t 14 Trafico Vesicular 05 06

Tráfico vesicular

Biología celular – 2005-06

El transporte a lo largo de la ruta de secreción es vesicular, con diferentes tipos de vesículas que se forman en los diferentes compartimentos y que son direccionada direccionadas s de manera eficiente eficiente hacia el compartim compartimento ento de destino. destino.

Lodish (2000) Molecular Molecular Cell Biology, f. 17-50, 17-50, p. 734

1 7 1 e l b a t , 3 0 0 2 h s i d o L

Tráfico vesicular

Las etapas en un paso de transporte mediado por vesículas (tráfico vesicular) : 1. ‘Sorting’ o clasificación del material a ser transportado 2. Vesic Vesiculació ulación n (‘bud (‘budding’) ding’),, mediante el reclutamiento de proteínas citosólicas que recubrirán la vesícula formada 3. Desprendimiento de las proteínas de la cubierta 4. Direccionamiento / transporte de la vesícula, a un destino especificado por las proteínas de direccionamiento. 5. Reconocimiento de la membrana diana. 6. Fusión de las membranas y liberación del contenido del orgánulo

Componentes de las vesículas

n ó i c a l u c i s e v

Caveolina

transcitosis ?, señalización?

Tráfico vesicular en la ruta de secreción Caveolin CCV : ‘Clathrin coated vesicles n ó i c a l u c COPI i s e v

COPII

Farquhar and Palade (1998) The Golgi apparatus : 100 years of progress and controversy. TCB 8 : 2-10 (tcb8-01-02)

1 5 7 1 g i f , y g o l o i B l l e C r a l u c e l o M ) 0 0 0 2 ( h s i d o L

Cubiertas de clatrina, COP I y COPII


Figure 17-35 Lodish (2000) Molecular Cell Biology, fig. 17-52

Robinson (1997) Coats and vesicle budding. TCB 7: 99-102, bar 230 nm

Distribución de las diferentes cubiertas en la via de secreción

CCV


COPI

COPII

Vesículas recubiertas de clatrina

Polimerizacion clatrina (web)

Descubierta a partir de aislamiento de vesículas recubiertas (‘coated pits’) en oocitos de Aedes aegypti. Con un diámetro entre 50 y 100 nm


El elemento básico es la clatrina, proteína heterodimérica formada por 3 cadenas pesadas (1675 AA, 180 Kda, codificada por HC17) y tres ligeras (35-40 Kda), en una estructura denominada triskelion. Existen dos tipos de cadenas ligeras, alfa y beta, con una similaridad de un 60%.

La polimerización de clatrina es dependiente de concentración (conc crítica)

Fotin, Cheng, Grigorieff, Harrison, Kirchausen, Walz (2004) ‘Molecular model for a complete clathrin lattice from electron cryomicroscopy. Nature (elec publis Oct 2004)


Steer y Hanover (1991) Intracellular transport of proteins, Cambridge Univ Press, p. 61

¿cómo se encuentra la clatrina en la célula?


En la célula la autopolimerización de la clatrina está limitada pues el pool de triskelions soluble está secuestrado por hsp70 (chaperona citosólica), en un mecanismo análogo al de respuesta a las proteínas mal plegadas del RER.

Steer y Hanover (1991) Intracellular transport of proteins, Cambridge Univ Press, p. 72

Uncoating 70 Kda ATPase

La clatrina se une a las membranas mediante unas proteínas : adaptadores Entre la red de clatrina y la membrana de la vesícula hay un espacio de 20 nm en el que se encuentran las partículas de proteínas adaptadoras, de 350 Kda. ‘Mickey mouse’ structures Se han descrito 4 complejos de adaptadores diferentes n ó i c a l u c i s e v

Los adaptadores reconocen las regiones de membrana que contienen receptores con la señal de transporte . Por ejemplo, la subunidad micra2 de AP2 se une a : TyrXXhidrof / LL

TGN

Los adaptadores : - reconocen el cargo - reclutan clatrina - reclutan proteínas auxiliares Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)


n i e t o r p g n i d n i b F R A , g n i n i a t n o c r a e γ

d e z i l a c o l i g l o G : A G G

Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)

Miembros de la familia de proteínas Stoned B


Rolbinson y Bonifacino (2001) Adaptor related proteins COCB 13:444-453 (cocb13-04-13)


Purified clathrin triskelion reacted with HA-II Steer y Hanover (1991) Intracellular transport of proteins, Cambridge Univ Press, p. 66

Dinamina Proteína GTPasa asociada a los ‘coated pits’. Identificada en Drosophila como shibire, incapaz de endocitar via ‘coated pits’. Se aisló a partir de shibirets. Citosólica, de 900 AA, se une al coated pit y polimeriza. La hidrólisis de GTP regula la contracción de la dinamina. Los mutantes dinamina GTP- forman largos ‘cuellos’ que no se separan de la membrana. n ó i c a l u c i s e v

Terminales nerviosos incubados con GTPgammaS. Anti-dinamina.

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-55, p. 737 Takel et al (1995) Nature 374 : 186


Modelo de formación de ‘coated pits’ 1. Reconocimiento de la membrana (y de los receptores) por los adaptadores 2. Unión de triskelions, polimerización


3. Crecimiento de la malla de triskelions 4. Unión de dinamina, contracción

5. Separación de la vesícula, recubierta 6. Pérdida de la cubierta proteica

Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17.54, p. 737

Vesículas COPI Aisladas por Rothman et al en ensayos ‘in vitro’ de transporte intraGolgi ( Golgi, ATP, soluciones tampon, etc…).


Recubiertas por unos complejos citosólicos que denominó coatómero (alfa, beta, gamma, delta, épsilon, p20, ARF1) y que polimerizan sobre la vesícula con unas funciones similares a las de los adaptadores y la clatrina, reconociendo la región citosólica de receptores y deformando la membrana para formar la vesícula. Implicadas en el transporte retrógrado dentro del complejo de Golgi y entre éste y el RER.

Vesículas COPI, purificadas de Golgi de hepatocitos de rata incubado con citosol y ATP Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-56, p. 738

Sistema de transporte intra-Golgi libre de células


Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-57, p. 739

Componentes citosólicos de las vesículas COPI


Wieland y Harter (1999) COCB 11:440-446 (cocb11-4-05.pdf)

Arf1p

20kDa smGTP-BP, N-term myristoilated

Coatomer 70 kDa complex comprised of seven units (α, β, β’, χ, δ, ε y ξ) RET1, SEC26, SEC27, SEC21, RET2 Y RET3 codifican las subunidades (α, β, β’, χ, δ y ξ respectivamente, en Saccharomyces cerevisiae El subcomplejo α, β’ y ε reconoce la secuencia KKXX in vivo

ARF ADP-ribosilation factor. Se han descrito tres en levaduras, y seis en células de mamífero. smGTP-BP :


ARF-GDP (citosólica) ARF-GTP (unida a membrana)

La unión de ARF a la membrana se produce por el ácido miristílico de N-ter en una región de 17 residuos amfipáticos. - En levaduras ARF1 y ARF2 son identicos en un 96%, son intercambiables, y el doble mutante arf1- arf2- es letal - ARF1-yeast vs ARF1-hum es 77% identico, ARF2-yeast vs ARF5-hum es 69% identico - Se han diferenciado tres clases de ARF en mamíferos : 1- clase I. ARF1, 2 y 3. Ensamblaje de vesículas en Golgi-ER-endosomas, por ej clatrina-AP1 en TGN, clatrina-AP3 en endosomas y COPI en Golgi 2- clase II. ARF4 y 5. Se conoce muy poco 3- clase III. ARF6, en membrana plasmática / endosomas Jackson y Casanova (2000) Turning on ARF: the Sec7 family of guanine-nucleotide exchange factors. TCB 10 : 60-67, (tcb10-2-11.pdf)

Papel de ARF-GTP en el ensamblaje de COPI y en la selección del cargo


Wieland y Harter (1999) COCB 11:440-446 (cocb11-4-05.pdf)

Modelo de la acción de ARF en el ensamblaje de las cubiertas COPI ARF precisa de GEF específicas. Todas ellas (sec7 family of GEF) contienen un dominio Sec7 (200 AA).


Jackson y Casanova (2000) TCB 10 : 60-67 (tcb10-2-11.pdf)

Chavrier y Gould (1999) COCB 11 : 466-475(cocb11-4-09.pdf)

Modelo de formación de las vesículas COPI


1. ARF-GTP se activa (une GTP) 2. ARF-GTP se une a su receptor en la membrana del Golgi 3. Reclutamiento de coatómero 4. ‘Budding’ 5. Separación de la vesícula (requiere Fatty-Acil-CoA) (?)


6. ARF hidroliza GTP, liberando el coatómero. n ó i c a l u c i s e v

La vesícula queda descubierta


Positive and negative feedback mechanisms control the guanine nucleotide bound by ADPribosylation factor (ARF)


Roth (1999) Lipid regulators of membrane traffic through the Golgi complex TCB 9 : 174-179

Evidencias de la implicación de las vesículas COPI en el transporte retrógrado en el Complejo de Golgi y entre éste y el RER 1. Células de levadura que expresan mutantes ts de componentes de COPI presentan fenotipo sec clase B (retención ER) ¿está COPI implicada en la salida de ER a Golgi?


2. Receptor KDEL, recuperación de proteínas del RER, tiene señal KKXX en dominio citoplasmático, reconocida por COP alfa / beta. Mutantes ts de COP alfa/ beta no reciclan las proteínas del RER escapadas… con el tiempo el RER se queda sin proteínas propias, lo que impide la salida de las de nueva síntesis, produciendo un fenotipo sec clase B

3 0 0 2 , h s i d o L

Vesículas COPII Aisladas a partir de un extracto del RER incubado con citosol, ATP, GTP, … Mutantes de COPII son sec de clase B


Sec12 cataliza la activación de Sar1 (homóloga a ARF) intercambiando GDP por GTP. La unión de Sar1-GTP a la membrana recluta el complejo formado por Sec23 / Sec24, seguido de la unión de Sec13 / Sec31. Posteriormente se une Sec16, una proteína fibrosa que interacciona con los dos complejos previos (Sec23/24 y Sec13/31) actuando a modo de ‘scaffold’ de la vesícula. Las proteínas del RER reclutadas en las vesículas COPII contienen una señal diacídica (Asp-X-Glu). Experimentos con proteínas quiméricas VSV-G-GFP muestran que las vesículas COPII migran hasta 1 micra para fusionarse con el Golgi. En otros casos, en los que la distancia ER - Golgi era mayor, se ha observado la fusión de varias vesículas COPII formando el ‘compartimento intermedio ER-Golgi’. Estas vesículas (CI) son transportadas por MT hasta el Golgi.

Componentes citosólicos de las vesículas COPII

Sar1p n ó i c a l u c i s e v

24 kDa smGTP-BP, similar a ARF-type GTP-BP

Sec23 complex

Formado por Sec23p y Sec24p. Sec23p es la proteína activadora GTPasa de Sar1p. Sec24p es necesaria para la unión del complejo Sec13 a la membrana.

Sec13 complex

Formado por Sec13p y Sec31p.

Secuencia de reclutamiento de los componentes citosólicos de COPII en una membrana del RER


GEF

Kuehn y Scheckman (1997) COPII and secretory cargo capture into transport vesicles COCB 9 :477-483

o t n e i m i c o n o c e r / o t n e i m a n o i c c e r i d / o t n e i m i d n e r p s e D

Todas las vesículas formadas (CCV, COPI Y COPII) pierden las cubiertas poco después de formarse, pero en ellas permanecen un conjunto de proteínas implicadas en el direccionamiento y reconocimiento de la membrana diana : hipótesis SNARE. Estas proteínas son comunes a todos los tipos de vesículas.

Elementos de direccionamiento de vesículas y reconocimiento de membranas

o t n e i m i c o n o c e r / o t n e i m a n o i c c e r i d

1. SNARE-v. Receptor de la membranan de la vesícula, queda descubierto cuando la vesícula pierde la cubierta. Es el receptor vesicular, característico de cada membrana donadora. 2. SNARE-t. Receptor de la membrana diana, reconoce a la SNARE-v complementaria y asegura el reconocimiento de la membrana aceptora. 3. Rab. smGTPase. Proteína smGTP-BP, 200 AA, familia ras (Rab = ‘ras from brain’. Más de 30 conocidas en mamíferos. Implicada en la activación de los mecanismos que aseguran el transporte de la vesícula y el reconocimiento de la membrana diana. 4. SNAP-25. Proteína de fusión, ubícua. 5. NSF. N-etilamide sensitive factor, proteína soluble, ATPasa 6. γ-SNAP, ‘Soluble NSF Attached Protein’


Modelo de ciclo funcional de las proteínas Rab


Chavrier y Goud (1999) The role of ARF and GTPases in membrane transport COCB 11 : 466



Chavrier y Goud (1999) The role of ARF and GTPases in membrane transport COCB 11 : 466

La fusión de membranas El proceso de fusión de membranas es muy común en multitud de procesos celulares. En general se diferencian dos tipos : 1. Fusión endoplásmica, en la que las caras citosólicas de las membranas se fusionan. n ó i s u f

2. Fusión ectoplásmica, en la que son las caras de las membranas que se encuentran en contacto con el medio e xtracelular las que se fusionan (fertilización, formación de sincitios, entrada de virus a las células, etc…)

Todos los procesos de fusión de membranas son similares 1. Gran parecido entre las estructuras de las proteínas fusogénicas celulares y las que permiten la entrada de virus (p ej hemaglutinina) 2. Lípidos que inhiben la fusión viral también inhiben la fusión de membranas en general.

Dos hipotéticas estructuras del sitio inicial de fusión de membranas

Stalk : ‘is the minimal lipidic structure that merges the contacting leaflets of the fusing bilayers. It has a specific geometry that differentially packs lipids’ n ó i s u f

Connexon like structure : ‘this proteinaceous fusion pore is initially closed, then opens to first form a pore than then radially expands to mix lipids between protein subunits’

Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players in membrane fusion? TCB 11 : 233 (tcb11-06-11.pdf)

Un modelo de fusión mediante proteínas : subunidad VO de la ATPasa vacuolar

n ó i s u f

Modelo de rotación de la subunidad VO. Las subunidades de una membrana intercambian con las de la otra membrana y como consecuencia las membranas se fusionan. Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players in membrane fusion? TCB 11 : 233 (tcb11-06-11.pdf)

Pero al final… el intermediario es siempre un lípido, pues las dos láminas de las membranas se tienen que mezclar…

n ó i s u f

Zimmerberg (2001) How can proteolipids be central players in membrane fusion? TCB 11 : 233 (tcb11-06-11.pdf)

Proteína G Membrana Nucleocápside Genoma

n ó i s u f

Ciclo vital de un virus recubierto (VSV) en una célula eucariota De Alberts, Molecular Biology of the Cell, 3rd. edit.

Tinción negativa de virus influenza

Hemaglutinina de Influenza-v

En el Golgi furina corta formando dos subunidades HA1 y HA2 (péptido de fusión, N-ter)

n ó i s u f

Lodish (2000) Molecular Cell Biology f. 6-13 y f. 17-27, p.

n ó i s u f

Cambios conformacionales inducidos por un cambio de pH de 7.0 a 5.5 en la hemaglutinina de influenza-v Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-60, p. 744

n ó i s u f

Para la fusión de membranas inducida por HA-influenza es necesaria la participación de entre 9 y 12 moléculas. Lodish (2000) Molecular Cell Biology, f. 17-61, p. 745

Entrada del virus HIV a CD4+

n ó i s u f

HIV entry Inhibidores unión Inhibidores co-receptor Inhibidores de fusion

…¿y como se explica la fusión vesícula - membrana?

n ó i s u f

Mayer (1999) Intracellular membrane fusion, SNARES only? COCB 11 : 447-452 (tcb11-4-06.pdf)

Dos modelos alternativos para las fases finales de la fusión de vesículas A) SNARE driven fusion / B) SNARE function as an intermediate stage

n ó i s u f

Calmodulin Protein phosp1

Mayer (1999) Intracellular membrane fusion, SNARES only? COCB 11 : 447-452 (tcb11-4-06.pdf)

Modelos de acción de NSF - SNAP en la interacción SNARE


Hay y Scheller (1997) SNARE and NSF in targeted membrane fusion COCB 9 : 505-512



e j a l c i c e r

…¿y el reciclaje de todos los componentes a las mebranas de destino?

… esta será otra historia

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