicas Espectrof Espectrofotométr otométricas: icas: Espectr Espectro o de absorción absorción de hemoglobina hemoglobina
5. Tecnicas Tecnicas cromatografic cromatograficas: as: Pruebas Pruebas fisico-quimic fisico-quimicas as de la hemoglobina. hemoglobina.
PRUEBAS DE ORIENTACION Muy sensibles Carecen de especificidad Presencia de lasperoxidasas de la sangre
Sangre (enzima) + H2O2=H2O+ O (+ leucobase= base coloreada)
1. Reacción de Adler
BECIDINA
SANGRE
ACIDO ACETICO GLACIAR AGUA OXIGENADA Azul intenso
La prueba de Adler tiene como fundamento la oxidacion, basada en a pres presen enci cia a de perox peroxid idas asas as (col (color or verde verde o azul azul,, co con n benc bencid idina ina y ác ácid ido o acético glacial)
2. Reaccion de Van deen Resina de Guayaco
sangre
Alcohol de 95 Agua oxigenada
azul intenso
El método de guayacol fue desarrollado por Van Deen en 1864 para detectar sangre oculta. Boas oas come comenz nzó ó a usar usar este este méto método do en 1901 1901 para para diagnosticar sangrado gástrico. La reacción de Van Deen (con tintura de guayaco y agua oxigenada, color azul
REACCION DE KASTLER MEYER Fenolftaleina Hidroxido de potasio
sangre
Polvo de zinc Alcohol etilico absoluto Agua destilada
r oj o
Agua oxigenada
REACCION DE MEDINGER Verde malaquita
sangre
Acido acetico glacial Agua destilada Agua oxigenada Con verde de malaquita, forma leuco, recuperación del color verde)
REACCION DE LAS CATALASAS Agua oxigenada con sangre burbujas
Las muestras de saliva no suelen presentar problemas en la analítica de ADN. Suelen llegar al laboratorio en forma de mancha, sobre filtros de cigarrillo, sellos, chicles o prendas (por ejemplo la zona coincidente con la boca en un pasamontañas utilizado en un atraco) o bien en soportes más engorrosos como vasos, botellas o huesos de fruta. En las muestr muestras as de esperma de los los ca caso soss de agre agresi sion ones es sexua sexuales les,, el principal problema es que además de los espermatozoides del agresor se suele encontrar presente otro tipo celular procedente de la víctima, las células del epitelio vaginal. Por ello, a la hora de analizar estas muestras nos encontraremos con una mezcla de perfiles genéticos. Es de gran ayuda disponer de una muestra indubitada de la víctima con el fin de identificar qué alelos pueden proceder de la víctima en la mezcla evidenciada. El análisis de ADN a partir de muestras de pelos es más delicado que a partir partir de los restos restos biológ biológico icoss anterio anteriores res.. Estas Estas muestr muestras as requier requieren en un análisis microscópico previo a la analítica molecular con el fin de determinar el tipo de análisis que es posible en ellos (estudios de ADN nuclear o de ADN mitocondrial) además de otras características importantes. Con el análisis microscópico se determinan, entre otros, los siguientes puntos: – Si se trata de pelos de origen animal o humano. – Si se trata de pelos completos (con bulbo) o de fragmentos de pelos (sin bulbo). bulbo). En el caso de fragmentos fragmentos de pelos los estudios estudios a realizar realizar son los de ADN mitocondrial como veremos en el siguiente apartado. En el caso de los pelos con bulbo se puede determinar en qué fase vital se encuentra éste. En los pelos con bulbo telogénico (en fase de caída) se suele realizar análisis de ADN mitocondrial y en los pelos con raíz anagénica (en fase de crecimiento) se puede realizar un análisis de ADN nuclear. – Visualizar el grado de suciedad que presentan los pelos y si aparecen restos de posible sangre adheridos a los mismos. En el caso de presentar sang sangre re se ha de proc proced eder er a la sepa separa raci ción ón de am ambo boss tipo tiposs de rest restos os biológicos para su análisis por separado, pues puede tratarse de muestras pertenecientes a diferentes personas.
En cuanto a las muestras de uñas diremos que se trata de una muestra muy agradecida pues suele dar resultados positivos en la mayoría de los casos. Las uñas pueden interesarnos fundamentalmente por dos motivos: Como Co mo mues muestr tra a biol biológ ógic ica a indu indubi bita tada da para para la ident identifi ifica caci ción ón ca cada davér véric ica a (anali (analizan zando do la propia propia uña) uña) cuando cuando no es posibl posible e una identi identifica ficació ción n por métodos no genéticos, o como lugar de búsqueda de restos biológicos si en un hecho delictivo medió lucha. Las muestras de tejidos también suelen estar relacionadas sobre todo con la identificación de cadáveres en los que han comenzado los procesos de putrefacción. Los mejores resultados se obtienen con músculo
Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tier (tierra ra,, suel suelo, o, piedr piedras as,, pared paredes es.. ...) .).. El estu estudi dio o de la mo morfo rfolog logía ía de las manchas en la escena del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.
La herramienta de elección es la individualización genética por lo que que los labo labora rato torio rioss de Biolo Biologí gía a Foren Forense se ac actu tual ales es está están n alta altamen mente te especializados en Genética Molecular.
RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO Toma de muestras de sangre. RECOGIDAS DE INDICIOS. Muestras de sangre y/o saliva. Identificación Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo de anális análisis is más solicit solicitado ado en el laborat laboratori orio o de biolog biología ía forens forense. e. Todos Todos los indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos deben deben ser ser obje objeto to de un minu minuci cios oso o y exhau exhaust stivo ivo estu estudi dio o que que permi permita ta localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en func funció ión n de las las ca cara ract cter erís ísti tica cass del del suce suceso so inve invest stig igad ado. o. Lo Loss vest vestig igio ioss biológ biológico icoss más frecuen frecuentes tes son los restos restos de sangre, sangre, fluido fluidoss semina seminales les,, fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en uñas.
Estudi Estudios os comple complemen mentar tarios ios en casos casos de muerte muerte por por sumer sumersió siónnsiempr pre e que que se recu recupe pera ra un ca cadá dáve verr del del agua agua o cuan cuando do se asfixia: siem sospecha que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesa necesario rio confirm confirmar ar los datos datos macros macroscóp cópico icoss obteni obtenidos dos en la autops autopsia ia mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia existencia de hidremia hidremia ( hemodilución hemodilución de la sangre sangre del ventrículo izquierdo izquierdo respecto de la del derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión.
Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en otro otross fluid fluidos os fisi fisiol ológ ógic icos os,, tales tales co como mo la urea urea o crea creati tini nina na,, tamb también ién presentes en sudor, sangre, saliva, semen pero en menor concentración. Cont Co ntien iene e cé célu lula lass epit epiteli elial ales es del del trac tracto to urin urinar ario, io, así así co como mo leuco leucoci cito toss y eritrocitos, muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de orina es muy baja. Además, Además, la flora bacteriana bacteriana propia de la orina acelera los procesos de degradación en la muestra. De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto de anál anális isis is,, todo todo el proc proces eso o anal analít ític ico o se pued puede e divi dividir dir en tres tres gran grande dess bloques: EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.
Extracción de ADN Posible Posiblement mente, e, de los tres tres bloques bloques citado citadoss anteri anteriorm orment ente, e, la extracc extracción ión constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte, siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para resolver un delito. Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden dividir en tres grupos:
a) Aquel Aquel que comprende comprende una digestión digestión,, una extrac extracció ción n orgáni orgánica ca y una purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de interés forense. b) Aque Aquell que que com ompr pren ende de una etap etapa a de dige digesstión tión segui eguida da de una prec precip ipit itac ació ión n co con n etan etanol ol.. Se usa, usa, princ principa ipalm lment ente, e, para para obte obtene nerr much mucha a cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado. c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a muestras de sangre líquida.
La importancia de las manchas de sangre es conocida por todos, por la frecuencia en el lugar del hallazgo (1) y la gran cantidad de datos que pued pueden en prop propor orci cion onar ar:: có cómo mo han han suce sucedi dido do los los hech hechos os,, cuál cuál ha sido sido la cronología de los mismos, cuántas personas han intervenido, qué objetos se han utilizado, identificación del agresor o agresores, de las víctimas, cuál ha sido la causa de la muerte. Las muestras biológicas criminales, entre las que destacan las manchas de sangre, tienen las siguientes peculiaridades (2), respecto a otro tipo de muestras como son las clínicas:
Son escasas en concentración; puesto que la cantidad de sangre no es la que solicita o desea el investigador, sino que ésta viene dada por las caract caracterís erístic ticas as del hecho hecho invest investiga igado: do: número número de víctima víctimas, s, número número de autore autores, s, tipo tipo de agresi agresión, ón, manipu manipulac lación ión poster posterior ior,, etcéter etcétera a Están Están mal
conservadas: las muestras recogidas para estudio criminal por norma han esta estado do expu expues esta tass a circ circun unst stan anci cias as am ambi bien enta tale less o a ma mani nipu pula laci cion ones es intencionadas que influyen en el estado de conservación. Estarán tanto peor conservadas, cuanto más expuestas al ambiente externo hayan estado o más manipulaciones hayan soportado.
Degradadas: En directa relación con la conservación y más en concreto con las posibles acciones directas sobre las muestras, se encuentra el hecho de que se deteriore el material biológico o lo que es lo mismo, que se degr degrad ade, e, de mo modo do que que sea sea much mucho o má máss difí difíci cill alca alcanz nzar ar los los obje objeti tivo voss planteados en la investigación. En el mejor de los casos, la toma de la
muestra se hará en un periodo que se puede contar en horas, en otros, se hablará de meses, incluso años. El tiempo constituye por sí solo un factor en contra de la investigación de las muestras biológicas. exposic ició ión n del del ma mate teria riall bioló biológi gico co al am ambie bient nte e o a Contaminadas: La expos acciones externas determina que puedan contaminarse, es decir, incorporar material biológico o no biológico, que influya en los resultados. Y siempre irrepetibles: lo que diferencia fundamentalmente las muestras biológ biológica icass judicia judiciales les del resto resto es que son irrepet irrepetibl ibles es e irrepro irreproduc ducibl ibles, es, excepto excepto cuando cuando se trata trata de muestr muestras as indubi indubitad tadas as proced procedente entess de una víctima viva o del agresor, también vivo. Así pues, los restos biológicos dejan de tener unas condiciones estables y de control control cuando cuando abandonan abandonan el organismo organismo del que proceden. Las condiciones condiciones a las que se verán expuestos son peores y se consideran adversas, en espe especi cial al debi debido do a las co cond ndic icio ione ness medio medioam ambie bient ntal ales es,, temp tempera eratu tura ra y humedad, a la exposición a sustancias químicas o de microorganismos, hongos y bacterias, etc. que pueden degradar el indicio o bien pueden inhibir los análisis (3) En el caso de las manchas de sangre, el estudio tradicional de este tipo de incl incluy uye e los los sigu siguie ient ntes es diag diagnó nóst stic icos os:: gené genéri rico co -de -de orie orient ntac ació ión n y de conf co nfir irma macciónión-,, de esp espec ecie ie,, indi indivi vidu dual al (gru (grupo poss, ADN ADN, sexo sexo)) y otro otross (antigüedad, lugar de procedencia, etcétera). El primero engloba tanto las pruebas denominadas de orientación como las de confirmación o certeza. Si bien bien ac actu tual alme ment nte e en los los labo labora rato tori rios os fore forens nses es se suel suele e real realiz izar ar un diagnóstico simultáneo genérico y específico, mediante el uso de los kits comerciales comerciales de detección detección de hemoglobina hemoglobina humana, no hay que olvidar que este tipo de indicio se debe buscar en todas las escenas criminales; que unas veces serán evidentes a simple vista y otras, por su baja concentración o por degradación, necesitarán de medios de búsqueda y de puesta en evide evidenc ncia ia.. El desc descub ubrim rimien iento to de una una ma manc ncha ha en el lugar lugar estu estudi diad ado o no implica que sea de sangre, por lo que resulta fundamental determinar cuál es su naturaleza (6) y, por tanto, realizar un estudio genérico sobre las mismas. Este trabajo sigue la línea de investigación que iniciaron el profesor Verdú y la profesora Gisbert en 1995 (7), continuada con la tesis doctoral de la
profesora profesora Castelló Castelló (1) y co con n la publ public icac ació ión n en 2003 2003 del del estu estudi dio o de la fiabilidad de las pruebas de orientación sobre manchas contaminadas con distintos productos (6, 8) En realidad no se pretende valorar cómo influye la contaminación en muestras recientes, sino cómo afecta la degradación que se produce con el paso del tiempo y con la exposición a factores ambientales (8). Así pues, se trata de comprobar la utilidad de las pruebas de
orie orient nta ación ción
sobre obre
manc ma ncha hass
som omet etid idas as
a
disti istint ntas as co cond ndic icio ione ness
ambientales y en distintos soportes, en especial si se afecta la sensibilidad del luminol y si influye el soporte. También se valora si el empleo de luces puede mejorar la visibilidad de las manchas latentes.
Material y método Obtención de la muestra La sangre se obtuvo por venopunción y no se le añadió ningún conservante. Las manchas se formaron al depositar una gota de sangre sobre el soporte seleccionado. Dado que es imposible simular en laboratorio todos los soportes sobre los cuales puede haber una mancha de sangre, sangre, pues las escenas escenas delictivas son tan tan vari variab able less co como mo dive divers rso o es el plane laneta ta y tras tras valo valora rarr todas odas las las posibil posibilidad idades, es, se selecc seleccion ionaro aron n los siguie siguiente ntess materia materiales les,, siguie siguiendo ndo un crit criter erio io lógi lógico co y de frec frecue uenc ncia ia de pres presen enta taci ción ón en nues nuestr tro o ento entorn rno o inmediato: — Dos superficies impermeables: acero y hierro (placas metálicas de 3 x 3 y 4 x 4 cm) — Ocho soportes porosos: dos tipos de azulejos, uno más rugoso y otro con una superficie menos porosa; telas de distintos distintos tipos: vaquera, de algodón, algodón, sintética blanca y sintética estampada, también tela de rizo (toalla) y, por último papel (pañuelos de celulosa).
Reactivos: Fenolftaleína (PHENOLPHTHALEIN DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No. DCB100) Leucomalaquita verde (Leuco-Malachite DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No. DCB200) Luminol (Merck) Carbonato potásico (Panreac) Perborato de sodio (Panreac)
Agua destilada Para la preparación del reactivo Luminol se siguieron las instrucciones del laboratorio y los métodos descritos en la bibliografía (9).
Procedimiento para la preparación de la muestra: Sobr Sobre e los los difer diferen ente tess sopo soport rtes es se forma forman n ma manc ncha hass de sang sangre re sin sin dilui diluir, r, dejando caer una gota con una pipeta Pasteur. En el caso de los soportes impermeables y de los azulejos, se depositó la gota sobre la superficie y se extendió con una espátula con el fin de obtener una fina película y evitar la escasa adherencia debida a la forma de la gota. En los soportes porosos la sangre formó una mancha, con bordes más o menos difusos y extensión variable según el soporte. Se observó que la tela sintética estampada era poco absorbente, por lo cual la mancha formaba una costra inicial sobre la superficie. Una Una vez vez seca seca la sang sangre re,, las las mues muestr tras as se han han some someti tido do a dife difere rent ntes es condic condicion iones es ambient ambientale ales. s. Es necesa necesario rio precis precisar ar que depend dependien iendo do de la naturaleza del soporte, soporte, se ha seleccionado las condiciones ambientales, en las que se ha mantenido la muestra. Así, Así, la distribución resultó como sigue:
1. Sumergidas en agua. Se han sumergido todos los soportes excepto los azulejos, puesto que simulan el suelo o revestimiento y, por tanto, no van a estar sumergidos en condiciones reales. Todos los soport soportes es excepto excepto los azulejo azulejos, s, por la misma misma 2. Enterrado Enterrados. s. Todos razón.
3. En el resto de condiciones (aire libre a cubierto, aire libre a descubierto y laboratorio) han estado todos los l os soportes. Se depo deposi sita taro ron n tamb tambié ién n mues muestr tras as co cont ntro roll de ca cada da tipo tipo de sopo soport rte e y condición ambiental.
Procedimiento experimental Los soportes se recogieron después de haber estado expuestos el tiempo predeterminado (5, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 80 y 125 días). Los soportes húmedos se dejaban secar y se guardaban en sobres de papel para el transporte al laboratorio. El periodo transcurrido desde la recuperación de los soportes y el estudio en el labo labora rato tori rio o no ha sido sido fijo fijo,, sino sino que que ha vari variad ado o en func funció ión n de la disponibilidad de tiempo. En realidad, en los laboratorios de investigación, el tiem tiempo po que que tran transc scur urre re tamb tambié ién n varí varía a en func funció ión n de las las co cond ndic icio ione nes, s, exigencias, necesidades, etcétera. no sólo del laboratorio sino también la trascendencia judicial.
Pruebas de orientación:
Ya en el laboratorio, el método de estudio ha sido el habitual en el caso de manchas de sangre: 1º Obse Observ rvac ación ión direc directa ta,, co con n luz luz blanc blanca a co con n disti distint ntos os filt filtro ross y co con n luz luz ultravioleta. 2º Preparación de la muestra previa a la aplicación del reactivo. Cuando Cuando sobre sobre el soport soporte e impermea impermeable ble aparec aparecía ía una mancha mancha visible visible de sangre, se procedía al raspado de la costra en un tubo eppendorf que contenía suero fisiológico. Posteriormente se depositaban tres gotas de la dilución sobre un hisopo y se realizaba la prueba. Cuando la mancha no era visible, se procedía a la obtención de una «huella» mediante un hisopo hidratado con agua destilada con el cual se limpiaba el soporte; la prueba de orientación elegida se realizaba sobre un fragmento de dicho hisopo. En el ca caso so de los los sopo soport rtes es perm permea eabl bles es,, ésto éstoss se co cort rtab aban an en vari varios os fragmentos, sobre los cuales se aplicaba el reactivo. 3º Exponer el hisopo o el fragmento al reactivo. 4º Leer el resultado.
Resultados Como era de esperar, las muestras peor conservadas son las que han estado sumergidas, enterradas y al aire libre descubierto, mientras que las que han permanecido al aire libre cubierto y en el laboratorio se han conservado mucho mejor; la mancha de sangre se ha mantenido visible a simple vista durante el periodo estudiado. En las tablas 1 a 4, se exponen los resultados obtenidos en función del soporte. Según el soporte utilizado, se puede decir que: En el acero el lumi lumino noll ofrec ofrece e un resul resulta tado do posi positi tivo vo hast hasta a los los 80 días días independientemente del medio en el que se haya encontrado; para los cuatro meses, sólo se obti obtiene enen n result resultad ados os posi positi tivo voss co con n el lumino luminol, l, except excepto o en las mues muestr tras as sumergidas. La leuc leucom omal alaq aqui uita ta es el rea react ctivo ivo que que func funcio iona na peor peor co con n las muest muestra rass antiguas y no sirve para muestras que hayan permanecido en agua. Las luces no han demostrado ser eficaces en el examen de este soporte. En el hierro y para para muestr muestras as sumerg sumergida idas, s, los reactivo reactivoss de orient orientaci ación ón utilizados no sirven si se trata de manchas recientes, incluso de diez días. Lo
mismo se puede decir de las muestras al aire libre descubierto, expuestas a la lluvia y otros factores atmosféricos; en este caso, es el luminol el que mejo me jores res resul resulta tado doss da en mues muestr tras as de hast hasta a 25 días días;; no se obti obtien enen en resultados positivos a partir de esta fecha. Las luces no son útiles a los 5 días si las muestras han estado sumergidas, y a los 25 días si han estado al aire libre descubierto. En los soportes que han estado al aire libre cubierto y en el laboratorio las manchas son visibles a simple vista a los 125 días y los resultados de las pruebas de orientación son positivos. En el azulejo no poroso , la fenolftaleína es el reactivo que peor funciona en ma manc ncha hass anti antigu guas as y dete deteri rior orad adas as,, expu expues esta tass a las las co cond ndic icio ione ness medioambientales. Con la leuc Con leucom omal alaq aquit uita a se obti obtien enen en resu result ltad ados os posi positi tivo voss co con n mues muestr tras as deterioradas de hasta 80 días.
