Sebenta de BioCel

BERNARDO MANUEL DE SOUSA PINTO FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Bernardo Manuel de Sousa Pinto Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Sebenta de Biologia Celular e Molecular I

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Estão incluídos nesta sebenta, resumos das aulas de Biologia Celular e Molecular I da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, bem como um atlas com as imagens de microscopia observadas. Desde já agradeço a quem me ajudou na elaboração da sebenta, através da correcção de eventuais erros inicialmente presentes, ou através de ideias e sugestões. Bom trabalho e votos de sucesso nos exames, Bernardo M. Sousa Pinto

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Estão incluídos nesta sebenta, resumos das aulas de Biologia Celular e Molecular I da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, bem como um atlas com as imagens de microscopia observadas. Desde já agradeço a quem me ajudou na elaboração da sebenta, através da correcção de eventuais erros inicialmente presentes, ou através de ideias e sugestões. Bom trabalho e votos de sucesso nos exames, Bernardo M. Sousa Pinto

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Microscopia O microscópio permite, não só, ampliar aquilo que vemos, mas também, ver mais pontos como pontos distintos, pois permite uma resolução maior que uma simples lupa. Existem dois grandes tipos de microscópio: O microscópio de luz, onde é possível ver até às células, e o microscópio electrónico, que teoricamente daria para ver até aos átomos.

Limite de resolução O limite de resolução de um microscópio é a distância mínima entre dois pontos de um objecto, em que estes são passíveis de ser observados como pontos distintos, exprimindo-se em subunidades do metro. O limite de resolução do microscópio óptico é calculado pela fórmula  

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, sendo , o valor do

comprimento de onda da luz utilizada e o produto expresso no denominador muitas vezes indicado pelo fornecedor. O limite de resolução mínimo do microscópio óptico, por causa da radiação é de 200 nm, ou seja, não se conseguem observar estruturas que distam menos de 200 nm, que é a distância mais ou menos que existe entre os organelos. O microscópio electrónico tem um limite de resolução teórico de 0,1 nm, mas na prática, o limite de resolução é raramente menor que 1 nm.

Preparações para microscopia Para elaborar preparações definitivas para microscópio óptico, em primeiro lugar, devemos parar os processos metabólicos das células, matando-as e conservando a sua estrutura – fixação. De seguida, corta-se o tecido endurecido (frequentemente em parafina) em fatias finas (entre 5 e 6 μm de espessura), pois só assim podem ser atravessadas por um feixe de luz. Finalmente, coloca-se este no suporte de vidro. Como as células são incolores, nomeadamente as animais, absorvem/reflectem muito poucas radiações visíveis, devendo-se por isso fazer colorações, utilizando-se corantes citológicos, básicos (ou acidófilos), para corar estruturas ácidas, como o núcleo (devido à grande quantidade de ácidos nucleicos), ou corantes citológicos ácidos (ou basófilos), para corar estruturas básicas (geralmente têm maior afinidade com o citoplasma). Como as colorações podem induzir alterações morfológicas nas células, há por vezes a necessidade de observar células vivas e não coradas. Para isto, utilizam-se frequentemente, microscópios de contraste de fase . Já em microscopia electrónica, os cortes têm de ser ultra-finos (80 a 100 nm), sendo estes colocados numa grelha metálica e fixados numa cera muito dura.

Coloração de Gram As células procarióticas não têm núcleo, nem organelos membranares individualizados. As bactérias são indivíduos procariontes, que se classificam de acordo com o modo como coram, quando submetidas à técnica de Gram . Sendo assim, as bactérias Gram-positivas coram a roxo e as bactérias Gram-negativas coram a encarnado/magenta. Estas diferenças em termos de coloração prendem-se com a presença ou ausência de peptidoglicano nas paredes bacterianas. As Gram-positivas possuem uma grande quantidade de peptidoglicano que funciona como uma “esponja muito grossa e permeável”, enquanto as Gram -negativas possuem uma quantidade muito reduzida de peptidoglicano.

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Microscopia de contraste de fase A microscopia de contraste de acompanhar fase permite culturas de células vivas, pois neste método não é necessária a coloração histológica das células. As imagens são nos dadas, pois, por um contraste, que faz parecer que estas apresentam relevo. Isto acontece porque as radiações que atravessam organelos mais “densos” e “espessos”, como o

núcleo sofrem um retardamento, enquanto as que atravessam regiões de menor resistência, ficam em fase. Dessa forma, essas diferenças de fase de radiação, nos diferentes locais da célula, vão ser convertidas pelos microscópios de contraste de fase, num contraste, onde estruturas mais “densas” são menos brilhante e as menos “densas” são mais. Este método é útil para observar células individuais, ou finas camadas de células, mas não tecidos espessos. O contraste de interferência diferencial (ou contraste de interferência diferencial de Nomarski ) é uma variante da microscopia de contraste de fase, pois converte diferenças de fase também num contraste, mas os objectos, nas imagens, parecem ter uma sombra, algo que resulta de uma diferença no índice de refracção deste, relativamente ao meio. Isto é particularmente útil para a observação de objectos espessos e pequenos detalhes.

Microscopia de fluorescência Através de microscopia de fluorescência, é possível detectar os fluorocromos, moléculas fluorescentes. Um composto diz-se fluorescente, caso absorva luz a um dado comprimento de onda de excitação e, por consequência, emita luz, num maior comprimento de onda específico. São por isso detectadas duas radiações – uma associada à excitação dos electrões e outra à emissão de energia por parte destes. Por isso, neste tipo de microscopia utiliza-se um filtro que deixa passar apenas as radiações que excitam os fluorocromos. Graças a outro filtro, vemos também somente as radiações luminosas emitidas pelos fluorocromos. O resto aparece a negro. Dado existirem muito poucas moléculas naturalmente fluorescentes, somos forçados a recorrer a técnicas de imunocitoquímica – utilizamos, pois, anticorpos com fluorocromos, pois os anticorpos são muito específicos para determinados antigénios. Podemos classificar as técnicas de imunocitoquímica em directas, se recorrerem somente a um anticorpo marcado para cada molécula, o que acontece muito raramente; ou indirectas, se recorrerem a um anticorpo primário , ao qual se ligam vários anticorpos secundários marcados (sendo que os dois anticorpos têm de ser produzidos em animais diferentes – só assim os anticorpos secundários reconhecem o anticorpo primário como um antigénio!). Podem igualmente ser usadas enzimas com marcação fluorescente.

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Dado o contraste nas imagens de fluorescência ser tão grande, é possível ver estruturas menores que 200 nm, a menos que distem menos que 200 nm! As imagens de microscopia de fluorescência podem apresentar um fundo ( noise), algo que é superado com recurso a radiação laser muito intensa, em microscópios mais sofisticados. A microscopia confocal e de deconvolução permitem observações de estruturas tri-dimensionais sem aberrações de imagem. A microscopia de Apo-Tome permite um aumento de nitidez nas imagens obtidas por microscopia de fluorescência. GFP – Green Fluorescent Protein Esta proteína permite-nos ver, com recurso a técnicas de fluorescência, células vivas, ou proteínas (por vezes criam-se proteínas híbridas, com um segmento de GFP, que não altera o funcionamento natural destas e permite observar o seu “caminho natura l”).

FRET – Förster resonance energy transfer Esta é uma técnica de microscopia de fluorescência, que permite observar a interacção directa entre duas moléculas muito próximas (nomeadamente reacções de transferência de energia), do seguinte modo:

FRAP – Fluorescence recovery after photobleaching Esta técnica é útil para observação de cinética molecular, pois faz-se um branqueamento de todas as moléculas fluorescentes numa área restrita e depois vai-se acompanhando as migrações moleculares, ou seja, a sua “recuperação”.

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TIRF - Total internal reflection fluorescence microscope Permite excitar os electrões que estão mais à superfície na lâmina, permitindo ver só moléculas individuais específicas.

Microscopia electrónica de transmissão Este tipo de microscopia electrónica utiliza um feixe de electrões, emitidos por um filamento de tungsténio, após ter sido criada uma grande diferença de potencial, o que mata células eventualmente vivas. Como as células são muito permeáveis à passagem de electrões e os metais pesados não, cria-se uma fixação à base de elementos densos, como o ósmio, ou o acetato de uranilo…levando à

génese de um contraste. Em microscopia electrónica aplicam-se também técnicas de imunocitoquímica, nomeadamente imunocitoquímica ultra-estrutural, onde, recorrendo a anticorpos marcados com metais pesados (p.e.

esferas de ouro), conseguimos detectar determinadas estruturas. Microscopia crioelectrónica Consiste na congelação muito rápida de material biológico em azoto líquido, algo essencialmente útil para a identificação de vírus. Pode preceder o processo de sombreamento metálico, algo que é extremamente útil para revelar o interior de biomembranas. Sombreamento metálico Consiste na colocação de um metal pesado no material biológico, obtendo-se uma réplica da superfície que se consegue ver a microscópio electrónico – à espécie de um molde.

Microscopia electrónica de varrimento Quando observamos estruturas em microscopia electrónica de varrimento, fazemos incidir electrões em ângulos diferentes, relativamente aos do microscópio electrónico de transmissão. Obtemos assim uma imagem da superfície do material biológico (que não é atravessado pelos electrões), embora o limite de resolução neste tipo de microscópio seja menor.

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Isolamento e cultura celular Isolamento de células Microdissecção por laser Este processo permite recortar regiões da célula, muito selectivamente, submetendo-as a radiação laser , após estas terem sido cobertas por um polímero. Citometria de fluxo A citometria de fluxo permite a separação de células, através de diferença de cargas. Algumas células são marcadas por fluorescência, sendo que as marcadas, recebem uma determinada carga e as que não têm recebem outra. É feita posteriormente uma triagem com base nas cargas das células.

Cultura de células in vivo: A cultura de células in vivo é muito importante em termos científicos, sendo aceite em termos éticos e poupando recursos financeiros. Estas células são cultivadas em meio de cultura líquido, asséptico, suplementado com aminoácidos, vitaminas e soro animal, estando todos os factores controlados. Para além disso, estas células mantêm as características das originais. Contudo, existe a possibilidade da contaminação destas culturas com microrganismos. As células que retiramos podem se dividir num número limitado de vezes (normalmente podem efectuar até 40 divisões), morrendo posteriormente. Contudo, algumas células normais de roedores e células tumorais têm capacidade de se dividir indefinidamente – linhas de células imortais – um exemplo de células imortais, são as células da linha HeLa, a primeira linha celular, que foi isolada a partir de um cancro do colo do útero. Células imortais cultivadas in vivo são utilizadas na criação de células híbridas . As células híbridas resultam da cultura de duas células com conteúdo genético não muito diferente. Para se criarem células híbridas, recorre-se ao polietilenoglicol, formando-se depois um heterocaryon, porque as membranas das células tornam-se muito permeáveis. Formam-se depois, por mitose, células com informação genética de ambos os tipos de células. As células híbridas são utilizadas, por exemplo, para a produção de anticorpos monoclonais, por parte de hibridomas, células resultantes da fusão de linfócitos B com células tumorais, o que lhes confere imortalidade. As células híbridas têm ainda aplicações na investigação e no diagnóstico de patologias.

Isolamento de organelos: Os organelos são isolados, de forma a permitir um melhor conhecimento da sua constituição, algo essencial, por exemplo, para a produção de fármacos. Para proceder à obtenção de organelos isolados, em primeiro lugar, a membrana citoplasmática das células é rompida, através de um método mecânico – o homogeneizador. De seguida, procede-se a uma centrifugação, onde se aplica uma grande força centrífuga, maior que a da gravidade, de modo a obter um sedimento, constituído pelas estruturas mais densas e um sobrenadante, constituído pelas restantes. O núcleo será o primeiro organelo a constituir o sedimento, dada a sua elevada densidade. Contudo, é necessária a separação dos sobrenadantes, algo que se faz recorrendo-se a uma centrifugação diferencial, a forças cada vez maiores. Como as fracções obtidas nunca são 100% puras, utilizamos um gradiente, onde a base tem maior concentração de soluto (p.e. de sacarose) que o topo. Obtém-se aí uma coluna com bandas, o que

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permite a purificação de sedimentos, quer constituídos por diferentes organelos, quer constituídos somente por núcleos. Um controlo adicional da pureza é feito, recorrendo ao microscópio electrónico.

Este processo pode ser utilizado para a obtenção de macromoléculas específicas isoladas. Neste caso, a ultracentrifugação é realizada à conta de forças muito superiores e tempo muito longa, estando sempre associada a um gradiente muito concentrado em soluto. As macromoléculas, “deslocam -se” ao longo do gradiente até encontrarem uma zona, cuja densidade seja igual às suas, estabilizando aí. Todavia, esta não é a técnica de excelência para a separação de moléculas como o DNA e o RNA.

Separação de proteínas: SDS-PAGE Para separar proteínas, recorremos à electroforese, um processo que permite separar moléculas com carga eléctrica, quando se encontram em solução, através da aplicação de corrente eléctrica, estando a migração das moléculas dependente da sua carga, forma e massa. No DNA, a migração está apenas dependente da massa (associada ao número de pares de bases), visto as moléculas de DNA terem carga negativa (devido à presença do anião fosfato) e forma similar, mas nas proteínas tal não acontece. Neste grupo de moléculas verifica-se variedade na carga e forma, o que leva a que tenhamos de realizar alguns processos, de modo a eliminar essas “variáveis” e a podermos

separar as proteínas somente pela sua massa. Para eliminarmos a “variável carga”, aplicamos SDS (dodecilsulfato de sódio), que confere carga

negativa a todas as proteínas (estas ficam todas com a mesma carga). Isto leva também, a que haja repulsões entre as proteínas, algo que ajuda à sua desnaturação e linearização. Posteriormente, aplicase DTT – ditiotreitol – e β-mercaptoetanol – agentes que quebram as pontes dissulfureto, contribuindo para a perda de tridimensionalidade das proteínas. Aplica-se uma carga eléctrica às proteínas, então em gel de poliacriloenil, que migram do cátodo (-), até ao ânodo (+), sendo que quanto maiores, menor a sua mobilidade. Para visualizarmos as bandas

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obtidas, estas são coradas com nitrato de prata e azul de Coomassie e comparar os valores obtidos com valores-padrão. Focagem Isoelectrónica Esta é uma forma de electroforese, na qual as proteínas são separadas de acordo com o seu ponto isoelectrónico – o valor do pH do meio, para o qual a proteína fica globalmente neutra. Sabe-se que ao ser aplicada electroforese em proteínas neutras, estas não migram, por isso numa tina onde existe um gradiente de pH, fornecemos corrente a proteínas carregadas, sendo que estas migram até ao local onde é atingido o seu ponto isoelectrónico.

Electroforese bidimensional As proteínas são separadas com base nos seus pontos isoelectrónicos, por focagem isoelectrónica e depois, por SDS-PAGE, pela sua massa molecular. Western-blotting O método de Western-blotting consiste na transferência das proteínas separadas por electroforese bidimensional para uma membrana. Aplica-se coloração de Ponceau’s e depois aplicam-se os anticorpos marcados com enzimas ou fluorescência para identificar as proteínas de interesse ( imunoblotting).

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Separação e hibridação de ácidos nucleicos: No DNA, a migração por electroforese é feita em gel de acrilamida e agarose e está apenas dependente da massa (associada ao número de pares de bases), visto as moléculas de DNA terem carga negativa (devido à presença do anião fosfato) e forma similar. Dadas as dimensões da molécula de DNA, por vezes é necessário cindi-la, com recurso a enzimas de restrição. A visualização das bandas de DNA é possível graças ao SYBR green (antigamente recorria-se ao brometo de etídio, contudo, este é cancerígena). É possível a hibridação de ácidos nucleicos, podendo-se obter cadeias de DNA/DNA, RNA/RNA e DNA/RNA. Para isso, aumenta-se inicialmente a temperatura das moléculas “originais”, o que leva à quebra das pontes de hidrogénio e desnaturação destas. De seguida, obtêm-se moléculas híbridas, graças à diminuição de temperatura. Southern-blotting O método de Southern-blotting é análogo ao de Western-blotting. Esta técnica é capaz de detectar um fragmento de restrição específico, com uma enzima de restrição. Quando uma mistura de DNA complexa é submetida a electroforese é notável a presença de vários fragmentos diferentes com aproximadamente a mesma massa, não sendo detectável, cada um, como uma banda particular. Dessa forma, o southern-blotting recorre à hibirdação para identificar um fragmento de DNA particular – os fragmentos de restrição são transferidos para uma membrana, que é deixada a incubar em condições de hibridação com uma sonda específica de DNA marcada radioactiva. Após se dar a hibridação dos dois fragmentos, identificamos a sua localização, por autoradiografia. Nothern-blotting O método de Northern-blotting permite determinar a localização da expressão de um gene particular, sendo análoga para RNA que é separado por electroforese e induzido em hibirdação com uma sonda de DNA marcada radioactivamente. Este método necessita da extracção de mRNA de uma célula ou conjunto de células, dessa forma, para manter a informação posicional da célula, em estudos mais precisos, é necessário realizar hibridização in situ.

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DNA e DNA binding proteins Molécula de DNA A molécula de DNA apresenta como unidades básicas os nucleotídeos, compostos por uma base azotada, uma desoxirribose e um grupo fosfato. Ao conjunto da base azotada, mais a dexosirribose dáse o nome de nucleosídeo. Quanto às bases, existem as pirimídicas, que são a timina e a citosina e que apenas apresentam um anel azotado, e as púricas, que apresentam dois anéis azotados, sendo por isso a adenina e a guanina. O grupo fosfato estabelece duas ligações éster com a desoxirribose, dizemos por isso que se estabelecem ligações fosfodiéster na molécula de DNA. Uma das ligações é estabelecida no 5º carbono da desoxirribose, enquanto a outra é no 3º carbono de uma desoxirribose diferente. Dessa forma, a sequência de nucleotídeos é sempre lida de 5’ para 3’.

A cadeia de DNA é formada por dois polímeros lineares com tendência a formar uma dupla hélice, estabelecendo-se pontes de hidrogénio entre as bases azotadas, de ambas as cadeias, que se dispõe antiparalelamente. Relativamente ao emparelhamento de bases, podemos afirmar que estas formam sempre pares de Watson e Crick, ou seja a adenina emparelha sempre com a timina, através de duas pontes de hidrogénio e a guanina com a citosina, por 3 pontes de hidrogénio. De referir que na molécula de DNA distinguimos dois “sulcos”, um maior e outro menor, sendo que em cada volta, encontramos um sulco de cada. Já as pontes de hidrogénio estabelecem um “ efeito velcro”, pois são muito frágeis

individualmente, mas, no seu conjunto, constituem uma junção muito forte. Relativamente aos tipos de DNA, quanto ao seu arranjo em dupla hélice, podemos considerar o BDNA, o ZDNA e o ADNA. O BDNA corresponde à maior parte do DNA existente nas células. Regista-se nele uma rotação para a direita e existem 10,1 bases por volta completa (que tem 3,6 nm). Já o ADNA apenas existe em laboratório e em condições de desidratação extrema, sendo por isso, semelhante à estrutura do BDNA, mas mais compacto. Por último, o ZDNA apresenta uma rotação para a esquerda e, embora por vezes se encontre nas células, não se sabe qual a sua função.

Desnaturação da molécula de DNA A molécula de DNA é muito estável, todavia, a separação das duas cadeias é possível, através do aumento de temperatura (dado a elevação térmica aumentar a cinética dos electrões). A esta separação dá-se o nome de desnaturação do DNA, sendo este processo reversível. Valores extremos do pH também levam à quebra das pontes de hidrogénio, isto porque as cadeias passam a repelir-se, quer pelo facto das bases ficarem protonadas (em meio ácido), ou com carga negativa (em meio básico). Também a diminuição da concentração de iões é um factor que contribui para a desnaturação da molécula de DNA.

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As quebras de ligações nas moléculas de DNA são passíveis de ser monitorizadas, através da espectrofotometria. De facto, as cadeias simples absorvem uma quantidade muito maior de radiação UV de comprimento de onda 260 nm. A temperatura para a qual se dá um aumento muito brusco da absorção de radiação de 260 nm é designada por melting-point (também designado por “temperature of melting”, ou T m). O melting-point é mais elevado quando há mais pares de bases guanina-citosina, do que quando há mais pares de bases adenina-timina. Isto, porque entre a guanina e a citosina estabelecem-se mais pontes de hidrogénio, que entre a adenina e a timina.

Disposição do DNA na célula O DNA não se dispõe aleatoriamente no núcleo das células em interfase – ocupa os chamados territórios cromossómicos, locais restritos ocupados de forma ordenada pelo DNA, entre os quais existe o espaço intercromossomal. O DNA encontra-se então no núcleo associado a proteínas, o que constitui a cromatina. A cromatina pode se encontrar sob uma forma muito condensada (heterocromatina), ou pouco condensada (eucromatina), estando essa última forma, geralmente associada à transcrição activa. Quando se encontra em solução hipotónica, o DNA apresenta-se na forma de fibras de cromatina de 10 nm de diâmetro, assemelhando-se a um colar de contas, sendo que cada conta é um nucleossoma – a unidade básica de compactação de DNA nas células, constituído por 147 pares de bases ligados a um octâmero (constituído por um conjunto de oito histonas, de quatro tipos diferentes). As histonas apresentam resíduos de aminoácidos carregadas positivamente, sendo que após a tradução destas é possível, que estas sofram alterações ( código das histonas ), que determinarão a sua função e compactação. Uma histona importante é a H1, por permitir a formação de fibras de cromatina de 30 nm de diâmetro, estas fibras iniciam a sua formação pela orientação de duas colunas de DNA para esquerda e enroladas sobre si próprias, originando depois, no seu conjunto, uma dupla hélice com orientação para a esquerda. De entre as histonas é igualmente de destacar a acção da HP1, ao permitir uma maior condensação do DNA, levando à génese de mais heterocromatina. Essa maior condensação está pois associada a trimetilações, enquanto as acetilações estão sobretudo associadas a um impedimento da condensação da cromatina.

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De referir, que este processo avança ciclicamente, até aparecer um “ elemento de fronteira”, que impede o resto da proliferação da heterocromatina. O processo da produção de heterocromatina pode ser então descrito pelo esquema da direita. De entre a heterocromatina, é igualmente importante referir que existe heterocromatina que está permanentemente condensada e que se denomina heterocromatina construtiva, não sendo praticamente transcrita.

Estrutura do cromossoma O cromossoma apresenta DNA associado a proteína, designando-se cada molécula de DNA presente no cromossoma por cromatídea. As cromatídeas estão unidas por um centrómero. A extremidade do cromossoma é o telómero. Existem proteínas que, não sendo histonas, desempenham importantes funções na manutenção da estrutura do cromossoma – loops de DNA associados a um scaffold cromossómico de proteínas não histónicas, formam umas “argolas” designadas por SMC - Structural maintenance of chromosome .

A condensina é entendida como largos complexos proteicos com uma função fundamental na estrutura de um cromossoma. O cariótipo é entendido como o diagrama organizado dos cromossomas metafásicos de uma espécie e tem em conta, o número de cromossomas de uma determinada espécie, a sua forma e tamanho.

DNA binding proteins AS DNA binding proteins são as proteínas que se ligam ao DNA (mais particularmente à sua periferia), estas têm acesso às bases no interior da molécula de DNA, sem ser necessário desnaturá-la. Isso é possível, especialmente, graças ao “sulco grande” da molécula de DNA, que permite a exposição das

bases nucleotídicas. As ligações estabelecidas entre o DNA e as proteínas são muito específicas, formando à espécie de um efeito velcro. Frequentemente, ligam-se ao DNA proteínas com estrutura secundária em α -hélice, mas as folhas pragueadas β também conseguem reconhecer a dupla hélice de DNA, bem como ansas de aminoácidos

(como as da proteína p53, supressora tumoral). A helix-turn-helix é um domínio comum de ligação ao DNA, sendo compostas por duas hélices e um grupo turn, em ângulo fixo, sendo que uma hélice, a hélice de reconhecimento liga se à major groove do DNA. O basic helix-loop-helix (bHLH) é uma variante, onde duas hélices estão conectadas por um loop. Um caso particular de helix-turn-helix é o homeodomain e é observado nos repressores bacterianos. O zinc finger é o motivo mais abundante de ligação nos animais. Tem um átomo de zinco a unir vários resíduos de aminoácidos (entre 23 e 28), apresenta várias formas possível, mas geralmente, tem uma hélice de reconhecimento.

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O leucin-zipper consiste em duas α -héllices de DNA, unidas por interacções hidrofóbicas, ao nível das leucinas. Está associada à expressão de genes. Os heterodímeros são resultado da junção entre o leucin-zipper e as hélice-ansa-hélice básicas, tendo diferente especificidade de ligação ao DNA. Contudo, o número de combinações em cada célula é limitado, dependendo sempre da sequência de aminoácidos de cada cadeia.

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Replicação de DNA A replicação de DNA é o processo pelo qual se formam 2 moléculas de DNA exactamente, iguais à quais lhe deu origem e entre si. É um processo semi-conservatvo feito por complementaridade de bases, algo que foi comprovado numa experiência que utilizou isótopos de azoto num gradiente de Césio.

DNA Polimerase A DNA Polimerase é a principal enzima a catalisar o processo de replicação DNA. Existem vários tipos de DNA polimerase – nos procariotas, podemos referir as DNA Polimerases I, II e III (a DNA Polimerase III é a principal, adicionando nucleotídeos e tendo capacidade de proof-reading, as restantes, sobretudo a II intervêm somente no processo de reparação do DNA), enquanto nos eucariotas, são de salientar a DNA polimerase α (também designada por DNA primase), a DNA polimerase β (que actua nos processos de reparação de DNA) e as DNA polimerases δ/ε (com capacidade de adição de nucleotídeos e de proofreading. A DNA polimerase δ actua ao nível da cadeia leading, enquanto a ε actua ao nível da cadeia lagging). A DNA Polimerase δ/ε é a enzima mais importante nas células eucarióticas, criando ligações difosfoéster, de 5’ para 3’, quando as bases já estão emparelhadas, entre a molécula de DNA e um

desoxirribonucleosídeo trifosfato (levando à libertação de dois fosfatos). Esta enzima é similar a uma mão fechada, com “dedos”, “polegar” e “palma”.

Esta enzima é incapaz de adicionar os desoxirribonucleotídeos a uma cadeia simples. Tem que existir, por isso, na cadeia de DNA, um pouco de ligação dupla. Isto é algo que não acontece com a enzima DNA primase.

Cadeia condutora (leading) e cadeia rápida (lagging) Em microscopia electrónica é possível observar a replicação de DNA. As moléculas de DNA circular vão sendo abertas, havendo crescimento bidireccional das cadeias, com formação das forquilhas de replicação. A forquilha de replicação é a estrutura com forma de diapasão que se forma, aquando da replicação do DNA. Nela distinguimos duas cadeias, a cadeia condutora , ou leading, e a cadeia lenta ou lagging. A cadeia condutora é aquela onde o DNA é sintetizado de modo contínuo. A sua orientação 5’ para 3’ é de acordo com a direcção de síntese de DNA pela DNA polimerase. Por outro lado, na cadeia

lenta o DNA é sintetizado de modo descontínuo, alternando os fragmentos de Okazaki com primers de RNA.

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Os fragmentos de Okazaki são as sequências de DNA, que se vão formando nas cadeias lentas e têm cerca de 100-200 nucleotídeos nos eucariotas e 1000 a 2000 nos procariotas. Os primers de RNA são pequenas regiões de ribonucleotídeos, com 3 a 10 nucleotídeos, acrescentados pela DNA primase (DNA polimerase α), de forma a ser possível a síntese de DNA na cadeia lenta. Na cadeia leading também é necessário um primer , para que se possa iniciar a replicação, dado que a DNA polimerase não pode acrescentar nucleotídeos de novo.

A remoção dos primers é feita por acção da RNase H. Dado a presença de ribonucleotídeos nas cadeias de DNA ser facilmente detectada nas células como algo anómalo e aberrante, estes são fácil e rapidamente removidos. Os espaços livres são então preenchidos por desoxirribonucleotídeos colocados pela DNA polimerase. A enzima DNA ligase, por seu turno, à conta de ATP, estabelece a última ligação fosfodiéster.

Proteínas acessórias da DNA polimerase A DNA helicase é essencial ao processo de replicação do DNA, pois permite a abertura da dupla hélice e, por outro lado, o desenrolamento das cadeias simples, aquando da formação de uma nova cadeia dupla. Esta proteína tem forma de anel, que progride, abrindo a cadeia de DNA. Contudo, é necessário, que as cadeias simples, uma vez desenroladas, se mantenham simples. Esta é a função da RPA – Replication Protein A, que simultaneamente mantém as cadeias simples acessíveis à deposição de novos nucleótidos. Já a PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen – é uma proteína com três subunidades que permite que a DNA polimerase esteja mais tempo ligada à molécula de DNA e não se separe desta. Isto porque a DNA polimerase, por si só, tem pouca afinidade com a molécula de DNA. Nos procariotas, a sua homóloga é a sliding-clamp protein. O RFC – Replication Factor C - é um complexo que “trabalha em conjunto” com a DNA polimerase e que se está constantemente a formar e a dissociar na cadeia lenta, visto dissociar-se do complexo que forma com a DNA polimerase e com a PCNA e da própria molécula de DNA, quando se inicia a síntese de um primer . Nos procariontes, destaque ainda para a clamp-loading protein, que faz a hidrólise de ATP, permitindo assim que ocorra a adição de desoxirribonucleotídeos.

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São igualmente necessários mecanismos que evitem a ocorrência de sobre-enrolamento no DNA, função assegurada pelas que dão topoisomerases, pequenos cortes na molécula de DNA, com esse intuito, e depois restabelecem essas mesmas ligações fosfodiéster, por elas quebradas. Existem duas classes de topoisomerases a – topoisomerase I quebra a cadeia simples de DNA e está muito próxima da forquilha de abertura e a topoisomerase II quebra a cadeia dupla, assumindo um papel fundamental para que ocorra a separação dos cromossomas e a “mudança de lugar da cadeia de DNA”.

Ao conjunto formado entre a DNA helicase a DNA primase dá-se o nome de primossoma.

Verificação da replicação pela DNA polimerase Apenas um em cada 109 nucleotídeos é incorporado incorrectamente durante a replicação de DNA. 5 Embora, ao ser realizada a polimerização de nucleotídeos, um em cada 10 nucleotídeos seja incorporado erroneamente, o mecanismo de exonucleotytic proofreading , operado pela enzima DNA polimerase, permite que apenas subsista um erro em cada 10 2 nucleotídeos e o processo de Strand 2 directed mismatched repair , leva a que também apenas subsista um erro em cada 10 nucleotídeos. A acção combinada destes três mecanismos leva então a que apenas “passe” um erro em cada 10

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nucleotídeos sintetizados. O processo de proof-reading da DNA polimerase é possível graças à actividade de exonuclease desta enzima. Este processo é possível de 3’ para 5’, sendo que a DNA polimerase reconhece os nucleotídeos

mal-emparelhados, pois esses não formam uma cadeia dupla correcta. A enzima em questão remove o nucleotídeo errado e adiciona o correcto. Se a polimerização de nucleotídeos ocorresse, eventualmente, de 3’ para 5’ nalguma das cadeias, ao se operar o processo de proof-reading, quando fosse detectado um nucleotídeo errado e, posteriormente, removido, a cadeia ficaria incompleta e não poderia crescer mais.

Origem e velocidade da replicação Em E. coli , as origens de replicação são regiões do DNA ricas em pares A-T, que têm ligações mais fracas (por apenas duas pontes de hidrogénio). Nas células eucarióticas, a velocidade de replicação é 10 vezes mais lenta que nas procarióticas, devido à presença de nucleossomas. Por isso, o genoma das células eucarióticas têm obrigatoriamente várias origens de replicação, muito diferentes entre si às quais se ligam ORC – Origin Recognition Complex –

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proteínas com 6 subunidades cuja função é a de reconhecer as regiões de origem de replicação, ciclinas e DNA-helicases. A um conjunto formado por entre 20 a 80 origens de replicação, dá-se o nome de unidade de replicação . É importante referir que o DNA não replica todo simultaneamente nas células eucarióticas, replicando primeiro a cromatina menos condensada (eucromatina), contudo, todo o genoma é replicado.

Formação dos nucleossomas Os tetrâmeros de histonas H3 e H4 nunca se separam durante a replicação, contrariamente às H2A e H2B. A síntese dessas histonas é então feita imediatamente após a replicação de DNA. Como as moléculas recém-formadas de DNA possuem então já histonas, as que se formam de novo, podem ser depois modificadas de acordo com as que já estão ligadas ao DNA.

Replicação dos telómeros A enzima telomerase assegura a replicação do DNA no telómero – extremidade cromossómica, que apresenta no ser humano a sequência repetitiva GGGATT, pois este não é sintetizado na cadeia lenta, pois, como é uma extremidade, seria aí impossível para a DNA polimerase sintetizar nucleotídeos. Contudo, a maioria das células somáticas não exprimem a enzima telomerase, contrariamente às células tumorais e embrionárias. Dessa forma, vão ficando com as extremidades cromossómicas cada vez mais curtas, até ao ponto dos cromossomas se fundirem. Essa perda cromossómica leva à morte celular, estando assim explicado, o motivo pelo qual as células somáticas normais apenas têm capacidade de efectuar 40 replicações.

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DNA: Reparação e Recombinação Danos no DNA Cada célula humana sofre em média, por dia 104 a 106 eventos, físicos ou químicos, conducentes a danos do DNA e, dessa forma, é essencial para a célula possuir mecanismos de reparação do DNA. A célula não pode evitar que se dêem estes danos, visto que muitos são originados por produtos das reacções metabólicas celulares, sendo a sua ocorrência normal. De entre os danos que se registam no DNA, salientamos as reacções de hidrólise, de entre as quais, despurinações – reacções de hidrólise, em que as bases púricas deixam de o ser – e as desaminações – remoção de um grupo amina nas bases citosina, adenina e guanina. Também os danos oxidativos, onde há perda de ligações oxidativas contribuem para lesões no DNA, bem como as alquilações, de onde se salientam as metilações, onde grupos metilo se ligam a átomos de azoto. Contudo, não são apenas agentes endógenos que contribuem para as lesões do DNA. A exposição a certos agentes exógenos, como as radiações UV, que levam à formação de dímeros de timina ou citosina, ou alguns produtos químicos, que levam por exemplo a metilações e etilações, propicia à ocorrência de danos na molécula de DNA. Cada cadeia de DNA apresenta uma cópia (um backup), devido ao facto de se encontrar ligada a uma cadeia com bases complementares. Isto faz com que a molécula de DNA seja a molécula ideal para armazenamento de informação genética. A presença de apenas quatro nucleotídeos diferentes facilita igualmente, a reparação de erros.

Reparação directa do DNA Existem mecanismos de reparação directa do DNA, nomeadamente a reversão directa (direct reverse) de um dímero de timina, formado aquando da exposição a radiação UV e que é possível em bactérias e algumas células eucarióticas, sendo levada a cabo por uma enzima. Algumas enzimas das células humanas têm também a capacidade de cortar um grupo metilo indevidamente ligado a um nucleotídeo.

Reparação por remoção e substituição de bases ou de nucleotídeos O processo de base-excision-repair (reparação por excisão de uma base) é útil para quando ocorrem desaminações, um tipo de mutação muito frequente. Dessa forma, quando devido a este tipo de mutações, se geram nucleotídeos errados, a enzima DNAglicosilase quebra as ligações entre a base nucleotídica e a desoxirribose, deixando o local apuriníco, ou apirimídico – temos então um AP-site. Os AP-sites também se podem formar por perda espontânea de uma base. De seguida, a AP endonuclease corta a ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos, no AP-site e a desoxirribosefosfodiesterase, uma exonuclease, remove o que restava daquele nucleotídeo

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antigo. Isto permite finalmente que a DNA polimerase e a DNA ligase possam repor o nucleotídeo correcto. Todavia, muitas mutações não podem ser corrigidas simplesmente pela remoção de uma base e um nucleotídeo mutado altera, inclusive, a configuração local da molécula de DNA. Quando temos dímeros de timina e de citosina, o processo utilizado é a nucleotide excision repair , onde as helicases removem uma grande quantidade de nucleotídeos adjacentes ao dímero. Posteriormente, reconstrói-se a região em falta, com recurso à DNA polimerase e à DNA ligase. Nas células dos mamíferos, estes danos do DNA são reconhecidos pelas proteínas XPA – XPG (sendo que algumas destas proteínas têm também função de helicase e até endonuclease), e mutações nestas levam à doença Xeroderma pigmentosum, onde se registam frequentes tumores cutâneos. O processo de reparação do DNA associada à transcrição em células eucarióticas (transcription-coupled repair ) é importante na medida em que as mutações do DNA são reparadas mais rapidamente se ocorrerem numa região transcricionalmente activa, pois as RNA polimerase que estão a fazer a transcrição param se encontrarem um dano que lhes impeça de realizar a sua função. Essa paragem é prontamente detectada pelas proteínas CSA e CSB que activam as proteínas XPA-XPG, que realizam um processo que será depois similar ao anterior. Associado à deficiência na capacidade das células repararem DNA que está sendo transcrito, temos o síndrome de Cockayne, cujos pacientes apresentam desordens multi-sistémicas.

Reparação associada à replicação Após ocorrer replicação de DNA, a enzima DNA polimerase tem capacidade de proof-reading e detecta emparelhamentos errados, substituindo-os por correctos. Porém, por vezes escapam mismatches. Estes mismatches são detectados e corrigidos pelo processo de mismatch repair , que ocorre após a replicação do DNA. A detecção de regiões onde ocorrem malemparelhamentos é feita à conta de proteínas, nomeadamente, nos procariotas, as proteínas Mut (Mut S, Mut L e Mut H), que reconhecem nucleótidos metilados. A Mut L, a Mut S, uma helicase e uma exonuclease contribuem para a excisão do fragmento onde se encontra o nucleótido mal-emparelhado. Finalmente, a DNA polimerase e a DNA ligase colocam um fragmento correcto, em substituição.

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Nos eucariotas, o mismatch repair é operado pelas proteínas MSH. O reconhecimento do mismatch é levado a cabo pela MSH2 e MSH6, a excisão pela DNA helicase, pela DNA exonuclease, pela MLH1 endonuclease e pela PMS2. Finalmente, a regeneração da cadeia fragmentada é levada a cabo pela DNA polímerase e pela DNA ligase. Apesar disso, não se sabe muito bem como é que as MSH detectam quais os nucleótidos que foram colocados erradamente. Mutações nas proteínas MSH leva a uma tendência para os indivíduos desenvolverem cancro do colo do útero e colo-rectal.

Reparação error-prone Quando nenhum dos mecanismos enumerados anteriormente funciona e quando, aquando de uma nova replicação, a DNA polimerase encontra uma situação aberrante (por exemplo, um dímero de timina), esta enzima pára a sua actividade, pois não sabe o que fazer. Passa então a actuar uma nova DNA polimerase – a DNA polimerase error-prone –

que não tem capacidade de proof-reading e inicia a polimerização de nucleotídeos “à toa”, inserindo muitos por estimativa (e obviamente, muitos errados). Contudo, isto evita que a célula morra, algo que aconteceria, caso não ocorresse replicação, de todo. A cadeia nova que se forma, serve então como molde para a remoção do erro que estava na cadeia original. Este processo designa-se por reparação por translesion DNA synthesis , ou reparação error-prone.

Reparação por end-joining O processo de reparação por end-joining ocorre, quando se verificam quebras na dupla cadeia de DNA. Ocorre então o reconhecimento dessas extremidades por parte das proteínas Ku e por acção destas e de outras proteínas, ocorre remoção de nucleotídeos próximos das extremidades e, depois, junção destas. Isto, claro, leva a perda de informação genética.

Recombinação homóloga do DNA Já o processo de recombinação homóloga do DNA ocorre entre regiões homólogas de cromossomas muito similares, aquando de um fragmento num

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dos cromossomas. Ocorre então remoção da região em torno das extremidades do fragmento, por acção de uma exonuclease e forma-se posteriormente um heteroduplex, após uma strand invasion, operada pelo cromossoma homólogo. O heteroduplex formado permite que a cadeia com a região fragmentada, por complementaridade de bases, relativamente ao cromossoma homólogo, possa “preencher” a região em

falta. As proteínas RecA (nos procariontes) e Rad51 (nos mamíferos) são essenciais para a formação do heteroduplex, pois catalisam a ligação de uma cadeia simples de DNA a uma dupla. A proteína Rad52 favorece a ligação da Rad51 à cadeia simples de DNA. As regiões de heteroduplex podem migrar da cadeia dupla, espalhando-se por branch migration. Isto pode ocorrer sem acção de enzimas (e então ocorre bidireccionalmente) ou, unidireccionalmente, com acção de enzimas (com função de helicase). Neste processo não ocorre perda de nucleotídeos. A recombinação molecular genética homóloga que ocorre na meiose é muito similar à reparação por recombinação. A Spo11 e a Mre11 vão começar por provocar falhas na molécula de DNA de um cromossoma, estimulando-a à invasão do cromossoma vizinho, promovendo-se assim a recombinação genética homóloga, através das junções de Holliday (uma junção móvel entre quatro cadeias de DNA).

Isto permite o processo designado por crossingover , que ocorre em cerca de 10% das moléculas de DNA, bem como o processo de conversão genética. Enquanto no processo de crossing-over ocorre uma troca de segmentos entre cromossomas, no processo de conversão genética um cromossoma transfere uma pequena porção para outro (sem que haja perda de informação genética para o cromossoma dador). A recombinação pode ser prevenida, caso não haja homologia entre as sequências de nucleotídeos, através de um mecanismo de mismatch repair .

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Recombinação não-homóloga do DNA A recombinação não-homóloga de DNA não implica homologia de sequências específicas de DNA. Participam neste processo, recombinases que funcionam de modo similar às topo-isomerases. As recombinases reconhecem dadas sequências de DNA, cortam-nas e recombinam-nas com sequências não-homólogas. Este processo de “ site specific recombination” é muito importante para a formação dos anticorpos e daí, 25000 genes originarem cerca de 10 11 anticorpos diferentes. Este processo de RV(D)J Recombination é possível graças à presença das proteínas RAG 1 e RAG 2, expressas especificamente nos linfócitos.                                                               

Esta diversidade tal de anticorpos é essencial ao funcionamento do sistema imunitário dos vertebrados, na medida em que permite que uma imensa quantidade de antigénios seja reconhecida.

Amplificação genética Em algumas células como as tumorais ou de ovócito, alguns genes são replicados muitas vezes (muito amplificados) antes de se dar a replicação completa do genoma total, num processo designado por amplificação genética. Isto permite aumentar a influência que esse gene apresenta no fenótipo.

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Transcrição: Síntese do RNA mensageiro A ribose é o monossacarídeo presente na molécula de RNA. Esta estrutura tem um grupo –HO, em vez de um grupo –H, no carbono 2, como acontece com a desoxirribose. Isto torna o RNA muito mais reactivo e leva a que este se encontre, quase sempre, sob a forma de cadeia simples (estrutura primária do RNA). Apesar disso, o RNA pode assumir estruturas tri-dimensionais, que determinam diferentes funções. De entre as estruturas secundárias formadas encontramos o hairpin e o stem loop e de entre as terciárias, destaque para o pseudo-nó. A formação de estruturas tri-dimensionais do RNA é muito importante, na medida em que permite a activação de reacções químicas, por parte do RNA. As ribozimas são então RNA com actividade enzimática.

RNA polimerases e RNAs transcritos A transcrição de DNA é entendida pela polimerização de RNA utilizando uma cadeia molde de DNA, adicionando-se ribonucleotídeos por complementaridade de bases. O crescimento da cadeia de RNA ocorre sempre de 5’ para 3’, sendo a reacção catalisada pelas RNA polimerases, sem necessidade da adição prévia de primers. Existem três classes de RNA polimerases que codificam diferentes RNAs:

Estas enzimas distinguem-se também pela diferente sensibilidade a uma toxina, a α-amanitina, sendo que a RNA polimerase II é mais sensível que a RNA polimerase III a RNA polimerase I é lhe insensível. Todas as RNA polimerases são constituídas por várias subunidades, algumas delas homólogas com as da DNA polimerase, sendo a estrutura dessas subunidades muito conservada durante a evolução. De entre

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as subunidades encontramos duas maiores do tipo β (as quais nos eucariotas, denominamos por RPB1 e RPB2 ), duas do tipo α e uma do tipo ω. As RNA polimerases adicionam erradamente 1 em cada 10000 nucleotídeos. Contudo, estas enzimas possuem capacidade de proof-reading (não tão elevada como a da DNA polimerase). A RNA polimerase II apresenta, numa das suas subunidades grandes, uma cadeia carboxílica terminal ( C Terminal Domain), que é constituída por cadeias repetidas de sete aminoácidos, variando o número de repetições entre 26 e 52 (são 52 nos vertebrados). Esta cadeia sofre hiperfosforilação durante a etapa de iniciação da transcrição, sendo essencial no processo de transcrição, nomeadamente, em regiões onde existe muita actividade nesse sentido.

Transcrição do DNA em mRNA O processo de transcrição de DNA inicia-se ao nível do nucleotídeo +1. Todos os nucleótidos que se encontram antes desse nucleótido, dizem que se encontram “a montante”, ou upstream , sendo contados negativamente. Dos nucleótidos que se encontram depois, diz- se que estão a “jusante”, o u downstream, contando-se positivamente. Este processo envolve genericamente três etapas – iniciação (que concerne a abertura da cadeia de DNA, ficando desemparelhados 14 nucleotídeos), a fase de alongamento e a terminação. As sequências de consenso são sequências com cerca de 10 nucleotídeos, que são muito conservadas e que se encontram próximas dos locais de início de transcrição. A estas sequências, da qual é exemplo a TATA box, ligam-se factores proteicos, essenciais para que a RNA polimerase possa actuar. Alguns genes, contudo, não necessitam de sequências de consenso dos promotores para serem transcritos, apresentando estes, normalmente, baixa actividade transcriptiva. Existem ainda regiões do DNA que funcionam como activadoras e de aumento da actividade transcriptiva – são os Promotor-proximal elements, que se encontram 100 a 200 bp upstream do local +1 e os enhancers, a mais de 200 bp do local +1 (quer upstream, quer downstream). O complexo mediador é o responsável por “fazer a ponte” entre a RNA polimerase II e as regiões activadoras.

A TBP liga-se à TATA box, seguindo-se o TFIID (o maior transcription factor destes aqui presentes) e o TFIIB (TF significa transcription factor ). Liga-se então a RNA polimerase II e, simultaneamente, o TFIIF. Por último, liga-se o TFIIE e o TFIIH, ficando assim formado o complexo de iniciação. O TFIIH tem função de helicase, permitindo a abertura da cadeia de DNA e de síntese, ligando grupos fosforilados à cadeia carboxílica terminal (a ordem de ligação dos factores d e transcrição é dada pela mnemónica, “Deus Bom, Fé Em altura”, representando -se a altura por h como na física).

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Assim que se dá a fosforilação da CTD e adição do primeiro ribonucleotídeo, desmonta-se o complexo de iniciação e inicia-se a fase de alongamento. Nas células eucarióticas, a velocidade de adição de ribonucleotídeos é muito reduzida, nomeadamente devido ao super-enrolamento verificado no DNA, a jusante da RNA polimerase e que é gerado pela própria enzima (que paradoxalmente facilita o desenrolamento do DNA à volta das histonas nos nucleossomas). Contudo, o recurso a topo-isomerases para desenrolar a cadeia é por vezes necessário. No pré-mRNA formado existem sequências de ribonucleotídeos que assinalam o início e o fim da transcrição. O início é marcado pelo elemento upstream, enquanto o fim é marcado pelo elemento downstream.

Processamento Após a transcrição forma-se um pré-mRNA, ou seja um mRNA que ainda não sofreu processamento e que ainda não está pronto para ser traduzido. O processamento conduz assim à formação de um mRNA maduro e envolve a ocorrência de capping, clivagem, splicing e poli-adenilação. O capping ocorre na extremidade 5’, que se liga a uma guanosina, quando o mRNA começa a sair da RNA polimerase (através de uma ligação 5’ -5’). Essa guanosina é então metilada, originando-se 7-metilguanosina. O cap permite a protecção da extremidade 5’ da degradação enzimática e que aquela molécula seja reconhecida como mRNA. Por

outro lado, o cap é um factor que contribui no transporte do mRNA para o citoplasma. De referir que o capping ocorre concomitantemente à metilação da ribose do primeiro nucleotídeo. Ao mRNA recém-formado ligam-se também proteínas (levando à formação de ribonucleoproteínas RNP), com o objectivo de prevenir a formação de estruturas tri-dimensionais e de reconhecimento de sequências de nucleotídeos. Existem igualmente RNA-binding proteins, cujo objectivo é o de manter a estabilidade do RNA. Na clivagem (cleavage) ocorre um corte na molécula de pré-mRNA, no sentido da região do elemento downstream (ou seja na extremidade 3’), algo que é catalisado

por endonucleases e que requer a existência de factores de estimulação deste processo, nomeadamente o CstF e o CPSF.

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O processo de splicing, por sua vez, consiste na remoção dos intrões do pré-mRNA. Quando este é muito longo e contém muitos intrões, o splicing é feito ainda aquando da transcrição. Contudo, quando o pré-mRNA é pequeno, ocorre mais ou menos simultaneamente splicing e poli-adenilação. A poliadenilação é um processo que consiste na adição de uma cauda poli-A (sem que seja necessária a adição de outras estruturas prévias), constituída por uma elevada quantidade de adeninas, à extremidade 3’, por acção da enzima PAP ( polyadenylate polymerase ). A cauda poli-A impede a degradação do mRNA, podendo-se ligar proteínas a esta estrutura – as poli-A binding proteins. Para que ocorra splicing é necessária a intervenção de pequenos RNA, que reconhecem regiões de intrões e promovem a sua eliminação da cadeia de mRNA. O mecanismo de splicing envolve então o reconhecimento de três sequências de consenso do intrão – o local de splicing em 5’, o local de splicing em 3’ e o branch point (sítio de ramificação, onde a extremidade 5’ se vai ligar) Dessa forma, compreende-se que o emparelhamento entre o pré-mRNA e os pequenos RNA (nomeadamente os pequenos RNA U1 e U2) seja essencial para que ocorra este processo . O primeiro pequeno RNA a ligarse é o U1, na extremidade 5’ de um intrão. Seguem -se as proteínas/factores de splicing BBP e U2AF e posteriormente liga-se, no branch point , o pequeno RNA U2. Ligam-se depois os pequenos RNAs U4, U5 e U6, sendo formado um complexo ribo-proteico, ao qual se dá o nome de spliceossoma, que tem aproximadamente a massa de um ribossoma. Após sucessivas ligações RNA-RNA, que envolvem gastos de ATP, o intrão é eliminado da cadeia de RNA, sob a forma de lariat intron (intrão em forma de laço) e, já sob a forma linear, degradado no interior do núcleo, por acção de enzimas. De forma a não serem removidos os exões, durante o processo de splicing, ligam-se proteínas aos exões – as proteínas SR. Os intrões, de maiores dimensões, formam complexos hnRNP (heterogeneous nuclear riboproteins) e são posteriormente degradados. Estas ligações são fundamentais, de forma a permitir que o spliceossoma distinga intrões de exões. Se um exão for removido indevidamente, podem ser originadas patologias, da qual é exemplo a atrofia muscular espinhal .

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Nas células eucarióticas há outros mecanismos de splicing, que são, contudo mais raros, nomeadamente o splicing do tipo U12, que ocorre com ligação do pequeno RNA U11 à extremidade 5’ do intrão e do pequeno RNA U12 ao branch point . Já o trans-splicing consiste num mecanismo, em que dois exões separados se ligam, ocorrendo concomitantemente remoção do fragmento de intrão que entre eles se interpunha. Este processo ocorre com a intervenção de pequenos RNA e é característico do Trypanosoma e dos nemátodos. Em alguns protozoários existe self-splicing, onde o próprio RNA catalisa as reacções de splicing , sem que haja intervenção de proteínas. No self-splicing, um cofactor de guanosina liga-se ao local de splicing em 5’ do intrão, que tem actividade enzimática ( Grupo I); ou o próprio intrão apresenta uma adenosina que “ataca” o local de splicing em 5’, catalisando a sua clivagem ( Grupo II) e, consequentemente, a sua própria remoção. O splicing alternativo ocorre em fragmentos que contenham muitos exões, podendo ser removidos alguns, sem perda de função celular e, como tal, podem ocorrer inúmeras combinações entre exões, o que contribui para um aumento da variabilidade genética. Analogamente ao splicing alternativo, existe também cleavage alternativa.

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Transcrição do DNA: Síntese do tRNA e do rRNA Numa célula em crescimento rápido, cerca de 80% do RNA é rRNA, sendo que quanto maior for a actividade metabólica da célula, maior a percentagem de rRNA. O tRNA, por sua vez, conta cerca de 15% da quantidade de RNA existente na célula e apenas 5% do RNA celular é mRNA.

Síntese do rRNA A RNA polimerase I participa ao nível da síntese de rRNA, actuando unicamente ao nível dos nucléolos, onde este processo ocorre. Um nucléolo é constituído por um componente fibrilar denso, um centro fibirlar e um componente granular. O componente fibrilar denso, que apresenta um aspecto mais escuro, quando visualizado em microscopia electrónica, é o local onde ocorre síntese activa de rRNA. Este migra para o componente granular , o local do nucléolo, onde é visível a presença de grânulos de cerca de 15 nm de diâmetero e onde ocorre a maturação do rRNA, através da sua clivagem. O centro fibrilar apresenta um aspecto mais claro, onde está presente o DNA codificante de rRNA, que não está transcricionalmente activo naquele momento. Finalmente, completada a maturação, o rRNA migra para o citoplasma. No final da telofase, aparecem vários pequenos nucléolos, que depois se unem, aquando da replicação do DNA e se separam outra vez, aquando da mitose. Como já foi referido, quanto maior forem as dimensões e o número de nucléolos, maior a actividade metabólica da célula. Os genes que codificam os nucléolos, no final da telofase, são os NOR (organizadores nucleolares), que não se encontram no nucléolo (nesta estrutura apenas encontramos genes que codificam para rRNA), mas nos pares de cromossomas 13,14,15, 21 e 22. A transcrição activa de rRNA pode ser observada através das imagens de árvore de Natal. A bactéria E. coli apresenta 7 cópias para o gene que codifica rRNA, enquanto o ser humano tem entre 200 e 250 cópias, não sendo todas transcritas activamente, em simultâneo. Este número muito elevado de cópias, permite a produção de muitas cópias de rRNA por intervalo de tempo. Estas cópias dispõe-se numa sequência em tandem array, constituída por sequências de unidades de transcrição intervaladas com DNA spacers, que não são transcritos. Nas unidades de transcrição, existem ainda partes que são transcritas, mas não são

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codificantes. No DNA que codifica o pré-rRNA, existe um upstream element (UCE) , a entre 155 e 60 nucleotídeos a montante do local de início da transcrição e um core element que se encontra no local entre -40 e +5. Para a RNA polimerase I se ligar aos promotores é necessário que se liguem primeiro factores de transcrição, nomeadamente, o UBF (upstream transcription factor ) , o Selectivity Factor 1 (SL-1, composto pelos TAF) e o core factor (CF). O UBF tem como função o reconhecimento do upstream element (sendo por isso um upstream binding factor ), ao qual se liga também o SL-1. O core factor reconhece o core element. Uma das subunidades do SL-1 é a TATA binding protein , apesar de no DNA em questão não existir nenhum promotor com sequência homóloga à TATA box. Após ocorrer o processo de transcrição (que fica completo aquando da clivagem da extremidade 3’ do DNA ), forma-se um transcripto primário com 45S (unidades de sedimentação), que vai sofrer um processamento, que inclui clivagem (é retirada a extremidade 5’ e as regiões não

funcionais) e modificações químicas nas bases (por exemplo, metilações nas riboses). Este transcrito originará, então, por clivagem, uma cadeia de 28S, uma de 5.8S (unindo-se estas duas, que se formam a partir de uma de 32 S, para originar o que será a subunidade grande do ribossoma, juntamente com uma cadeia de 5S) e uma cadeia de 20S (que depois passará a 18S, originando a subunidade pequena do ribossoma). O pequeno RNA U3 é o responsável pela remoção da extremidade 5’, sendo que as restantes regiões não-codificantes de RNA são clivadas e imediatamente degradadas por enzimas. Os snoRNAs (pequenos RNAs nucleolares), que são pequenos RNAs que são transcri tos pela RNA polimerase II, pela RNA polimerase III e até por intrões, participam no processo de processamento de RNA, nomeadamente, por complementaridade de bases, permitem a exposição das bases que devem ser metiladas ou sofrer outras alterações. Os snoRPs box C+D posicionam uma enzima que metilará bases do pré-rRNA (tendo, por isso, actividade de metil-transferase), enquanto os snoRNPs box H + ACA posicionam uma enzima que converte a uridina em pseudouridina. O RNA ribossomal 5S integra a subunidade grande do ribossoma e é sintetizado pela RNA polimerase III. O complexo de iniciação envolve a presença dos factores de transcrição TFIIIA, TFIIIB e TFIIIC (TF significa transcription factor ), sendo o promotor associado a este processo a box c. O ribossoma não é apenas constituído por rRNA, apresentando também proteínas. O processamento do rRNA ocorre simultaneamente à associação com proteínas, sendo

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que a subunidade pequena é “produzida”

mais depressa que a grande, pois começa-se a ligar a proteínas ainda na fase de transcrição. Já a subunidade grande sofre a clivagem final no citoplasma, após ter migrado, algo importante, na medida em que, isto impede que a síntese de proteínas ocorra no núcleo. De referir que a subunidade grande sofre também controlo de qualidade (depois de actuarem helicases, com o objectivo de fazer a clivagem de eventuais snoRNAs que se ligaram ao rRNA). O transporte desta subunidade é também muito lento, visto que esta é do tamanho do poro nuclear, tendo que se desligar primeiro a maior parte das estruturas que lhe estavam ligadas. A RNA polimerase III tem como função a síntese do tRNA, que ocorre ao nível do nucleoplasma. Para se formar o complexo de iniciação para a RNA polimerase III, ligam-se primeiro o TFIIIC (que se liga aos promotores box A e box B) e o TFIIIB. Após a transcrição, o tRNA sintetizado sofre clivagens (nomeadamente na extremidade 5’ e na extremidade 3’). Depois, é adicionada à extremidade 3’, uma

sequência CCA, essencial para a ligação dos aminoácidos, aquando do processo de tradução. Segue-se a

modificação de cerca de 10% dos nucleótidos do tRNA, podendo este ainda sofrer splicing. O splicing no tRNA ocorre exclusivamente por acção de enzimas proteicas, nomeadamente endonucleases, fosfotransferases e ligases. Os tRNA produzidos são exportados para o citoplasma, através do complexo de poro nuclear por acção de uma exportina. Aquando da síntese de snRNAs na presença da RNA-polimerase III, o promotor apresenta a TATA box, estando ligados ao promotor o TFIIIB e o SNAP, aquando da presença do complexo de iniciação.

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Núcleo celular O núcleo é um organelo extremamente dinâmico e que apresenta grandes dimensões, comparativamente aos restantes organelos celulares (cerca de 6 μm, nas células dos mamíferos). A presença deste organelo é um elemento-chave para fazer a distinção entre células eucarióticas e procarióticas.

Observação e estudo do núcleo celular O núcleo cora por acção de corantes básicos, devido à presença substancial de ácidos nucleicos. Contudo, estes corantes não permitem distinguir o DNA e o RNA. Dessa forma, o método de Feulgen emprega-se com o fim de evidenciar histologicamente somente o núcleo – ocorre remoção do RNA existente nos núcleos, por acção do ácido clorídrico, dando-se a quebra entre as ligações ocorridas entre as bases púricas e os grupos desoxirribose. Isto p ermite que haja reacção com o reagente de Schiff e que o DNA apareça visível, de cor vermelha. Utilizando esta técnica, os nucléolos aparecem incolores, pois são, sobretudo, compostos por RNA. A observação do núcleo por imunofluorescência é igualmente possível, sendo utilizado o DAPI, um corante fluorescente, que se liga ao DNA, sendo emitida, por consequência, uma cor azul. O método da contrastação regressiva do EDTA permite igualmente o estudo do núcleo celular – entre a aplicação de acetato de uranilo e citrato de chumbo, utiliza-se EDTA, um ácido que permite a obtenção de um “negativo” do que

seriam as imagens de normal contraste, isto é, as partes claras correspondem a locais de maior presença de DNA e as partes mais escuras a locais como fibirlas e grânulos. Os núcleos celulares podem igualmente ser isolados e purificados por ultracentrifugação, sendo os primeiros organelos a sedimentar, devido à sua massa.

Territórios cromossómicos e corpos nucleares As moléculas de DNA, em interfase, não ocupa áreas aleatórias do núcleo, designando-se essas áreas restritas ocupadas por cada cromossoma por território cromossómico. Após cada ciclo celular, os cromossomas continuam a ocupar aproximadamente os mesmos territórios cromossómicos. Entre esses territórios, existem domínios intercromossómicos, onde ocorrem reacções muito importantes. No núcleo encontramos vários domínios, denominados corpos nucleares (também designados por domínios nucleares), que não são rodeados por membranas, mas que mesmo assim, apresentam concentrações elevadas de proteínas específicas e RNAs, o que leva à formação de estruturas quase esféricas. Os corpos nucleares mais

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proeminentes são os nucléolos. Contudo, existem muitos outros que têm vindo a ser detectados devido a técnicas de imunofluorescência ou à contrastação progressiva por EDTA. Os focos ou fábricas de replicação são os locais onde se origina a replicação cromossómica, sendo que estes só se observam durante a fase S do ciclo celular. Já os domínios de transcrição podem ser observados recorrendo a técnicas de imunofluorescência, quer no núcleo, quer nos nucléolos. Os locais onde ocorre a síntese e amadurecimento dos rRNA são os nucléolos, locais onde é possível distinguir um componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular . Os nucléolos são formados em torno de loci específicos – os NORs (regiões organizadoras de nucléolos). As fibrilas pericromatínicas estão sempre entre os domínios intercromossómicos, na periferia da cromatina condensada. As fibrilas são enriquecidas em RNA e provavelmente são locais de splicing do pré-mRNA e de poliadenilação. Os grânulos pericromáticos são regiões cuja função ainda não é bem conhecida. Provavelmente, participam na acumulação de transcritos primários de RNA pré-mensageiro, que não sofreram amadurecimento (por exemplo, splicing), não tendo sido ainda degradados. Em microscopia electrónica, estes grânulos são regiões escuras, rodeadas por uma auréola clara. Os gânglios intercromatínicos são também designados por speckles , sendo pequenas estruturas de difícil visualização, devido ao facto de não se encontrarem em regiões de ocorrência de splicing. Pensase que estas estruturas estão relacionadas com o armazenamento de snRPs e proteínas envolvidas no splicing de pré-mRNa, que são lançadas no nucleoplasma, quando é necessário. Os corpos espiralados, também designados por corpos de Cajal são locais onde os pequenos RNAs são produzidos, sofrem maturação e são reciclados. Acredita-se que o processamento das histonas do mRNA também ocorre ao nível dos corpos de Cajal. Cada célula eucariótica tem entre 3 e 10 corpos de Cajal e estes são identificados graças à presença de coilina, o seu principal componente. Esta proteína, que permite a ligação do corpo de Cajal ao nucléolo, hibridiza com a GFP, permitindo a detecção dos corpos de Cajal. Os corpos nucleares PML (Promyelocytic Leukemia) apresentam essa designação (associada à leucemia), pois neles está presente uma mutação em indivíduos que padecem de leucemia. Existem entre 10 e 30 corpos nucleares PML por núcleo, embora não haja certeza relativamente à sua função. Provavelmente, estes corpos funcionam como locais para modificação de complexos proteicos envolvidos na reparação de DNA e na indução de apoptose. Os corpos nucleares simples e os corpos nucleares complexos têm ainda função desconhecida, embora se saiba que surgem aquando de um estímulo hormonal.

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A matriz nuclear é entendida como um “citosqueleto do núcleo”. Desconhece -se se esta existe de facto, ou se as observações que induzem a crer na existência desta estrutura não são mais que o resultado das preparações agressivas (quer por método de Comerford, quer por método de Kaufmann) às quais o núcleo é sujeito, quando se procura averiguar a existência da matriz.

Invólucro nuclear O invólucro nuclear delimita o núcleo e é formado por uma membrana externa (com ribossomas associados e em continuidade com o retículo endoplasmático rugoso), uma membrana interna, separada da externa pela cisterna perinuclear . Profundamente, à membrana interna encontramos a lâmina nuclear, que é fibrosa e de difícil visualização e dissociação. A atravessar o invólucro nuclear encontramos poros nucleares. Relativamente às lâminas nucleares, sabe-se que estas estruturas contribuem para a regulação da replicação do DNA e da divisão celular, para a organização da cromatina e como forma de ancorar os complexos de poro nuclear. As lâminas nucleares, ao ligarem-se firmemente à membrana interna, dão mais resistência ao núcleo. Estas estruturas são compostas por laminas (as laminas A, B e C ), cuja fosforilação leva à desagregação do invólucro nuclear durante a profase. A desfosforilação das laminas leva à reorganização do invólucro nuclear. Quando ocorrem mutações nas lâminas nucleares podem ocorrer laminopatias, patologias que resultam muitas vezes em progerias (doenças do envelhecimento acelerado) e distrofias musculares. O complexo do poro nuclear é formado por nucleoporinas e está fortemente ligado à lâmina nuclear. Estes complexos são estruturas de grande dimensão que apresentam simetria octogonal, formando uma estrutura “em cesto”. Estes complexos são essenciais para o processo de transporte nuclea r. Os canais aquosos são constituídos também por nucleoporinas, dispostas num arranjo em malha, podendo ser atravessados por pequenas moléculas ou iões, por difusão simples. Moléculas com massa

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molecular superior a 40 kDa podem atravessar os canais aquosos, mas esse transporte depende de um rearranjo da malha das nucleoporinas, de modo a ser possível formar um espaço maior.

Importação e exportação de proteínas A importação de proteínas do citoplasma é levada a cabo pelas importinas. Estas proteínas ligam-se a proteínas ligadas a NLS (sequências de reconhecimento nuclear) no citoplasma, formando o complexo de carga. O complexo, por sua vez, entra no nucleoplasma, juntamente com o Ran-GDP. No citoplasma, o Ran-GDP é fosforilado (à conta de GTP, numa reacção que envolve o composto GEF - guanine nucleotide exchange factor – como “agente intermediário”), originando Ran-GTP, que se liga à importina, levando ao desligamento da proteína de carga. O complexo formado pelo Ran-GTP e pela importina atravessa então o poro nuclear e no citoplasma, este desmembra-se, por desfosforilação do Ran-GTP. Já a exportação de proteínas do núcleo é feita à conta da formação de um complexo, no núcleo, que envolve a ligação de uma exportina a uma proteína ligada a NES (Nuclear export sign ) e a Ran-GTP. Este complexo atravessa o poro nuclear e no citoplasma desmembra-se, devido à desfosforilação do RanGTP. Posteriormente, a exportina que é libertada no decurso dessa reacção entra “sozinha” no núcleo.

As proteínas responsáveis pela importação e pela exportação de proteínas (importinas e exportinas) são genericamente classificadas como carioferinas. A exportação de tRNAs e subunidades ribossomais ocorre de forma similar, mas o tRNA liga-se directamente à exportina-t, enquanto as subunidades do ribossoma ligam-se à exportina Crm1.

Importação e exportação de RNA A exportação de mRNA do núcleo não depende de Ran-GTP, sendo controlada por fosforilação e desfosforilação de proteínas. Os mRNAs são então transportados pelo complexo de poro nuclear através do mRNA exporter , um heterodímero. A ligação entre o mRNA e o complexo é levada a cabo pelo Factor de exportação nuclear 1 (NXF1) e ocorre à conta de uma desfosforilação. Ainda no núcleo, antes do

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mRNA atravessar o poro nuclear, algumas proteínas dissociam-se nos complexos formados, algo que ocorre à conta de uma fosforilação do complexo Npl3 associado ao mRNA. Outras são exportadas juntamente com o mRNA, dissociando- se no citoplasma (passando, depois, “livres” para o núcleo). Os snRNA, por sua vez, são exportados do núcleo integrados num complexo proteico. Estes complexos atravessam o poro nuclear e dissociam-se no citoplasma. A entrada nos snRNAs para o núcleo é feita por via de complexos proteicos com várias binding proteins – os snRNPs. As hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins ) são complexos formados com pré-mRNA e proteínas, como forma de indicar que o mRNA ainda não foi processado e que, como tal, ainda não está preparado para ser transportado. Dessa forma, a exportação de RNAs funciona como um sistema de controlo dos RNAs transcriptos. Os mRNA são transportados apenas após splicing completo e os tRNA após modificações nas bases nucleotídicas.

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Genoma humano e doenças associadas ao DNA O cariótipo de um organismo é definido pelo seu número, tamanho e forma dos cromossomas. O cariótipo humano é constituído por 23 pares de cromossomas, sendo cada cromossoma constituído por um braço longo (q) e um braço curto (p). A identificação dos genes é feita em primeiro pelo número do cromossoma onde se encontram, seguindo-se a letra correspondente ao braço e depois o locus.

Genoma e complexidade dos organismos O genoma humano é constituído por cerca de 30 000 genes, tendo cada região codificante 1,4 kb e um gene 30 kb. Cada gene contém oito exões (com 135 bp) e 7 intrões (2200 bp). A densidade genica é de apenas 11,5 genes por cada mega par de bases. Isto mostra que o número de regiões não-codificantes do nosso genoma é muito maior que o número de regiões codificantes. Na verdade, a complexidade dos organismos está intimamente relacionada com a percentagem de regiões não-codificantes no genoma, nomeadamente sequências repetidas, pois quanto maior for esta, mais complexos são os organismos. De resto, a complexidade dos organismos não está relacionada com o tamanho dos genomas nem com o número de genes/cromossomas que estes apresentam.

Constituição do genoma humano Os genes são constituídos por exões (que constituem entre 3 a 5% do genoma humano) e intrões, sendo os intrões regiões não-codificantes. Do genoma humano fazem ainda parte os pseudogenes – unidades não-funcionais resultantes da duplicação de genes previamente existentes. Estas duplicações do DNA ocorrem aquando da replicação de um gene original e vão adquirindo mutações ao longo do tempo, sem que para isso comprometam o organismo. Isto é um importante factor evolutivo, na medida em que o pseudogene vai adquirindo características próprias e, eventualmente, funcionalidade, o que está na base do aparecimento de famílias proteicas. O conceito de “um gene, uma proteína” está hoje completamente obsoleto, pois devido aos processos

de splicing alternativo, ou por locais alternativos de início ( alternative transcription start sites ) e fim da transcrição (alternative transcription termination sites ), um determinado gene origina mais que um mRNA e, por consequência, mais que uma proteína. De referir que a mesma porção de DNA pode conter

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genes diferentes, sobrepostos e em orientação oposta. Por exemplo os intrões de um dado gene podem conter os exões de outro gene garantido a não partilha de regiões exónicas. Também

existe RNA não codificante (ncRNA), que não é traduzido (não originando, portanto, nenhuma proteína), mas que desempenha funções importantes na célula.

Sequências repetidas do genoma No genoma humano existem sequências repetidas, que se podem classificar em sequências repetidas em tandem e sequências intercaladas. As sequências repetidas em tandem são também denominadas por DNA e consistem em microsatélite repetições de um pequeno conjunto de nucleótidos. Estas sequências classificam-se como STR (short tandem repeat ), caso o número de repetições seja inferior a 10, ou VNTR ( variable number of tandem repeat ), caso o número de repetições seja inferior a 50. Estas repetições originam-se aquando da replicação do DNA e, dado o seu grau elevado de variabilidade, são amplamente utilizadas em testes de paternidade ou na investigação forense, em processos como o DNA fingerprint. As sequências repetidas em tandem representam cerca de 10% do nosso genoma. As sequências intercaladas são também designadas por transposões e são elementos móveis não-funcionais, que constituem entre 30% a 45% do nosso genoma. O processo pelo qual estes elementos móveis são copiados e inseridos em novos locais no genoma é denominado de transposição. Os DNA transposões são obtidos por cópia de uma sequência de DNA e “colagem”

noutro sítio, enquanto os retrotransposões formam-se através de uma cópia de RNA, que através da enzima transcriptase reversa é reconvertida em DNA, que se insere noutro sítio. Os retrotransposões podem ser de vários tipos, destacando-se os SINEs (short interspersed repeated sequences), cujo número de bases é inferior a 500, e os LINEs (long interspersed repeated sequences), que têm origem viral.

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Os transposões são importantes veículos em termos de evolução e diversidade genética, uma vez que a transposição genética, ao ocorrer, “arrasta” consigo, por vezes, genes adjacentes, que ao mudarem de

posição adquirem novas funções. Contudo, o processo de transposição ocorre muito pouco frequentemente na espécie humana, verificando-se sobretudo ao nível das células germinativas. Calcula-se que uma transposição ocorra nos seres humanos uma vez, em cada oito indivíduos!

Mutações Uma mutação é entendida como uma qualquer alteração na sequência de DNA. Estima-se que ocorra uma taxa de três mutações por indivíduo em cada geração, sendo as suas causas diversas. Parte das mutações são transmitidas hereditariamente, mas existem outras que estão associadas a danos no DNA provocados por factores ambientais (como o tabaco), ou agentes químicos (como a radiação UV). Também eventos genéticos como a recombinação ou a transposição podem levar à ocorrência de mutações. De referir que o último nucleótido do codão é o menos importante e o que mais sofre mutações. Os polimorfismos são modificações do genoma humano, que são frequentes (a sua frequência na população excede o 1%, algo que ocorre por exemplo ao nível da anemia falciforme, que representava uma vantagem evolutiva nos países onde a malária é endémica, visto proteger os indivíduos contra essa doença). Podem ser silenciosos ou manifestar-se, por exemplo, como uma patologia. Contudo, mesmo os polimorfismos silenciosos podem se manifestar através de uma ligeira alteração ou subtilezas no modo de funcionamento, por exemplo, de uma dada proteína.

As mutações podem ser classificadas como génicas (pontuais), se ocorrerem somente numa base ou estruturais (cromossómicas), caso seja afectada uma grande porção do cromossoma. Relativamente às mutações de bases, podemos citar a formação de dímeros de timina por acção da radiação UV , a metilação de citosinas , que pode levar à formação de timinas e o facto das sequências repetidas em tandem serem locais frequentes de inserção/delecção, levando à génese de mutações durante a replicação.

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Em termos de mutações cromossómicas, podemos referir as delecções (perda de segmentos cromossómicos), as translocações (modificação do cromossoma onde estava inserido determinado segmento), as inversões (modificação do local de um dado segmento cromossómico, dentro do próprio cromossoma) e as alterações do número de cópias dos cromossomas. Estas mutações estruturais estão geralmente associadas a graves patologias. Embora as mutações sejam frequentemente entendidas como algo negativo, a verdade é que estas são o grande motor da evolução. Já aqui foi referido, a título de exemplo, o caso do aparecimento dos pseudogenes. Também a mutação que leva à manifestação de anemia falciforme no fenótipo não é de todo prejudicial – é uma alteração génica presente nas populações de origem africana, visto ser benéfica na protecção contra a malária. O OMIM é a base de dados que apresenta toda a informação conhecida sobre patologias genéticas.

Técnicas de Biologia Molecular

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Cerca de 40% do genoma humano ainda está por caracterizar, nomeadamente genes que aparentemente não têm relações com patologias ou com funções básicas do organismo. O estudo do genoma assenta em várias técnicas, que se têm vindo a revelar úteis em termos de avanços da medicina. As técnicas de biologia molecular passam pela análise de ácidos nucleicos, pela análise de proteínas e pela regulação da expressão génica.

PCR O PCR (Polymerase Chain Reaction) é uma técnica que permite amplificar um fragmento de DNA através da utilização de dois primers específicos que determinam o início e o fim da região a amplificar. É igualmente necessária a Taq DNA polimerase - uma DNA polimerase que é obtida através da bactéria Thermus aquaticus e que suporta elevadas temperaturas, pois este processo ocorre em condições térmicas que para a maioria das enzimas são incapacitantes. Finalmente, são necessários desoxirribonucleotídeos, que vão sendo acrescentados às cópias de DNA produzidas. O PCR consiste em 30 ciclos de 3 passos cada – a primeira etapa é a desnaturação da dupla cadeia de DNA (ou seja separação das cadeias), algo que ocorre a uma temperatura situada entre 90º e 100ºC. O segundo passo prendese com a ligação dos primers – esta ocorre a temperaturas situadas entre os 50º e 65ºC e designa-se por annealing. Finalmente, o processo de elongação ocorre a 72ºC, temperatura óptima para a Taq DNA polimerase, sendo neste processo adicionados os restantes nucleótidos. De referir que apenas ao fim de três ciclos, conseguimos ter cadeias duplas com os fragmentos a ser amplificados com as dimensões certas. Actualmente, utiliza-se muito o PCR em tempo real ( Quantitative Real Time PCR), pois este processo permite acompanhar a reacção de amplificação ao longo do tempo, através da molécula de CYBR green, que é fluorescente e se intercala na cadeia dupla de DNA. A quantidade de fluorescência apresentada é assim proporcional à quantidade de DNA produzida.

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Sequenciação de DNA O metódo de Sanger é actualmente o mais utilizado para levar a acabo a sequenciação de DNA, apesar de apenas ser possível a sequenciação de uma cadeia de cada vez. Para que este processo ocorra é necessário que um fragmento de DNA já tenha sido previamente amplificado.

Para que este método ocorra, a síntese de DNA ocorre in vitro, sendo os fragmentos colocados em locais onde existam primers (para ser levada a cabo a iniciação), nucleótidos normais e nucleótidos stop. Existem então quatro locais onde decorrerá a sequência, sendo que cada local apresenta um tipo de nucleotídeo stop diferente (um deles apresenta guanina stop, o outro citosina stop…), contudo, em todos eles apenas existe 1 nucleotídeo stop em cada 100 nucleotídeos . Os nucleotídeos stop, que são na verdade dideoxirribonucleosídeos trifosfato (ddNTP), apresentam um grupo –H ligado ao terceiro carbono, em vez de um grupo –OH. Isto significa que, após um ddNTP ter sido integrado numa cadeia de DNA, mais nenhum nucleotídeo pode ser acrescentado a esta.

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Dessa forma, as reacções procedem de forma muito simples – As DNA polimerases vão integrando nucleótidos nos diferentes fragmentos de DNA presentes. Quando calha de integrar um nucleótido stop numa cadeia de DNA, a polimerização nessa cadeia pára, mas continua nas outras, até à integração de nucleótidos stop nestas. Depois, para analisar a sequência de DNA procede-se à electroforese em gel de agarose, havendo revelação por autorradiografia ou à análise automática por uma máquina sequenciadora.

DNA microarray O DNA microarray , ou chip array , permite analisar em simultâneo a expressão diferencial de milhares de genes em populares celulares diferentes, algo particularmente útil para o estudo de doenças poligénicas, como o Alzheimer, a esquizofrenia, ou o cancro. Para levar a cabo este processo, extrai-se o mRNA de indivíduos de dois grupos, sendo que através da trasncriptase reversa procede-se à síntese do respectivo cDNA. O cDNA é depois marcado com cores fluorescentes diferentes, para distinguir os grupos. Os cDNAs são depois misturados e hibridizados com as cadeias presentes nos chips (onde encontramos todos os genes com uma localização conhecida em diferentes spots). De seguida, procede-se à sobreposição dos scans obtidos nos chips, permitindo, pelas cores registadas em cada spot compreender quais os genes expressos em ambos os grupos e em cada um dos grupos.

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Isto permite, a título de exemplo, classificar vários tipos de cancro, nomeadamente que se traduzem num fenótipo similar, de acordo com o seu perfil de expressão genética. Isto é muito útil para a administração de uma terapia personalizada, de acordo com as características genéticas do indivíduo.

DNA recombinante em bactérias O DNA recombinante permite a inserção e propagação de DNA (por exemplo, um gene que codifica uma proteína de interesse) em bactérias (geralmente a E. coli ) e requer para isso uma inserção contendo o gene de interesse, um vector (um plasmídeo, geralmente). Os plasmídeos são porções de DNA circular, que não são essenciais para a sobrevivência das bactérias e cuja replicação é independente da do restante DNA bacteriano, apresentando por isso uma origem de replicação. Neste processo intervêm enzimas de restrição, endonucleases que reconhecem sequências específicas de 4 a 8 nucleótidos e que fazem a clivagem dessas sequências palindrómicas (ou seja, que apresentam um eixo de simetria). Essa clivagem origina extremidades “blunt ” (ou seja, extremidades em que o corte é feito de forma abrupta, orientado segundo uma linha recta), ou extremidades coesivas (extremidades em que o corte é feito em “ziguezague”, formando uma espécie de encaixe) nos fragmentos de DNA. De referir que apenas são

utilizadas neste processo as enzimas que fragmentam o DNA, deixando extremidades coesivas. O fragmento de DNA é então introduzido e integrado no plasmídeo, por acção da enzima DNA ligase (a maior parte das vezes é utilizada a T4 DNA ligase). A entrada do plasmídeo para a bactéria, por sua vez, é feita por choque térmico (transformação bacteriana por método químico ), ou por um choque eléctrico (transformação bacteriana por electroporação). Para seleccionarmos quais os indivíduos que apresentam a inserção, colocamos as bactérias num meio com um antibiótico, visto que na inserção é sempre colocado juntamente com o gene de interesse, um gene que confere resistência a um antibiótico, já com o intuito de fazer essa selecção. Obviamente, que as bactérias que não apresentam a inserção morrem, aquando do contacto com o antibiótico. Finalmente, as bactérias sobreviventes são então colocadas num meio de cultura, de forma a possibilitar a síntese da proteína de interesse. Actualmente,

é

possível realizar o processo de transfecção – inserção de plasmídeos em células eucarióticas e, inclusive, usar outros vectores que não plasmídeos, tais como fagos lambda.

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Síntese e degradação proteica Todos os componentes celulares têm um tempo de semi-vida, o qual é designado por turn-over e isto inclui as proteínas, sendo que o seu turn-over é variável de acordo com a sua utilidade (proteínas mais importantes, têm um período de semi-vida maior) e daí ser importante falar em síntese e degradação proteica. O dogma central da biologia celular assenta na ideia de que o DNA é transcrito em RNA, sendo a informação contida no mRNA traduzida em proteínas. Contudo, é importante referir que para a síntese proteica não intervém apenas o mRNA – o tRNA é também essencial, porque trazem aminoácidos para o ribossoma, enquanto moléculas de rRNA estão contidas na “maquinaria” dos ribossomas.

Estrutura do mRNA O mRNA apresenta, na su a extremidade 5’, um cap (7-metilguanoisna, que é vital para o reconhecimento e ligação do mRNA ao ribossoma, bem como para a protecção contra exonucleases) e na sua extremidade 3’, uma cauda poli-A, que contém entre 150 a 200 nucleótidos de adenina e que protege o mRNA da degradação. No mRNA está ainda contida uma região, a ORF (ou Open Reading Frame), que contém o conjunto de informação que será traduzida, sendo a ORF ladeada pela 5’UTR e pela 3’UTR, regiões que não serão traduzidas, mas que contêm informações sobre o turn-over do mRNA. As regiões UTR ( Untranslated Regions) contêm, portanto, informações relativamente à estabilidade do mRNA, contribuindo para esta. De referir que o mRNA é sempre lido de 5’ para 3’ e a construção dos

polipeptídeos é sempre feita do terminal amina, para o terminal carboxilo.

Dada a redundância do código genético (um aminoácido pode ser “codificado” por vários codões), cada aminoácido pode se ligar a vários tRNAs. Apesar disso, não existe ambiguidade no código genético, ou seja, um codão não pode codificar vários aminoácidos. Existem ainda três codões stop (UGA, UAA e UAG, decoráveis através da mnemónica “U Go Away, U Are Away, U Are Gone ”), que não são reconhecidos por nenhum aminoácido, e um codão de iniciação (AUG, o único codão que codifica a metionina). Com excepção da metionina, o triptofano é o único aminoácido codificado também por um só codão (UGG). De referir que o código genético utilizado pela mitocôndria varia ligeiramente.

Estrutura do tRNA O tRNA tem uma estrutura em forma de trevo, tendo quatro loops, um dos quais contém o anticodão, sequência pela qual o tRNA se liga ao

mRNA.

Na

extremidade

3’

do

tRNA

encontramos a sequência de ligação ao aminoácido. O número de moléculas de tRNA diferentes é igual ao número de codões diferentes existentes. Contudo, os tRNAs com anticodões redundantes não existem na célula na mesma frequência, havendo preferência de codões em todos os organismos.

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Quando temos uma molécula de tRNA ligada a um aminoácido, dizemos que temos um aminoaciltRNA. As aminoacil tRNA sintetases catalisam a formação de aminoacil tRNA. Em primeiro lugar, um aminoácido específico liga-se ao seu respectivo local de ligação, concomitantemente ao ATP, que se liga ao seu local próprio nesta sintetase. O ATP é então desfosforilado, originando AMP, ocorrendo a esterificação dos aminoácidos. Aquando da ligação do tRNA ao seu local específico naquela enzima, o AMP “desliga -se da enzima” e o tRNA pode finalmente

ligar-se ao aminoácido em causa, formando-se assim um aminoacil-tRNA.

Ribossomas O ribossomas são ribozimas, pois o RNA presente (rRNA) tem acção catalítica. Estas estruturas são constituídas por duas subunidades – a subunidade grande apresenta 49 proteínas e um coeficiente de sedimentação de 60 S, enquanto a subunidade pequena apresenta 33 proteínas e um coeficiente de sedimentação de 40 S. Contudo, o coeficiente de sedimentação total do ribossoma é de 80 S e não de 100 S, porque a sedimentação num gradiente de densidade não depende apenas do tamanho da estrutura, mas também da sua forma. De referir que a percentagem de RNA num ribossoma é maior que a de proteínas, estimando-se que seja de 60%. Os rRNAs apresentam estruturas secundárias e terciárias, sendo estas conservadas em todas as espécies. Podemos considerar três locais nos ribossomas – o local A (ou aminoacil) é o local por onde entram os aminoacil-tRNAs. Por outro lado, o local P (ou peptidil) é aquele em que se forma a cadeia peptídica. Por último, o local E é o local exit , por onde sai o tRNA. De referir que o resíduo C-terminal permanece ancorado no local P ao seu tRNA. Nos procariontes, os ribossomas apresentam 70S (a subunidade grande apresenta 50S e a pequena 30S), sendo a percentagem de RNA cerca de 66%.

Tradução A tradução comporta três etapas – a iniciação (fase mais importante, pois é aquela em que se registam o mecanismos de controlo), o alongamento e a finalização. Iniciação Em primeiro lugar, a subunidade pequena do ribossoma, liga-se ao mRNA, no local de iniciação, que se inicia com a sequência AUG. Depois liga-se o tRNA iniciador (com a metionina) a essa região, sendo a metionina depois removida na maior parte das proteínas. A tradução começa sempre no codão de iniciação AUG, sendo a sua identificação essencial para definir que proteína se quer de facto produzir, dado que existem vários quadros de leitura (reading frames ) possíveis no RNA. Este codão é então encontrado pelo seu contexto – nos procariontes existe uma sequência 8 bp upsteram (a montante) ao AUG inicial (a sequência de Shine-Dalgarno), que se vai

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emparelhar com uma sequência complementar, encontrando-se esta na extremidade 3’ de uma unidade de 16S de rRNA. Nos eucariotas, temos em torno do codão AUG uma sequência Kozak muito conservada, que é reconhecida por um scan feito pela subunidade pequena do ribossoma. O tRNA de iniciação que se liga ao codão AUG sofre então fosforilação nos eucariontes e formilação nos procariontes. Este tRNA é o único que se liga ao lugar P do ribossoma e as alterações referidas têm por objectivo, permitir a ligação deste tRNA ao local P. De resto, todos os outros aminoacil tRNAs ligam-se ao local A. Associados ao processo de iniciação, existem factores de iniciação (IFs para os procariontes e eIFs para os eucariontes). Nos procariontes, o IF1 liga-se ao local A para que nele não se ligue outro tRNA, o IF2 liga o aminoacil tRNA de iniciação ao local P e o IF3 impede a ligação das duas subunidades e destabiliza a capacidade de outros tRNA se ligarem ao local P. Forma-se então um complexo de pré-iniciação, em conjunto com a subunidade pequena. O IF2-GTP é posteriormente hidrolizado, o que leva à ligação da subunidade grande e à formação do ribossoma funcional. Já nos eucariontes, o eIF1A e o eIF2 têm função similar aos IF1 e IF2, respectivamente. O eIF4 remove as estruturas secundárias do mRNA e ao ligar-se às extremidades, permite formar um loop entre o cap e a cauda poli-A. Caso o loop não possa ser formado, nomeadamente, devido à ausência de cap, ou a uma pequena extensão da cauda, o mRNA é degradado nos Processing bodies (P-bodies), que existem no citoplasma e são estruturas dinâmicas, aparecendo e desaparecendo. Depois deste controlo de qualidade (etapa limitante da iniciação), o eIF3 e o eIF6 associam-se respectivamente às subunidades pequena e grande, mantendo-as separadas. O aminoacil-tRNA liga-se então à subunidade pequena, ajudado pelo eIF2-GTP, forma-se um complexo nesta subunidade. Após esta fase, os eIF4 ligam-se à subunidade pequena e fazem um scan, de modo a encontrar a sequência de Kozak e o codão de iniciação. Posto isto, dá-se a hidrólise do eIF5 e do eIF2, algo que leva à dissociação dos factores de iniciação e à adição da subunidade grande. Forma-se então um ribossoma funcional de 80S e a tradução prossegue para a fase de alongamento.

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Há, contudo, nos eucariontes quantidades muito pequena de mRNA que podem ser traduzidas de forma similar à dos procariontes, sem existir scanning (sendo a tradução, por isso, independente do cap), referimo-nos aos locais de iniciação internos (IRES), que existem no mRNA, aquando de stress ou infecções virais. Alongamento O processo de alongamento é muito similar nos eucariotas e nos procariotas. Os aminoacil tRNAs vão se ligar ao mRNA, através do local A do ribossoma. Em termos de factores de alongamento, encontramos os nos EFs procariontes e os eEFs nos eucariontes. Em primeiro lugar, o aminoacil tRNA entra para o local A, ligando-se ao mRNA, sendo a cadeia polipeptídica entretanto formada transportada para o aminoacil RNA, algo que ocorre concomitantemente à hidrólise do GTP. O tRNA que ficou livre no local P (uncharged tRNA) é então expulso pelo local E, ficando o lugar que ocupava (lugar P), preenchido pelo polipeptil tRNA, que se encontrava no local A, através de um processo designado por translocação e que ocorre à custa da hidrólise de GTP. Para serem formadas ligações peptídicas entre os diferentes aminoácidos intervém uma enzima – a peptidil transferase, presente na subunidade grande do ribossoma. De referir que a cadeia nascente sai sempre pelos aminoácidos iniciais (a metionina é a primeira estrutura a sair, saindo primeiro o grupo amina). Terminação Os codões stop, não têm tRNA correspondente. Os RFs (Release Factors) são parecidos com o tRNA estrutural, o que permite que estes factores entrem no local A do ribossoma, levando à separação do complexo ribossómico (nos eucariotas temos o eRF1 para três codões STOP, enquanto para os procariotas temos o RF1 para actuar nos codões UAG e UAA e o RF2 para actuar nos codões UGA e UAA). O RF3 (nos eucariotas, eRF3) é uma proteína associada ao GTP, que através da hidrólise deste, promove a quebra do complexo peptidil-tRNA. Por último, voltam-se a ligar, às subunidades ribossomais, o eIF3 e o eIF6, de modo a manter as subunidades separadas.

Folding proteico Associada à tradução, temos sempre chaperones, proteínas que facilitam o folding da proteína em formação, mediando a sua estrutura correcta, algo que ocorre à conta de gastos energéticos. As HSP (heat shock proteins) são proteínas com acção de folding proteico, cujos níveis estão aumentados em situações de choques térmicos, de forma a responder ao aumento da desnaturação das proteínas.

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Optimização do processo de tradução Dado o facto de a tradução ser um processo que envolve gastos energéticos, a verificação prévia do mRNA é muito importante. Por outro lado, os procariontes acoplam a transcrição com a tradução, enquanto nos eucariontes, como a tradução é muito lenta, esta é realizada em polirribossomas (os polirribossomas são também designados por polissomas e são uma série de ribossomas que traduz uma mesma cadeia de mRNA), ou associada ao retículo endoplasmático rugoso. A tradução por polissomas permite aumentar a velocidade e taxa de síntese proteica. Esta é também aumentada pela reciclagem das subunidades ribossomais.

Inibidores da síntese proteica Existem vários inibidores da síntese proteica. A puromicina provoca a conclusão prematura da cadeia pela entrada no local A e transferência para a cadeia peptidil. Existem ainda inibidores dos ribossomas nos procariotas, nomeadamente o cloranfenicol, que liga a subunidade grande e inibe a actividade da peptidil transferase e a estreptomicina, a gentamicina e Kanamicina , que inibem a síntese proteica através da ligação ao rRNA da subunidade pequena provocando erros de tradução na leitura dos codões por causa de alterações conformacionais no ribossoma. Em termos de inibidores da síntese proteica nos eucariotas, encontramos a toxina diftérica, uma enzima produzida pela bactéria C. Diphteriae que utiliza cataliticamente o NAD para inactivar o eEF2 e a cicloheximida, que inibe o elongamento da cadeia (competidor inibitório da peptidil transferase).

Degradação proteica Cerca de 30 % das proteínas recém sintetizadas são rapidamente degradadas devido a erros. Contudo, todas as proteínas têm o seu turnover . A degradação proteica é feita nos ou, mais lisossomas, frequentemente, é mediada pelo sistema ubiquitina-proteassoma, degradando este sistema, as proteínas que se encontram no citoplasma. A ubiquitina é constituída por 76 aminoácidos, que é por vezes denominada “kiss of death”, pois as

proteínas poli-ubiquitinadas degradadas no proteossoma.

são

Os proteassomas funcionam como “trituradoras de papel” - as proteínas

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entram por um complexo de 19S, saindo por outro, os aminoácidos livres. Como a acumulação de proteínas é prejudicial para o organismo, pois leva a doenças neurodegenerativas, o proteossoma desempenha um papel fulcral na célula. O proteossoma desempenha ainda funções importantes numa variedade de processos celulares fundamentais tais como a regulação do ciclo, divisão, desenvolvimento e diferenciação celular; apoptose; tráfego celular e modulação das respostas imunes e inflamatórias. Existem patologias, em que devido a mutações, as proteínas não conseguem sair da membrana biológica, acumulando-se no retículo endoplasmático rugoso, onde são degradas pelo proteossoma. Dado serem proteínas necessárias para desempenhar funções biológicas vitais, torna-se aí importante, atenuar a acção do proteossoma.

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Controlo da expressão génica e especialização celular Todas as células de um dado organismo têm o mesmo DNA, que está contido no seu genoma, apesar de células distintas produzirem diferentes proteínas e terem diferentes regiões do seu genoma activas. Desse modo, compreende-se a importância do controlo da expressão génica, algo também constatado através das nefastas consequências registadas aquando de alterações nessa regulação (que passam pelo aparecimento de tumores, ou de patologias que surgem durante o desenvolvimento). A importância do controlo da expressão genética é ainda mais importante ao nível dos procariotas, visto que estes dependem deste processo para ir buscar ao meio aquilo que necessitam e, desse modo, sobreviver. Existem cinco níveis de controlo da expressão génica – ao nível da trasncrição, do processamento de mRNA, do transporte de RNA,

da

tradução

e

do

controlo

da

actividade proteica. Contudo, o nível de

controlo mais importante é o primeiro, pois permite poupar recursos energéticos e tempo (a célula evita, desde logo, a produção de compostos desnecessários). Para a célula determinar quais os genes que deve transcrever, existe um promotor, activadores, sequências reguladoras e binding-proteins. Os repressores são moléculas que se ligam a determinadas zonas do DNA e reprimem a transcrição genética. Já os activadores ligam-se a zonas do DNA, permitindo a activação da transcrição.

Regulação génica nos procariotas Nos procariotas a regulação da expressão génica é feita ao nível da transcrição. A transcrição é mediada pelas interacções registadas entre o DNA e as proteínas e pela RNA polimerase, funcionando, por isso, os mecanismos de regulação de expressão genético como “interruptores genéticos”. A título de

exemplo, podemos citar o operão da lactose, na E. coli . Operão lac Os genes incluídos no operão lac permitem a síntese de enzimas que degradam a lactose, sendo uma forma de as bactérias obterem glicose, aquando da sua falta. O operão apresenta um promotor, um operador, genes lac e um sítio para a CAP. Ao promotor liga-se a RNA polimerase, ao operador, o repressor e à zona para a CAP, a CAP (catabolite activator protein), uma proteína activadora dependente de cAMP e que vai favorecer a transcrição. Aquando de elevadas concentrações de glicose e baixas de lactose, a bactéria não necessita de gastar energia a produzir enzimas e a degradar a lactose. Dessa forma, um repressor liga-se à zona do operador, impedindo a RNA polimerase, juntamente com o factor σ70 de iniciar a transcrição dos genes lac. O CAP também não se liga ao seu sítio respectivo nesta situação.

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Quando existem concentrações elevadas de glicose e de lactose, a bactéria realiza transcrição dos genes lac em baixa quantidade. A transcrição é realizada porque a lactose liga-se ao repressor, impedindo-o de se ligar ao operador (o que leva a que a RNA polimerase se ligue ao promotor e inicie a transcrição). Contudo, a transcrição é feita em níveis reduzidos, porque o CAP não se liga à sua região, pois este não é activado, devido às baixas concentrações de cAMP. Contudo, quando a concentração de glicose é baixa e a concentração de lactose é elevada, ocorre a activação do CAP, pelo cAMP e a transcrição é feita a níveis elevados (o que é compreensível dada a situação do meio). Regulação à distância A regulação génica nos procariotas também pode ocorrer à distância. A regulação da ligação σ54-RNA polimerase é levada a cabo pela NtrC (nitrogen regulatory protein C ), que se liga a um enhancer . Os dímeros fosforilados da NtrC encontram-se muito longe da região do promotor, mas através da 54 formação de uma “dobra” conseguem contactar com a σ -RNA polimerase.

Regulação génica nos eucariotas Nos eucariotas o processo é mais complexo, devido à estrutura da cromatina (nomeadamente, a heterocromatina) e as sequências activadoras têm um papel muito mais fulcral que as repressoras. Existe também um número muito maior de sequências reguladoras. Nos eucariotas, por fim, os elementos regulatórios tanto se podem encontrar muito próximos, como muito longe dos locais de iniciação de transcrição. Dentro do grupo de sequências activadoras, destacam-se os enhancers, regiões de DNA, às quais se ligam proteínas, o que leva a uma aumento exponencial da taxa de transcrição (não sendo, apesar disso, promotores). Os factores de transcrição são activadores transcripcionais que se ligam ao DNA, nomeadamente aos promotores e aos enhancers e que apresentam geralmente um domínio de ligação ao DNA (raramente apresentam mais que um) e um ou vários domínios de activação. Estes factores interagem com a RNA polimerase II. A Gal4 é um exemplo de um factor de transcrição na levedura. Os repressores transcripcionais, por seu turno, apresentam uma estrutura similar aos activadores e a ausência da actividade repressora pode ter consequências nefastas, por exemplo, a ausência de repressão do gene EGR-1 no rim em desenvolvimento, leva ao desenvolvimento do tumor de Wilms. As proteínas activadoras e repressoras interagem com co-activadores (que aumentam a expressão de um gene e co-repressores (que diminuem a expressão de um gene). O complexo mediador , formado por uma cauda, uma cabeça, uma região média e um módulo CDK, permite a interacção entre os activadores e a RNA-polimerase, funcionando como um co-activador. A combinação de várias proteínas activadoras e repressoras (ou seja, de várias proteínas reguladoras) aumenta a variedade de controlo genético, nomeadamente através da formação de complexos. Dessa forma, a célula não necessita de ter um número infindável de proteínas reguladoras. Nestes complexos, podemos ter proteínas activadoras a participar em complexos de repressão, contudo, elas continuam a ser activadoras, não passam a ser proteínas repressoras! O mesmo se passa com as proteínas repressoras, que integram complexos de activação, continuam a ser proteínas repressoras. Os

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monómeros desses complexos são heterodímeros, num processo que se designa por combinação heterodimérica dos factores de transcrição . A cromatina também é modulada aquando da transcrição de genes, pois a sua condensação implica a ausência de transcrição, enquanto a sua descondensação está associada a transcrição activa. Dessa forma, os repressores promovem a deacetilação das histonas e metilação de algumas classes e a sua, contribuindo assim para a formação de heterocromatina. Por outro lado, os promotores promovem a acetilação das histonas, bem como a metilação de algumas. A metilação é uma forma de silenciamento de certos genes, nos vertebrados. Quando esse padrão de metilação é estabelecido, cada local metilado é passado para as células descendentes. Porém, na verdade, para o gene estar completamente silenciado, seguese a ligação de proteínas até à região metilada e a ocorrência de deacetilações. O processo de imprinting ocorre com silenciamento de um alelo proveniente de um progenitor, através de metilações e outras modificações histónicas. Nos indivíduos do sexo feminino ocorre igualmente inactivação aleatória de um cromossoma X , por condensação da sua cromatina.

Mecanismos alternativos de controlo da expressão génica Mecanismos pré-transcripcionais e transcripcionais Um processo de controlo de expressão génica, ainda antes de ocorrer a transcrição, prende-se com a inserção de genes móveis ( transposões) no meio de um gene que codifica uma proteína, o que leva a que se produza depois um mRNA ou uma proteína não funcional. As proteínas truncadas , por exemplo, são proteínas incapazes de desempenhar determinadas funções, porque lhes faltam resíduos de aminoácidos Hormonas esteróides também podem assumir também uma função vital enquanto reguladores da

expressão génica, pois ligam-se a proteínas receptoras que formam um complexo, que por sua vez se liga ao DNA, permitindo a sua transcrição. A ausência destas hormonas impede a ocorrência de transcrição. Mecanismos pós-transcripcionais Após a transcrição, inúmeros processos podem ocorrer no sentido de controlar a expressão genética. Contudo, estes processos são secundários, quando comparados com os de controlo ao nível da transcrição. Em primeiro lugar, a longevidade e estabilidade do mRNA pode ser alterada, havendo ligações para impedir a sua degradação. Por exemplo, aquando da amamentação, a prolactina liga-se ao mRNA da caseína, impedindo a sua digestão pela ribonuclease e permitindo a sua tradução em caseína, proteína do leite. Isto não acontece, aquando da glândula mamária não-lactante. O RNA editing consiste em alterações da sequência nucleotídica de mRNA, sendo estas feitas por substituição (por exemplo, o gene APOB é transcrito e traduzido no fígado sem sofrer editing, contudo,

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no intestino, o seu mRNA o codão CAA sofre editing e origina UAA, um codão stop, de modo a evitar a sua tradução) ou por inserção/delecção (como acontece com o gene de uma subunidade da oxidase do citocromo c no Trypanosoma brucei ). O uso de RNA de interferência (RNAi, ou RNA interference) é um processo com bastantes aplicações na investigação científica e no qual um pequeno fragmento de RNA se vai hibridizar com o mRNA, formando uma cadeia dupla de RNA. Esta é reconhecida como anómalo pela célula e, por isso, vai ser de imediato degradada, impedindo que o mRNA seja traduzido. Também ao nível do processamento pode ocorrer controlo da expressão génica. O splicing é uma etapa do processamento, na qual são removidos intrões e unem-se os exões. Através do processo de splicing alternativo, podemos combinar várias sequências de exões e um fragmento genético pode originar várias proteínas diferentes, permitindo que com se origine um número de proteínas superior ao número de genes existentes. O splicing alternativo permite então que um mesmo pré-mRNA origine, quer um activador, se for integrado um exão que codifica uma região de activação, ou um repressor, se essa região não for integrada. Existem ainda mecanismos de repressão da tradução do mRNA, em que as proteínas não são traduzidas, ou não sofrem alterações pós-traduções, que lhes seriam vitais para assumirem as suas funções.

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Membranas biológicas As membranas biológicas são estruturas com uma espessura que varia entre 5 e 9 nanómetros e que separam o conteúdo de organelos, ou da própria célula, do meio exterior, permitindo delimitar essas estruturas. O núcleo e as mitocôndrias têm uma dupla membrana e o lúmen do retículo endoplasmático rugoso é separado do citosol também por uma membrana biológica. As membranas biológicas, cuja principal função é a de isolamento, são formadas por uma dupla camada fosfolipídica e por proteínas que se podem ancorar à membrana ou atravessá-la.

Dupla camada fosfolipídica Os fosfolípidos são constituídos por cabeças polares e hidrofílicas, constituídas por colina, serina ou etanolamina, fosfato e glicerol e por caudas hidrofóbicas, constituídas por ácidos gordos, sendo por isso designadas por moléculas anfipáticas. As moléculas polares são hidrofílicas, visto que nelas ocorre distribuição de cargas e, por isso, quando entram em contacto com a água, as cargas positivas interagem com o oxigénio e as cargas negativas com o hidrogénio (a água é, ela própria, uma molécula polar). Já nas moléculas apolares, como não ocorre distribuição das cargas eléctricas, não existe um dipólo. Dessa forma, essas moléculas não interagem com as moléculas de água, que preferem interagir umas com as outras. Diz-se que são moléculas hidrofóbicas. Dessa forma, os lípidos, quando colocados em água podem-se arranjar formando micelas, no caso de terem uma estrutura “em cunha”, sendo que as partes hidrofílicas ficam em contacto com a água, ou bicamadas, como no caso dos fosfolípidos. Contudo, a bicamada fosfolipídica é obrigada a fechar, por acção de forças hidrofóbicas, formando uma estrutura esférica.

Fosfolípidos das membranas Existem quatro fosfolípidos integrantes das membranas biológicas. São eles a fosfatidiletanolamina, a fosfatidilserina, a fosfatidilcolina e a esfingomielina. A fosfatidiletanolamina é um fosfolípido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por etanolamina, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A etanolamina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidiletanolamina seja nula. A fosfatidilserina é um fosfolípido existente no folheto interno da bicamada, sendo formada por serina, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A serina tem uma carga positiva e uma negativa e o fosfato tem uma carga negativa, o que leva a que a fosfatidilserina tenha carga negativa. Isto revela-se uma característica essencial em termos de sinalização.

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A fosfatidilcolina é um fosfolípido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga negativa, o que leva a que a carga geral da fosfatidilcolina seja nula. A esfingomielina é um fosfolípido existente no folheto externo da bicamada, sendo formada por colina, fosfato, esfingosina e dois ácidos gordos. A colina tem uma carga positiva e o fosfato tem uma carga negativa, o que leva a que a carga geral da esfingomielina seja nula. A esfingomielina é o único esfingolípido constituinte das membranas biológicas. Todos os restantes são fosfoglicerídeos. Existe ainda um quinto fosfolípido constituinte da membrana, embora presente em baixas concentrações – o fosfatidilnositol. Este encontra-se no folheto interno da bicamada, sendo formado por inositol, fosfato, glicerol e dois ácidos gordos. É uma molécula com uma carga negativa, o que lhe confere propriedades de sinalização. Formação de membranas biológicas Os fosfolípidos constituintes das membranas biológicas são formados no folheto interno do retículo endoplasmático rugoso, ocorrendo a adição de fosfolípidos com o contributo da enzima scramblase, uma enzima não específica, que permite que o número de fosfolípidos fique igual em ambos os folhetos. A “membrana” produzida no

retículo é então exportada por exocitose. Contudo, esta ainda não é assimétrica, ou seja ainda não há uma distribuição dos diferentes tipos de fosfolípidos pelos respectivos folhetos. Essa distribuição é levada a cabo pela enzima flippase, uma enzima específica que permite também os movimentos de flip-flop nas membranas. Movimentos ocorridos ao nível das membranas biológicas A membrana biológica é uma estrutura fluida – os fosfolípidos realizam fácil e espontaneamente movimentos laterais e de rotação. Contudo, a mudança de camada pelos fosfolípidos ( movimentos de flip-flop) não se realiza dessa maneira fácil e espontânea, mas sim à conta da flippase e da scramblase. Isto leva a que esses movimentos ocorram muito menos frequentemente que os restantes. Existem factores, contudo, que contribuem para variações na fluidez da membrana. Um deles prende-se com a saturação das cadeias fosfolipídicas – cadeias insaturadas levam à formação de membranas mais fluidas, enquanto cadeias saturadas levam à formação de membranas mais rígidas. Isto acontece, porque quando as cadeias de fosfolípidos estão insaturadas, formam uma “dobra”, à qual se dá o nome de kink . Isto faz com que quando temos várias cadeias insaturadas, haja um maior espaço entre os fosfolípidos e a espessura da membrana seja menor. Este mecanismo descrito é utilizado por bactérias para efeitos de termorregulação.

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Também a presença de colesterol influencia a fluidez das membranas. O colesterol é um esteróide que preenche os espaços entre os fosfolípidos. O seu anel esteróide torna o rígido, levando a que a mobilidade dos fosfolípidos fique reduzida, bem como a permeabilidade da membrana. Contudo, o colesterol pode actuar também no sentido de prevenir a cristalização da membrana. Por fim, o tamanho das cadeias de ácidos gordos tem forte influência na fluidez das membranas – cadeias maiores resultam em menor fluidez e cadeias menores resultam em maior fluidez. Sinalização celular por acção dos fosfolípidos Os fosfolípidos com carga negativa têm um importante papel em termos de sinalização celular. Por exemplo, quando a célula vai entrar em apoptose, a acção da flippase diminui e a da scramblase aumenta. Isto leva a que a fosfatidilserina migre para o folheto externo da membrana celular, onde é reconhecida por macrófagos, levando à apoptose da célula. O fosfatidilinositol, por seu turno, é importante para a activação da cínase do fosfatidilinositol (PI 3 kinase) ou fosfolipase C, sendo um mensageiro intracelular de importância considerável.

Glicolípidos Os glicolípidos estão presentes no folheto externo das membranas biológicas. Têm associados oligossacarídeos a lípidos e como funções a protecção celular e intervir na interacção inter-celular.

Proteínas membranares As membranas biológicas têm-lhes associadas diversas proteínas membranares. Estas podem ser integrais, caso atravessem a membrana ou lhe estejam ancoradas, por uma ligação muito forte (por exemplo, covalente), ou periféricas, caso a ligação que tenham à membrana não seja muito forte. As proteínas membranares são muitas vezes receptores, transportadores ou canais iónicos, embora também possam desempenhar função enzimática, ou de tradução de sinais. As proteínas transmembranares são moléculas anfipáticas, contactando as regiões hidrofílicas (que são constituídas por aminoácidos hidorfílicos) com o meio aquoso e as regiões hidrofóbicas (que são constituídas por aminoácidos hidrofóbicos) com as regiões hidrofóbicas das membranas. Essas proteínas podem atravessar uma vez a membrana sob a forma de uma hélice α, que tem entre 20 a 30 aminoácidos hidrofóbicos (a glicoforina A é uma proteína dos eritrócitos que só atravessa a membrana uma vez e tem estrutura em hélice α) , ou várias vezes, sob a forma de sucessivas hélices α

(a título de exemplo, é possível citar a bacteriorodopsina, que atravessa a membrana sete vezes, sendo uma “bomba” transportadora de protões). As folhas β também podem atravessar a membrana biológica, formando

estruturas tipo canal (como exemplo, temos as porinas, proteínas com várias passagens transmembranares, que são canais presentes na membrana plasmática externa da E.coli). Já as proteínas ancoradas podem se ligar à membrana por “pontes” de oligossacarídeos.

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Transporte transmembranar As membranas biológicas podem ser atravessadas por moléculas por difusão simples ou por processos, nos quais intervêm proteínas mediadoras, nomeadamente a difusão facilitada e o transporte activo. Tipo de transporte

Moléculas transportadas

Via de transmissão

A favor do gradiente

Selectivo

Difusão simples

Gases, moléculas hidrofóbicas e pequenas moléculas polares Grandes moléculas polares e moléculas com carga Solutos contra o gradiente de concentração

Dissolução na membrana transportadora Canais iónicos e transportadores passivos













Difusão facilitada Transporte activo

Transportadores activos (bombas)

Difusão simples O processo de difusão simples não requer a presença de qualquer proteína. É, portanto, um processo não-mediado em que gases, moléculas apolares e pequenas moléculas polares (tais como água e etanol, embora a probabilidade de estas moléculas atravessarem a membrana biológica seja menor) atravessam a membrana por dissolução na bicamada fosfolipídica, algo que ocorre sem dispêndio energético, visto que este processo ocorre a favor do gradiente de concentração. De referir que, dadas as características deste processo, este é considerado não selectivo.

Transportadores e canais iónicos Os canais iónicos são proteínas incorporadas na membrana, que abrem um caminho aquoso nesta. O contacto com a bicamada fosfolipídica é feito através de aminoácidos hidrofóbicos, enquanto, a zona de abertura está revestida por aminoácidos hidrofílicos. Estes canais nem sempre estão abertos e participam em processos de difusão facilitada . Os transportadores proteicos, por seu turno, nunca abrem por completo – Abrem-se de um lado, permitindo a ligação do soluto e, fechando-se nesse lado, abrem-se no outro, permitindo a saída de soluto. A sua presença nas membranas biológicas também obriga a que apresentem aminoácidos hidrofóbicos, para contactar com a bicamada fosfolipídica, e hidrofílicos, para contactar com a região aquosa. Os transportadores proteicos podem participar no processo de difusão facilitada, sendo aí denominados por transportadores passivos, e no processo de transporte activo, sendo aí denominados por bombas. Ambos os tipos de transportadores estão sujeitos a alterações conformacionais. Em termos de rapidez, podemos afirmar que os canais iónicos são 100 000 vezes mais rápidos que os transportadores.

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Difusão facilitada O processo de difusão facilitada permite a passagem de moléculas polares a favor do gradiente electroquímico (o processo de difusão simples ocorre unicamente a favor do gradiente químico, uma vez que as moléculas que atravessam esta membrana por este processo são apolares) e, como tal, sem dispêndio energético. Este é um processo selectivo, que é mediado por proteínas (transportadores e canais iónicos).

Transporte activo O processo de transporte activo permite a passagem de solutos contra o gradiente de concentração, algo que ocorre à conta do consumo de energia, sendo um processo selectivo. Esta energia pode partir da hidrólise do ATP, bem como da acoplação de um processo de transporte a favor do gradiente electroquímico ao processo de transporte contra o gradiente. Algumas bactérias utilizam também a luz para permitir a passagem de solutos contra o gradiente de concentração. Relativamente aos tipos de transportadores, temos uniportes, se apenas transportarem um soluto numa única direcção; se simportes, transportarem dois solutos numa mesma direcção e antiportes se transportarem quase simultaneamente dois solutos em direcções diferentes. Aquando da entrada de glicose nos enterócitos, verificamos que estão envolvidos os três tipos de transportadores – como a glicose existe em maior concentração no interior do enterócito, que no lúmen intestinal, esta entra para o enterócito por via de um simporte, visto que o processo de entrada desta ose está acoplada à entrada de Na +. A saída da glicose do enterócito é feita por difusão facilitada, através de um uniporte, pois a concentração de glicose é maior dentro do enterócito que no fluido extracelular. Finalmente, é possível manter o gradiente de sódio, através da bomba de sódio e potássio, que é um antiporte. O funcionamento do simporte da glicose explica-se pelo princípio da cooperatividade (que ocorre quando uma molécula facilita a passagem de outra) – 2 Na+ ligam-se em primeiro lugar ao transportador, o que aumenta a afinidade deste para a glicose, permitindo a sua entrada e ligação + ao receptor. Depois, os 2 Na saem do transportador, o que diminui a afinidade do transportador à glicose e permite a sua saída. Relativamente à bomba de sódio e potássio, esta tem uma grande + afinidade para o Na , de tal modo a que este se liga a este transportador. A bomba é então fosforilada, por via da hidrólise do ATP, o que altera a conformidade do transportador, diminuindo a sua afinidade para o Na +, que se

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desliga deste. Por consequência, a afinidade ao K + aumenta, permitindo o seu transporte por processos similares. De referir que este transportador bombeia para fora da célula 3 Na +, entrando 2 K+. Também o transporte de Ca2+ (que tem de ser mantido a concentrações baixíssimas) e H + é feito à conta do gradiente de Na +.

Tipos de canais iónicos Comum a todos os canais iónicos é a presença de filtros selectivos para iões, nomeadamente o Na +, o K+, o Ca2+ e o Cl-, sendo que alguns são activados por um estímulo específico e outros se encontram permanentemente num estado “intermitente” (alternando entre aberto e f echado).

Canal

Canal iónico de fuga Canal iónico activado por voltagem Canal iónico activado por transmissor Canal iónico activado por estímulo mecânico Junções de hiato

Estímulo

Tipo de canal +

Função

Não apresenta Despolarização (-50 mV) Despolarização (-20 mV)

Canal de K + Canal de Na + Canal de K

Génese do potencial de repouso Despolarização no potencial de acção Repolarização no potencial de acção

Transmissor extracelular

Canais de iões vários

Funções ao nível da transmissão do impulso nervoso

Canal de catiões Canal de iões pequenos

Transformação do estímulo mecânico em resposta eléctrica Ligação intercelular e sincronziação da actividade celular

Ligando intracelular Mecânico/ pressão Não apresenta (só modulação)

Os canais iónicos de fuga são canais de K+, que não são activados por nenhum estímulo específico, estando a sua função relacionada com a génese do potencial de repouso (-70 mV) na membrana, através da saída dos iões K+ do meio intracelular. Existem ainda canais iónicos activados por voltagem , cujo funcionamento se baseia em alterações da polarização da membrana. Os canais de Na+ são essenciais para gerar o potencial de acção e são activados por despolarização da membrana, mais propriamente por um potencial de -50 mV. Já os + canais de K delayed-rectifier são activados novamente por despolarização da membrana, mas desta vez, por um potencial de -20 mV, permitindo a saída do K + das células e a repolarização (regresso ao potencial de repouso). Os canais iónicos activados por transmissor podem ser de dois tipos – canais iónicos activados por transmissor (extracelulares), ou canais iónicos activados por ligandos intracelulares . Os primeiros envolvem a ligação de moléculas extracelulares ao transportador, permitindo a sua abertura. A título de exemplo, podemos citar o estímulo feito pelo glutamato aos canais de Na+ e K+ e que será essencial para se realizar a sinapse, pois permite alterar o potencial de repouso do neurónio pós-sináptico. Também o GABA (ácido γ-aminobutírico) pode se ligar a canais de Cl , funcionando como um potencial inibitório pós-sináptico. Relativamente aos canais iónicos activados por ligandos intracelulares, o mecanismo é idêntico. A ligação de moléculas ou iões intracelulares ao receptor permite a sua activação. O Ca 2+ intra-celular, por + exemplo, pode-se ligar a canais de K Ca, permitindo a regulação do disparo neuronal. Os canais iónicos activados por estímulo mecânico são canais de catiões, cuja função é a transformação do estímulo mecânico em resposta eléctrica. As junções de hiato, também designadas por canais gap-junction, são canais de pequenos iões que existem no epitélio, no endotélio e em células cardíacas. Estas permitem fazer junções entre membranas, permitindo a comunicação e sincronização celular. Não são estimuladas, mas podem ser

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moduladas, isto é, quando a célula entra num estado indesejado (por exemplo, a sua concentração de Ca2+ aumenta muito), o transportador “fecha”. +

Canal de Na dependente de voltagem Este canal é importante na génese de um potencial de acção, sendo que o potencial de -50 mV contribui para a sua activação. O seu estado activado é estado aberto, permitindo a + entrada de Na na célula. Contudo, 1ms depois, este transportador fecha, pois na região voltada para o citosol, liga-se uma bola de inactivação , que forma à espécie de um “tampão”. Quando ocorre repolarização da membrana, o canal volta à sua

conformação inicial. O canal de Na+ é constituído por quatro subunidades que se repetem, sendo que cada repetição é constituída por seis segmentos transmembranares, sendo que a sensibilidade a alterações de polaridade da membrana é feita por um sensor de voltagem presente no segmento 4. Entre o quinto e o sexto segmento existe um fortíssimo loop, correspondente ao poro do canal, sendo por isso formado por aminoácidos hidrofílicos.

Funcionamento dos canais de Na+ e K+ O Na + apenas atravessa o canal de Na +, se estiver ligado a uma molécula de água. Caso contrário, o K +, como tinha carga igual ao Na+ também poderia atravessar esse canal. A entrada de K+ associado a uma molécula de água é impossível, porque as dimensões da abertura do canal são menores que as da H2O + K+. O K + também não atravessa sozinho o canal iónico, porque a energia necessária para o K+ se dissociar da molécula de água não compensa a energia ganha associada à passagem do transportador.

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Por outro lado, o K + para atravessar o seu canal iónico, realiza sozinho essa passagem, dissociado da molécula de H2O. De seguida, o K + liga-se a oxigénios de grupos carbonilo existentes no canal, atravessando-o. Já o Na + não consegue atravessar o canal, visto que, dissociado da molécula de água é demasiado pequeno e não se consegue ligar aos oxigénios dos grupos carbonilo (e dessa forma a energia necessária para dissociar o Na + à molécula de água não compensa a energia associada à passagem do canal). O Na + também não consegue atravessar o canal iónico associado a uma molécula de água dado as dimensões serem superiores às da abertura do canal.

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Tradução eléctrica de estímulos: Membrana Neuronal O elemento básico do sistema nervoso central é o neurónio, uma célula especializada na recepção, condução e transmissão de sinais. Os neurónios podem ser de vários tipos – motoneurónios (neurónios longos com um axónio mielínico e muitas dendrites), interneurónios (neurónios de menor comprimento e sem o axónio mielínico) e neurónios sensoriais. Comum a todos os tipos de neurónios supracitados é a presença de um axónio, de um corpo, de dendrites e de botões sinápticos, permitindo estas duas últimas componentes, a transmissão de um estímulo nervoso para outro neurónio, através de uma sinapse.

A membrana neuronal, para além da bicamada lipídica, apresenta vários tipos de canais iónicos, nomeadamente bombas de sódio e potássio, canais de fuga de K +, canais activados por glutamato (transmissor excitatório), canais de Na + dependentes de voltagem e canais de K + delayed-rectifier.

Potencial de repouso – caracterização e génese Os valores de potencial de acção e potencial de repouso (-70 mV) não são atribuídos arbitrariamente, mas calculados através da equação de Nernst, que é dada pela fórmula

 



  

, sendo F a constante

de Faraday, T , a temperatura, [X]E, a concentração extracelular de um dado ião e [X] I, a concentração intracelular de um dado ião. Considerando que T = 36ºC, temos que

 

 . Dessa forma, podemos

calcular o potencial de potássio (VK), que nos pode dar uma aproximação ao valor de potencial de repouso:  

 



    

   

 

    

Ora, sabemos que V R (valor de repouso) não é igual a VK, como seria de esperar, mas assume o valor de + + -70 mV. Isto porque a membrana é também permeável a outras cargas. Como [Na ]E + [K ]E = 150 mM e [Na+]I + [K+]I = 150 mM, fazendo as contas temos que o valor de equilíbrio para o total das cargas de sódio e potássio é de 0 mV. A partir do valor de -70 mV, dizemos que ocorre despolarização, se o valor de VR se torna cada vez menos negativo ou mais positivo (e portanto diminui a polarização da membrana), ou hiperpolarização, quando o seu valor se torna cada vez mais negativo, (ou seja, aumenta a polarização da membrana). De referir que o potencial da membrana nunca chega a ser zero, porque o número de iões envolvidos, aquando de um estímulo, nunca é suficiente para tal. No fluido extracelular, a concentração de Na+ é de 145 mM fora da célula e a de K + é de 5 mM. Ora, se não existisse a bomba de sódio e potássio , a concentração destes iões seria igual quer no exterior, quer no interior nas células. Dessa forma, o sódio é expulso da célula e o potássio entra para esta, pela bomba de sódio e potássio.

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Contudo, a bomba de sódio e potássio não é suficiente para gerar um potencial de membrana. O potencial de repouso (polarização da membrana) é gerado ainda pelos canais de fuga, através dos quais o K+ sai a favor do gradiente de concentração (arrastando consigo uma carga positiva para fora da célula), atingindo-se o equilíbrio quando o gradiente electroquímico é zero (ou seja, quando o gradiente químico é igual ao gradiente eléctrico, isto é, o número de iões que sai a favor do gradiente químico é igual ao número de cargas que entra por potencial eléctrico).

Potencial de acção A presença de canais de Na + e K+ activados por glutamato são essenciais para se dar a estimulação sináptica, ou seja, para a génese de um potencial pós-sináptico excitatório (EPSP), que vai despoletar a despolarização da membrana. Quando se atinge -50 mV, ou seja, quando a entrada de Na + para a célula excede a saída de K +, diz-se que é atingido o limiar do potencial de acção . Quando se atinge o limiar do potencial da acção, são activados os canais de Na+ dependentes de voltagem. Estes canais existem quase em exclusivo no axónio, pois nos restantes locais do neurónio, a densidade deste tipo de canais é muito baixa. A activação dos canais de Na + dependentes de voltagem, leva a que os iões de Na + entrem no meio intracelular, permitindo à membrana atingir o potencial de equilíbrio para o Na+ (o que significa que a quantidade destes canais no axónio é muito grande). Ao fim de 1 ms, os canais de Na+ são inactivados pelas bolas de inactivação, impedindo a passagem de mais iões Na+. Segue-se o processo de repolarização. Se apenas tivéssemos canais de fuga de K +, a repolarização demoraria centenas de milissegundos, daí a existência de canais de K+ dependentes de voltagem. Estes canais demoram 1 ms a abrir (e daí também serem chamados de “ delayed-rectifier”), por isso a sua

activação ocorre, quando a polarização da membrana atinge os -20 mV. Dessa forma, os canais K+ + + dependentes de voltagem apenas abrem, quando os de Na fecham. A densidade dos canais de K dependentes de voltagem é muito elevada e permitem, juntamente com os canais de fuga, que a polarização da membrana chegue ao valor de equilíbrio para o potássio. Contudo, no final, vão ser esses mesmos canais de fuga, que vão levar ao regresso da membrana ao valor do potencial do repouso (-70 mV). É importante mencionar que a quantidade de iões que atravessa os canais é reduzida e que, portanto, as concentrações de sódio e potássio, quer no interior da célula, quer no meio extracelular, praticamente não sofrem alterações. Isto constitui uma vantagem, na medida em que os gastos de energia sob a forma de ATP necessários para a bomba

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de sódio e potássio restabelecer as concentrações “normais” de sódio e potássio são, de ste modo,

muito reduzidos. De referir que o potencial de acção inicia-se no cone axonal (zona mais proximal do axónio, em que este contacta com o corpo do neurónio), visto que é lá que a densidade dos canais de Na + activados por voltagem é maior. Depois, a propagação do potencial de acção é feita num sentido unidireccional, pois concomitantemente aos circuitos eléctricos associados à transmissão do potencial de acção, ocorrem + pequenas despolarizações da membrana nos canais adjacentes ao canal de Na em que está a haver passagem de iões (ou seja, que está aberto e activado). O canal que está imediatamente depois é então activado e o que está imediatamente antes não é afectado, porque já está inactivado (daí a importância dos canais de Na + activados por voltagem ficarem inactivos após 1 ms). A bainha de mielina funciona como um isolante e baixa a capacidade da membrana do axónio, porque a torna mais espessa. Os nódulos (ou nós) de Ranvier interrompem a bainha de Mielina e permitem uma + propagação saltatória do potencial de acção , pois neles estão presentes canais de Na activados por voltagem em elevadas concentrações.

Sinapse química O processo de sinapse química permite que o estímulo propagado num neurónio, designado por pré -sináptico, continue a ser propagado num outro neurónio, designado por pós sináptico. Durante a sinapse ocorre a libertação de neurotransmissores na fenda sináptica, estando estes transmissores inicialmente envoltos por vesículas sinápticas, que depois se fundem com a membrana do neurónio pré2+ sináptico. Este processo ocorre devido à entrada de Ca na membrana pré-sináptica, através de canais de Ca2+ 2+ dependentes de voltagem, pois o Ca permite a fusão das vesículas sinápticas com a membrana pré-sináptica. O transmissor libertado vai então activar o transmissor dos canais iónicos na membrana pós sináptica, sendo depois removido da fenda sináptica pelos processos de reuptake (reentrada do neurotransmissor para o neurónio présináptico, algo que permite a “r eciclagem” dos neurotransmissores ) e de difusão para o meio.

Potencial pós-sináptico inibitório O potencial pós-sináptico não é sempre excitatório (EPSP), este também pode ser inibitório (IPSP) e, nesse caso, o potencial é activado por GABA (ácido aminobútrico gama ) ou por glicina, sendo abertos os canais destas substâncias, que são canais de cloro. Isto leva à entrada de cloro na célula, que, dado ser um anião, vai levar a que ocorra uma hiperpolarização da membrana. Podem ser transmitidos simultaneamente, um potencial inibitório e um excitatório, levando à anulação dos efeitos.

Somatório dos potenciais pós-sinápticos Dizemos que temos sinapses iguais, quando no local em que se gera EPSP, o potencial pós-sináptico é igual. Contudo, isto não significa que num mesmo local essas duas sinapses não tenham potenciais póssinápticos diferentes. Considerando que ocorreram sinapses iguais, mas que uma ocorreu mais proximal

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(ou seja, que ocorreu mais próxima do corpo do neurónio), relativamente a outra, temos que, no local do cone axonal (ou noutro qualquer ponto do axónio) a sinapse distal vai chegar com um potencial pós-sináptico menor que a proximal. Daí ser feito os somatórios espacial e temporal dos potenciais pós sinápticos, para um determinado local, sendo que o somatório temporal tem em conta o tempo de atraso da sinapse distal. A intensidade de um potencial póssináptico pode ser traduzida em frequência, dessa forma, quanto mais intenso este for, maior a frequência associada a este potencial. Esta relação e entendida como o output do neurónio. O patch clamp é uma técnica que permite estudar estímulos nervosos, nomeadamente o que se passa ao nível dos canais iónicos, registando-os sob a forma de gráfico e permitindo analisar as diferenças entre os valores teóricos calculados e os valores que ocorrem de facto.

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Modelos experimentais de controlo da expressão genética Ao nível da expressão genética podemos ter situações em que verificamos que houve uma perda de função e outras em que se regista um ganho de função. Entende-se por perda de função (loss of function – LOF), uma mutação que resulta numa função proteica reduzida ou abolida e esta pode ocorrer por via da ablação do gene que para esta codifica, pela indução da degradação do mRNA ou pela própria inactivação da proteína. Já o processo de ganho de função (gain of function – GOF), que ocorre muito mais raramente, ocorre uma mutação que confere uma actividade anormal numa proteína, podendo esta ocorrer por via da expressão ectópica de uma proteína (ou seja, em locais onde esta não é normalmente expressa). Em laboratório interessa induzir losses of function e gains of function, de forma a estudar as funções dos genes, nomeadamente o seu papel em termos de patologias, e para isso recorre-se ao DNA recombinante para introduzir ou suprimir um gene, ao RNA de interferência para silenciar o mRNA produzido e a sequestração por anticorpos ou por proteínas recombinantes para actuação em proteínas. Estes testes podem-se realizar in vitro, caso sejam levados a cabo em células em cultura, ou in vivo, caso sejam realizados em modelos animais, cujos mais comuns se encontram no quadro em baixo (de notar as semelhanças embriológicas):

Técnica de electroporação A técnica de electroporação consiste na introdução de DNA recombinante em células, através da aplicação de um breve choque eléctrico de milhares de volts. Isto torna as células temporariamente permeáveis ao DNA, permitindo realizar experiências LOF, nas quais introduzimos um RNA de interferência que silencia um determinado mRNA, ou GOF, por sobrexpressão ectópica de uma proteína. Em muitos tecidos, nomeadamente a espinal medula, procede-se à introdução do DNA recombinante de um dos lados, ficando o outro intacto, como região de controlo.

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Animais geneticamente modificados A modificação genética de animais é já uma realidade e tem múltiplas aplicações, nomeadamente no campo da saúde. Transgénicos Animais transgénicos são animais cujo material genético foi alterado, através de técnicas de engenharia genética. Para produzir um animal transgénico deve-se produzir um vector (nomeadamente um plasmídeo), contendo o gene de interesse e um gene que permita que a produção da proteína codificada pelo gene de interesse ocorra num tecido particular (quando se utilizam cabras ou ovelhas, por exemplo, é útil que a produção dessa proteína ocorra ao nível do leite). O vector é então introduzido em zigotos, que, por sua vez, são colocados no útero de um indivíduo do sexo feminino (a foster mother ). Os indivíduos que se desenvolvem a partir dos zigotos são transgénicos e produzem a proteína codificada pelo gene de interesse. Os ratinhos são animais, cujo genoma é frequentemente modificado. Vamos tomar o exemplo dos ratinhos fluorescentes – estes exprimem a GFP e o DNA que codifica para esta é colocado por microinjecção num dos pronúcleos (um núcleo de um dos gâmetas, depois do espermatozóide ter entrado no óvulo, mas antes de ambos os núcleos gaméticos se juntarem). Depois, os zigotos que sobrevivem à manipulação (entre 10 e 30%) são transferidos para uma foster mother , sendo que entre 10 e 30% da descendência tem o DNA integrado no seu genoma (esta ocorre de forma aleatória), ou seja, neste caso, exprime a GFP. Os indivíduos que exprimem o gene em questão são então cruzados, de forma a originar descendência que também o exprima.

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Ratinhos KO A produção de ratinhos knockout permite a produção de indivíduos que apresentam genes que estão inactivos no organismo. Esta faz-se à conta de gene targeting, uma técnica na qual é levada a cabo a introdução de genes mutados (genes com uma determinada inserção no meio) numa célula-tronco embrionária por electroporação (num processo, cuja eficiência ronda os 5%). Estes passam a integrar o conteúdo cromossómico das células-tronco, através de recombinação homóloga, ocorrendo isto uma vez em cada 105 células estaminais transfectadas. As células embrionárias contendo a mutação knockout são então introduzidas no embrião de um ratinho, sendo os descendentes gerados, quimeras (uma quimera é um animal que tem duas ou mais populações diferentes de células geneticamente distintas). As quimeras são então cruzadas com indivíduos wildtype (“normais”), levando à formação de descendência

normal e heterozigóticos para o gene knockout . Os indivíduos heterozigóticos são então cruzados, levando à produção de indivíduos knockout, wild-type e heterozigóticos. De referir que, os indivíduos heterozigóticos são mantidos, pois os ratinhos knockout não têm grande viabilidade reprodutiva, contrariamente aos heterozigóticos. A produção de indivíduos knockout é essencial para o estudo de patologias, como o piebaldismo, malformações originadas pela deficiência no gene KIT. Sistema Cre-Lox O sistema Cre-Lox permite a produção de indivíduos transgénicos modificados, ou seja, que exprimem um dado gene em apenas determinados tecidos. Dessa forma, utilizamos um indivíduo com o promotor de um tipo específico de uma célula e com o gene que codifica a enzima Cre-recombinase (abreviada como Cre), que é posto a cruzar com outro que apresenta o gene de interesse ladeado por dois loci Lox P (sequências de nucleótidos, iguais de ambos os lados que flanqueiam o exão em questão). A descendência apresenta células onde se manifesta o gene de interesse (aquelas onde está presente a proteína Cre e que correspondem às células-alvo do promotor) e células normais, onde não está presente a proteína Cre.

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RNA de interferência O RNA de interferência (RNAi) é um processo que consiste na indução da formação de regiões de cadeia dupla de mRNA que são degradadas pela célula. Este pode ser levado a cabo através dos MicroRNAs e do siRNA. Estes permitem então o silenciamento da expressão de alguns genes, algo que pode ser útil no tratamento contra o cancro. Para além disso, o uso de siRNA em linhagens celulares é eficiente e facilmente controlável e exequível. MicroRNAs Os microRNAs desempenham importantes funções nos genes humanos – estimando-se que cerca de 30% destes são controlados por miRNAs (conhecem-se actualmente mais de 400 genes humanos regulados por miRNAs). Para além disso, 80% dos miRNAs são específicos para determinados tecidos. Os micro-RNAs apresentam em média 22 ribonucleotídeos e são transcritos a partir de genes próprios ou de intrões, através da RNA polimerase II ou III. Uma vez no citosol, os miRNAs ligam-se a mRNAs alvo, formando regiões de cadeia dupla, que são degradadas, ou cuja tradução é silenciada. In vitro é possível a síntese de small hairpin RNAs, que mimetizam os micro-RNAs endógenos.

siRNA Para levar a cabo o mecanismo de siRNA, começa-se por se introduzir na célula uma longa cadeia de dsRNA (double-stranded RNA - RNA em cadeia dupla). Esta é clivada em siRNAs (short interfering RNA) pela enzima dicer , apresentando cada siRNA cerca de 20 nucleotídeos. Alternativamente, é possível a síntese de siRNAs fora da célula e posterior introdução desta estrutura no meio intracelular.

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A proteína Ago ( Argonaute ) procede então à clivagem de uma das cadeias de cada siRNA, algo feito com gastos de ATP. Isto activa o RISC (RNA-inducing silencing complex ) e permite a ligação do siRNA ao mRNA alvo, formando uma estrutura de cadeia dupla, que é logo degradada. O RNA antisense funciona de um modo similar ao siRNA, contudo, é introduzida uma cadeia simples de RNA, complementar a uma cadeia de mRNA, à qual ela se vai ligar, impedindo assim que ocorra tradução.

Desafios para a medicina Apesar das vantagens do uso de partículas recombinantes, existe ainda um grande obstáculo à sua aplicação em grande escala, no tratamento de doenças, em medicina e que se prende com o como fazer as partículas recombinantes chegar aos tecidos onde estas devem actuar. Não podemos aplicar choques eléctricos e introduzi-las por electroporação, nem criar linhas de seres humanos transgénicos. Os meios de administração mais viáveis prendem-se então com a utilização de vírus, com o conteúdo genético em causa, ou lipossomas.

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Citosqueleto - Actina Citosqueleto O citosqueleto permite a organização espacial das células, bem como a sua interacção mecânica com o ambiente. Este é um sistema de filamentos, de tal forma dinâmico, que permite também que a célula tenha uma certa mobilidade. Dessa forma, são funções do citosqueleto:



Organização espacial da célula Movimentar os cromossomas na mitose



“Condução” de organelos e do “tráfego” intracelular



 



Suporte da membrana citoplasmática Permite mobilidade, nomeadamente que células como os espermatozóides nadem, ou células como os leucócitos se desloquem sobre superfícies. Permite a contracção nas células musculares

Estas variadas funções dependem da presença de três famílias de moléculas proteicas que constituem os filamentos que formam o citosqueleto, nomeadamente a actina, os filamentos intermediários e os microtúbulos. Apesar do nome citosqueleto, sugerir algo rígido, a verdade é que o citosqueleto não é estático e está em permanentes modificações.

Actina A actina é uma das proteínas constituintes do citosqueleto. Representa cerca de 10% das proteínas totais das células musculares (percentagem em termos de massa) e entre 1% e 5% das células não-musculares. As subunidades individuais de microfilamentos de actina são denominadas de Gactina ( actina globular ), que se organizam em polímeros filamentosos, denominados de F-actina (actina filamentosa). As moléculas de G-actina apresentam uma fenda de ligação ao ATP e um ião Mg 2+. A F-actina apresenta uma estrutura em dupla hélice, sendo que cada monómero de G-actina contacta com outros quatro. Estes microfilamentos medem aproximadamente 7nm de diâmetro e apresentam uma sequência igual de 36 em 36 nm. Os microfilamentos apresentam polaridade, manifestando-se essa polaridade em termos estruturais, funcionais e de alongamento. O pólo positivo encontra-se na extremidade barbed (“em ponta de seta”) e o pólo negativo corresponde à extremidade pointed (estes nomes de extremidades aplicam-se sobretudo a quando

a actina se encontra associada à miosina). Na extremidade pointed , a fenda de ligação ao ATP da molécula de actina está em contacto com o citosol, enquanto na extremidade barbed, a fenda ligação ao ATP da molécula de actina está ligada a outro monómero . A formação de filamentos a partir de unidades de G-actina faz-se por três fazes distintas – nucleação, alongamento e estado estacionário. A fase de nucleação prende-se com a formação de um núcleo, um oligómero formado por uma quantidade reduzida de monómeros de G-actina. Esta é a etapa mais lenta do processo de formação de filamentos e também a etapa limitante, devido à instabilidade desses

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mesmos oligómeros formados. A lentidão do processo de nucleação é vantajosa para a célula, na medida em que lhe permite determinar em que local serão formados os novos filamentos. A polimerização de filamentos é feita apenas se existir uma determinada concentração mínima de actina na célula. Esta concentração é designada por critical concentration (CC) e difere nas duas extremidades. Uma vez ultrapassada esta fase de nucleação, segue-se a fase de alongamento, na qual os monómeros são rapidamente associados às extremidades. No final, encontramos um estado estacionário, em que a quantidade de monómeros adicionados equivale à de monómeros que se dissociam do filamento.

A polaridade influencia também a polimerização de filamentos. A adição de G-actina aos filamentos ocorre preferencialmente no pólo positivo e a sua remoção ocorre preferencialmente no pólo negativo. Este processo denomina-se por treadmilling e a sua ocorrência está dependente da concentração citosólica de subunidades de G-actina. Dessa forma: 





+

Para valores de concentrações de ATP-G-actina entre os valores de Cc (concentração crítica na extremidade positiva) e Cc- (concentração crítica na extremidade negativa), ocorre adição de Gactina no pólo positivo e remoção no pólo negativo. Para valores de concentrações de ATP-G-actina superiores aos valores de C c+ e Cc-, ocorre adição de G-actina em ambos os pólos Para valores de concentrações de ATP-G-actina inferiores aos valores de C c+ e Cc-, ocorre remoção de G-actina em ambos os pólos.

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Proteínas de ligação à actina ( actin-binding proteins) Os microfilamentos podem sofrer capping, através do acrescento de CapZ no pólo positivo ou de tropomodulina no pólo negativo. O capping dos microfilamentos no pólo positivo impede o seu crescimento nesse pólo e o capping no pólo negativo estabiliza o filamento. Para que ocorra nucleação dos microfilamentos, deve haver ligação da G-actina à formina. A ligação desta proteína à extremidade positiva impede a ligação da CapZ, permitindo o crescimento do filamento. A actividade das forminas é regulada pela via de sinalização da Rho-cinase . As actin related proteins (ARP 2/3) permitem a nucleação e o crescimento no pólo positivo. Contudo, como a sua capacidade de nucleação é baixa, este complexo precisa de filamentos formados e da proteína WASp. Esta última altera a conformação do complexo proteico em causa, permitindo a ligação de um filamento de actina (mais próximo do pólo positivo) ao filamento principal, existindo entre eles um ângulo de 70º. Isto leva a uma estrutura ramificada da actina.

Cerca de metade da actina total na célula é ATP-Gactina e a ADP-actina e a ATP-actina são convertíveis. A profilina liga-se à ADP-G-actina, catalisando a conversão desta em ATP-G-actina (por troca de ADP por ATP), ligando-se depois esta última ao pólo positivo do filamento de actina. Já a cofilina liga-se à F-actina na região da extremidade negativa. Essa ligação destabiliza o filamento, precipitando a quebra deste nesta extremidade. Isto gera subunidades ADP-actina ligadas a cofilina e mais extremidades negativas livres. A timosina-β4, por sua vez, liga-se à ATP-G-actina, inibindo a adição desta a qualquer uma das extremidades. Esta proteína está presente em grande quantidade nas plaquetas, que apresentam grandes quantidades de actina. De referir que é este dinamismo na polimerização da actina que torna possível movimentos intracelulares e emissão de prolongamentos citoplasmáticos.

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Organização dos filamentos de actina Os filamentos de actina podem apresentar uma organização em rede ou em feixe, podendo este último tipo de organização ser em feixe contráctil, caso os filamentos se disponham em direcções opostas, ou em feixe paralelo, caso os filamentos se disponham paralelamente. Os feixes contrácteis estão relacionados com a ligação da actina à α-actinina, permitindo que a miosina II se interponha no feixe. Este tipo de feixes está muito presente nas células musculares. Já os feixes paralelos estão associados à ligação da fimbrina e a sua disposição, com poucos espaços entre os filamentos, impede que a miosina II se interponha no feixe. Este tipo de feixes existe nos filopodia, projecções citoplasmáticas presentes em células migrantes e em microvilosidades. Já associada a uma organização em rede, encontramos a proteína filamina. No que concerne a proteínas de ligação (crosslinking), destaque ainda para a espectrina, que permite fazer arranjos hexagonais, essenciais para a manutenção da membrana citoplasmática (algo que é mediado pelas anquirinas) e cujas mutações resultam em anemia esferocítica - fragilidade da membrana do eritrócito. Por último, a distrofina permite ligar o citosqueleto de uma fibra muscular até à membrana citoplasmática. A sua ausência caracteriza-se por distrofias musculares.

Sistema actina-miosina As miosinas são uma super-família proteica, cuja função é a de conversão de ATP em energia mecânica. Existem cerca de 20 classes diferentes de miosinas, sendo que estas proteínas, com excepção da de classe VI (que participa na endocitose) movimentam-se sempre do pólo negativo para o pólo positivo da actina. Mutações nas miosinas podem causar cegueira e surdez.

De entre as proteínas motoras encontramos as miosinas de classes I, II e V. A miosina de classe I , ao ligar-se à actina relaciona-se com a endocitose e com a associação de actina à membrana.

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A miosina de classe V está associada ao transporte de organelos. Esta classe miosina desloca-se “passo a passo” sobre a molécula de actina, ou seja, uma das cadeias pesadas da miosina fica fixa à actina, enquanto a outra avança 72 nm em direcção ao pólo positivo. Interacções entre a actina e a miosina da classe II Os músculos esqueléticos são compostos por fibras musculares, células multinucleadas, que apresentam várias miofibrilas dispostas em feixe. Estas são constituídas por unidades básicas, os sarcómeros, complexos multiproteicos, situados entre dois discos Z e onde encontramos feixes de miosina de classe II intercalados com filamentos de actina. O facto de um feixe de miosina deslocar-se por dois filamentos de actina permite que, aquando da contracção muscular, ocorra uma aproximação dos filamentos de actina.

A miosina de classe II apresenta uma cabeça ( head ), um pescoço ( neck - com duas cadeias leves, uma essencial e uma regulatória) e cadeias pesadas. Os feixes de miosina presentes num sarcómero apresentam um total de 325 nm de comprimento. A miosina de classe II forma complexos bipolares, através da interacção de domínios presentes na cauda e dispostos antiparalelamente. O seu movimento é feito com gasto de ATP – quando esta molécula se liga à cabeça da miosina, esta separa-se da actina, movimentando-se. Quando ocorre a desfosforilação do ATP em ADP+Pi, ela liga-se de novo à actina. Este movimento necessita também da presença de cálcio, que se liga à troponina. Esta ligação modula a actividade da tropomiosina, impedindo-a de obstruir os locais de ligação à miosina, na actina. Isto permite então que a miosina se ligue à actina e que se dê a contracção muscular. O cap Z e a tropomodulina são estabilizadores do sarcómero, na medida em que, ocorrendo um capping nos filamentos de actina, em ambas as extremidades, não ocorre crescimento nem regressão do tamanho dos filamentos em causa. A nebulina e a titina funcionam como estabilizadores adicionais do

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sarcómero – a nebulina estende-se ao longo do filamento de actina desde o disco Z até à tropomodulina, onde se liga. Esta molécula determina o comprimento dos filamentos de actina presentes no sarcómero. A titina é outra grande proteína ligada por um lado ao disco Z e, por outro, à molécula contralateral. Esta é uma molécula elástica que previne um alongamento excessivo e que segura os filamentos de miosina. As fibras contrácteis actina/miosina II também funcionam em células não-musculares, nomeadamente ao nível da citocinese, formando o anel contráctil regulado por fosforilação e que permite a divisão das duas células e ao nível da migração celular.

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Citosqueleto – Microtúbulos e filamentos intermediários Microtúbulos Os microtúbulos são polímeros de dímeros de αβ-tubulina, que se dispõe numa mesma linha, numa estrutura de 8 nm. Este polímero dispõe-se sob a forma de túbulos ocos com um diâmetro de 25 nm. Tal como os filamentos de actina, os microtúbulos apresentam polaridade, sendo que na extremidade negativa estão expostas subunidades de α-tubulina e na positiva, subunidades de βtubulina. A polimerização dos microtúbulos ocorre de modo similar ao da dos filamentos de actina, compreendendo uma fase de nucleação, em que a adição de dímeros de αβ -tubulina é mais lenta, uma de alongamento e uma última de estado estacionário, ocorrendo a adição de monómeros preferencialmente na extremidade positiva dos microtúbulos. A temperatura revela-se como um factor que influencia a polimerização dos microtúbulos, pois a temperaturas inferiores a 4º C ocorre despolimerização destes. Tal como acontece ao nível da polimerização de actina, também aqui se verifica a ocorrência de + treadmilling, ou seja, a concentrações de tubulina intermédias entre C c e Cc (as que existem no citosol) ocorre preferencialmente adição de monómeros no pólo positivo e remoção no pólo negativo. De referir que, na célula a polimerização dos microtúbulos é favorecida à despolimerização. Intrinsecamente associada à polimerização de microtúbulos temos o conceito de instabilidade dinâmica ao nível da extremidade positiva. Acontece que estes se vão formando, estando presente GTP nas subunidades β-tubulina. Quando o GTP é convertido a GDP, a conformação das subunidades é alterada, levando a que o polímero passe a apresentar ligações mais fracas. Ora, isto leva a que o proteofilamento se curve e a que ocorra o desmembramento de dímeros de αβ -tubulina do microtúbulo, que entra numa situação de catástrofe. Contudo, um microtúbulo que entrou em catástrofe pode recuperar as suas dimensões, entrando num processo de resgate.

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A colquicina, vimblastina e colcemid impedem a polimerização dos microtúbulos. O taxol (que se extrai da árvore Teixo do Pacífico) provoca a polimerização rígida. Todas estas substâncias têm aplicação terapêutica como quimiostáticos. MTOC Os microtúbulos são organizados nos MTOCs - Microtubule organizing centers . Esta estrutura, da qual os microtúbulos emergem com as extremidades positivas voltadas perifericamente, apresenta duas funções principais – a organização dos flagelos e cílios nos eucariontes e do fuso acromático que separa os cromossomas durante os processos de divisão celular (mitose e meiose). É também nos MTOCs que ocorre a nucleação dos microtúbulos. Entre os tipos de MTOCs, destaque para o centrossoma e para os corpúsculos basais (associados com os cílios e certas junções intercelulares de células epiteliais). Encontramos também MTOCs na região do cone axonal do neurónio. A γ-tubulina forma complexos anelares (γ -TuRCs) que facilitam a nucleação dos microtúbulos. Esta proteína é por isso encontrada sobretudo nos centrossomas. Os centrossomas são organelos que funcionam como reguladores da progressão do ciclo celular, permitindo o movimento cromossómico, durante a divisão celular. Estes são compostos por dois centríolos dispostos perpendicularmente, rodeados por uma massa amorfa de proteína (o material pericentriolar). Visto num corte transversal um centríolo apresenta nove tripletos de microtúbulos. Dentro dos cílios e dos flagelos, o citosqueleto de microtúbulos é denominado de axonema. O axonema dos cílios apresenta tipicamente um anel externo com nove pares de microtúbulos e, centralmente, um par de microtúbulos. A mobilidade do cílio ocorre à conta da dineína axonemal. Os corpúsculos basais encontram-se na base dos cílios ou flagelos e são os locais que permitem o crescimento dos microtúbulo no axonema. Estas estruturas derivam dos centríolos apresentando uma estrutura similar de nove tripletos de microtúbulos. Proteínas associadas aos microtúbulos É possível a ligação de proteínas aos microtúbulos ( Microtubule-associated proteins - MAPs). A proteína Tau é uma MAP, na qual mutações podem levar à desintegração de microtúbulos neuronais nos doentes de Alzheimer. Já a proteína TIP EB1 associa-se exclusivamente às extremidades positivas dos microtúbulos, estabilizando-os. A cinesina-13 é uma proteína que desagrega os microtúbulos, a partir de ambas as suas extremidades, através da sua ligação aos dímeros αβ -tubulina, algo que ocorre com consumo de ATP, enquanto a estatmina desagrega os microtúbulos ligando-se a dois dímeros de αβ tubulina. As dineínas e as cinesinas são as duas grandes classes de proteínas motoras dos microtúbulos. Existem 14 classes de cinesinas e estas em termos gerais e estruturais apresentam uma cauda, onde está presente a cadeia leve, um stalk (à espécie de um corpo em dupla hélice) e uma cabeça, ligada ao stalk por uma região de linker. Esta classe proteica movimenta-se no sentido da extremidade positiva do microtúbulo. As cinesinas-1 e 2 permitem o transporte dos organelos, aos quais se ligam pela cauda (a cabeça liga-se ao microtúbulo). A cinesina-5 é bipolar e permite o deslizamento de dois microtúbulos, enquanto a cinesina-13 promove a destruição dos microtúbulos. O movimento das cinesinas é feito

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“passo a passo” e com consumo de ATP, que ao ligar -se à cabeça motora “da frente” promove o avanço da cabeça motora “de trás”, que ao ligar -se aos microtúbulos libertam ADP, permitindo uma posterior

ligação de ATP.

Já as dineínas movimentam-se no sentido da extremidade negativa do microtúbulo, também “passo a passo” e com consumo de ATP. A sua estrutura apresenta um domínio de ligação ao microtúbulo, um stalk , uma cabeça com um domínio ATPase e um tronco

com o domínio de ligação à dinactina. A dinactina é uma proteína que se liga à dineína e à cinesina II, permitindo a ligação da dineína aos organelos e, consequentemente, o seu transporte. Compreendemos que são os microtúbulos, bem como as proteínas motoras com eles relacionadas, os responsáveis pela organização do citoplasma, pela manutenção do correcto posicionamento dos seus organelos e pelo transporte não só de organelos, como também de vesículas.

Filamentos intermediários Os filamentos intermediários são estruturas exclusivas das células animais que, apesar de bioquimicamente heterogéneos têm como características comuns o facto de não apresentarem polaridade, de não polimerizarem nem despolimerizarem, de poderem estar presentes no núcleo (contrariamente à actina e aos microtúbulos) e de apresentarem grande resistência mecânica. Os filamentos intermediários são codificados por 70 genes humanos diferentes, existindo cinco classes destes que se encontram sintetizadas na tabela da página seguinte:

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As unidades básicas dos filamentos intermediários são dímeros. Estes, em todas as classes, apresentam um domínio em α-hélice, constituído por 310 aminoácidos, um terminal amina (correspondente à cabeça) e um terminal carboxilo (correspondente à cauda). Os dímeros associam-se em direcções opostas, formando tetrâmeros simétricos (razão pelas quais os filamentos intermediários não têm polaridade). Os tetrâmeros associam-se formando protofilamentos e quatro protofilamentos formam uma protofibrilha. Quatro protofibrilhas, por sua vez, associam-se formando um filamento de 10 nm. Dessa forma, um filamento intermédio apresenta 16 protofilamentos. As percursoras da formação de todos os filamentos intermediários são as laminas nucleares, em cujas mutações, verificamos a presença de progerias como a de de Hutchison-Gilford ou distrofias musculares como a de Emery-Dreifuss. Os neurofilamentos estão presentes nas células neuronais, sendo constituídos por três proteínas – a NFL, a NF-M e a NF-H. Já a queartina está presente na constituição do cabelo, pele e unhas e daí que a epidermólise bulhosa seja causada por mutações na queratina K14. Esta patologia manifesta-se através da formação de filamentos intermediários muito frágeis. No citosqueleto há uma constante interacção entre os vários tipos de filamentos. A título de exemplo, os fibroblastos encontramos filamentos de plectinas, ligando os microtúbulos a filamentos intermediários. Também, os melanossomas são transportados ao longo de microtúbulos e no cortex celular, ligam-se a miosina V, deslocando-se sobre os microfilamentos de actina.

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Atlas de Microscopia de Biologia Celular e Molecular

Tipos de células A. Células procarióticas ML - Bactérias Gram-positivas ( Staphylococcus)

Observam-se numerosas células coradas de roxo, esféricas (cocos), isoladas ou em cacho.

ML - Bactérias Gram-negativas ( Escherichia coli )

As células estão agora coradas de vermelho e são alongadas, em bastonete (bacilos). Coloração de Gram: roxo de metilo a 0,5% + lugol, diferenciação pelo álcool-acetona e passagem pela

fucsina ácida. As bactérias Gram positivas manterão a cor do roxo de metilo; as Gram negativas perdêla-ão na diferenciação pelo álcool-acetona ficando apenas coradas pela fucsina (vermelho).

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ME- Bactéria Gram positiva - Bacillus subtilis

Vêem-se 4 bacilos resultantes de duas divisões sucessivas. Entre as duas células centrais, a parede celular é completa, o que não sucede entre as células, ainda não totalmente individualizadas, das extremidades. Observa-se o nucleóide que possui DNA filamentoso disperso e os ribossomas. A parede celular é densa, homogénea e não estratificada. Contém peptídeoglicanos (mureína), substância em grande parte responsável pela Gram-positividade da bactéria.

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ME - Gram-negativo. E. coli

Além das estruturas descritas na imagem anterior, notar a membrana citoplasmática e a parede celular formada por: camada densa, delgada, contendo mureína e uma segunda membrana (membrana externa da parede) análoga à citoplasmática.

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ME - Bactéria fotossintética. Rhodospirillium rubrum, Gram-negativo

No citoplasma em redor do nucleóide claro, numerosas vesículas, os cromatóforos, em cuja membrana limitante existe o sistema fotossintético. Trata-se de uma célula autotrófica, capaz de sintetizar compostos orgânicos quartenários a partir do C, H, O e N da atmosfera e da água.

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ME - Cianófita

Apresenta estrutura semelhante às bactérias Gram- mas, além disso, no citoplasma vêem-se sistemas de membranas sobrepostas, funcionalmente semelhantes ao grana das plantas superiores, derivados de invaginações da membrana citoplasmática. Estes organismos são incluídos nos procariontes por não terem núcleo individualizado ou mitocôndrias, mas executam a fotossíntese como as plantas superiores, produzindo inclusive hexoses.

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B. Células eucarióticas ML - Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Wright

Nesta preparação observam-se várias células, com contornos bem definidos, devido à presença de parede celular. No seu interior existem vacúolos em número distinto, e por vezes, é possível distinguir o núcleo.

ML - Observação de folhas vivas de Elodea em montagem aquosa

Notam-se fiadas de células rectangulares limitadas por parede celular acastanhada. No interior da célula observa-se o núcleo ovóide, pouco distinto, e os plastos periféricos, ovalares e verdes, que se desloca m lentamente quando iluminados.

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ME - Corte de folha jovem de alface

Característicos de uma célula vegetal são: a parede celular distinta da membrana citoplasmática, os vacúolos (pequenos numa célula jovem) os plastos (antes de termos cloroplastos totalmente formados, designamos estas estruturas por plastos) cujos tilacóides os permitem distinguir das mitocôndrias e a riqueza em ribosomas livres. Notar núcleo, com regiões de heterocromatina e eucromatina, nucléolo e invólucro nuclear, que apresenta duas membranas, uma externa e uma interna.

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ME - Corte de folha desenvolvida de beterraba

Nesta folha, quase todos os vacúolos confluíram num único enorme. Em quase todos os plastos há massas densas de amido.

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ME- Célula de fígado de rato

Nesta célula hepática observam-se o retículo endoplásmico rugoso (RER), ao qual estão associados ribossomas, mitocôndrias, lisossomas (que apresentam forma aproximadamente circular, sendo muito electronodensos e tendo granulações várias, sendo, por isso, muito heterogéneos entre si) e perixossomas, cuja função passa pela eliminação de radicais livres, resultantes de reacções celulares e pela oxidação de lipídeos. Os peroxissomas apresentam um aspecto liso, sendo menores que os lisossomas e tendo uma membrana mais recortada. São ainda visíveis depósitos de glicogénio, visto esta ser uma célula hepática. Estes depósitos apresentam-se como massas escuras, podendo ser constituídas por “pintas” agregadas (partículas alfa), ou dispersas (partículas beta). A membrana citoplasmática não é visível no campo, mas entre o núcleo e o citoplasma vê-se o invólucro nuclear com as suas duas membranas e complexos de poro nuclear (interrupções do invólucro).

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Núcleo A – Morfologia do núcleo em interfase em microscopia de luz ML - Fígado do rato. H + E No interior dos núcleos observa-se uma trama irregular de filamentos e grânulos arroxeados (basófilos). Destacam-se um ou dois grânulos maiores, que são os nucléolos. Os restantes elementos corados representam a cromatina condensada ou heterocromatina estando a eucromatina dispersa no núcleo. Pela coloração não é possível distinguir o nucléolo (RNA) da cromatina (DNA) dado que ambos são basófilos.

Corpo cavernoso humano – Microscopia de fluorescência

Marcação de núcleos celulares com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), que se liga fortemente ao DNA e emite uma radiação azul visível em microscopia de fluorescência. É largamente utilizado para corar núcleos celulares e cromossomas em microscopia de fluorescência.

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B - ME - Cromatina expandida de um núcleo em interfase

Cromatina organizada sob a forma de nucleosomas na fibra de 10 nm, a expandir-se de um núcleo em interfase após extracção do invólucro com detergente e tratamento com tampão hipotónico.

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C- Invólucro nuclear Pâncreas de rato – Detecção das laminas A+C por imunocitoquímica + hematoxilina Cortes de pâncreas de rato foram incubados com anticorpo primário produzido na cabra anti-laminas A+C, a que se seguiu um secundário de ratinho anti - cabra e um complexo de estreptavidina-peroxídase que foi evidenciado com DAB. Em muitos núcleos observa-se uma circunferência castanha a delimitar os núcleos, correspondente à lâmina nuclear fibrosa que integra o invólucro nuclear.

ME - Núcleo de célula do córtex supra-renal do rato

Observa-se o invólucro nuclear constituído por duas membranas perinucleares separadas por uma cisterna. Estas são contínuas nos complexos de poro nuclear (cabeça de seta). No interior do núcleo (N) observa-se um nucléolo (nu) e cromatina condensada - heterocromatina (hc) junto ao nucléolo e na periferia, e cromatina dispersa - eucromatina (ec) em toda a área do nucleoplasma com organização granular não compacta. No nucléolo distingue-se, o componente granular (3), os centros fibrilares (1) rodeados por componente fibrilar denso (2). Observar os grânulos pericromatínicos (setas) com diâmetro aproximado de 40 nm, e halo envolvente com 25 nm de espessura (setas).Este material foi tratado para autorradiografia, observando-se alguns grãos de prata (círculos).

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ME - Matriz nuclear do hepatócito do rato

As matrizes nucleares foram obtidas a partir de núcleos isolados, extraídas com nucleases, detergentes e tampões salinos. No invólucro nuclear residual, observam-se os complexos de poro nuclear (seta), lâmina nuclear (L) e restos de membranas do invólucro (i). Observa-se grânulos intercromatínicos (cabeça de seta). Os nucléolos apresentam-se muito compactados devido à acção química do processo de extracção. A cromatina foi totalmente removida pela DNaseI que se utilizou.

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D - Nucléolo Ver lâmina “Núcleo de célula do córtex supra-renal do rato ”

Após a administração de 4-APP (4-aminopirazolopirimidina), o nucléolo fragmenta-se evidenciando melhor algumas das suas estruturas: centro fibrilar (1), componente fibrilar (2), e componente granular (3). Não se observa a cromatina condensada associada ao nucléolo. Este aspecto é devido à acção da droga.

E - Núcleos em replicação de DNA Supra-renal de rato. Detecção por imunocitoquímica do PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Antigen). + hematoxilina hematoxilina

Cortes de glândula supra-renal de rato foram incubados com anticorpo primário, anti-PCNA, depois com um secundário de cabra anti-ratinho e um complexo de estreptavidina-peroxídase que foi evidenciado com DAB. Observam-se numerosos núcleos com tonalidade castanha escura, demonstrando a replicação do DNA, em contraste com a coloração azul dos restantes.

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Focos de replicação do núcleo

Observação por microscopia de fluorescência dos focos de replicação no núcleo celular em interfase de células humanas em cultura, onde é evidente co-localização (amarelo-figura da direita) do PCNA (Red fluorescent protein RFP-vermelho) e da DNApolimerase (green flourescent protein GFP - verde). De modo a exprimir as duas proteínas fluorescentes, transfectaram-se as células com plasmídeos contendo o cDNA do PCNA, e DNApolimerase em fusão com cDNA codificantes para as RFP e GFP, respectivamente.

F - Transcrição T ranscrição e splicing do mRNA Domínios de transcrição e speckles

Observação por imunofluorescência da localização da histona H3 hiperacetilada (vermelho) no núcleo em interfase de fibroblastos humanos. O DNA DNA está corado de azul pelo DAPI (figura A). Evidência de que a hiperacetilação da histona H3 (vermelho) co-localiza com os focos de transcrição (figura B), onde ocorre incorporação de bromo-uridina BrU (verde) na síntese de RNA. Na figura C observa-se os speckles que correspondem aos grânulos intercromatínicos evidentes em TEM, e que acumulam pequenas RNP que efectuam o splicing dos mRNAs. A sua distribuição assemelha-se à dos focos de transcrição dos mRNAs.

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Sebenta de BioCel

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