Resumen segundo parcial de IBMC
MEMBRANA PLASMÁTICA La membrana plasmática está formada por una bicapa de lípidos. Los lípidos de membrana son: glipolípidos (un azúcar unido a dos ácidos grasos), colesterol (molécula que posee una cabeza polar y una cola hidrocarburada no polar) y fosfolípidos. Los fosfolípidos son moléculas formadas por una cabeza de glicerol unida a un grupo fosfato que le otorga polaridad y una cola de tres ácidos grasos no polares, es por esto que se trata de una molécula anfipática. Es por esto que pueden formar estructuras en micela, donde las colas polares se encuentran hacia adentro y las cabezas polares salen al exterior o como bicapa lipídica donde dos capas de fosfolípidos se agrupan paralelamente juntando sus colas no polares y dejando por lo tanto, sus cabezas polares expuestas. Los ácidos grasos de las colas hidrofóbicas pueden encontrarse saturados (donde los carbonos están unidos por uniones simples) por lo que su estructura es lineal, o insaturados (donde los carbonos están unidos por uniones dobles) y poseen entonces una estructura quebrada. Si la cola de ácidos grasos se encuentra saturada le otorga una estructura más rígida a la membrana ya que cada fosfolípido puede estar más cerca de otro, al contrario si las colas se encuentran insaturadas, como están quebradas el conjunto de fosfolípidos se encuentra más más separado y la membrana se ve más laxa. La compactación de la membrana depende entonces de la relación entre la cantidad de colas saturadas y colas insaturadas. La nomenclatura de los fosfolípidos se da en base a la unión covalente de ciertos grupos R polares al grupo fosfato. En 1972 se estableció el MODELO DE MOSAICO FLUIDO de la membrana plasmátcia. Este modelo se basa en el movimiento de los lípidos en la bicapa y la presencia de proteínas de membrana. Los movimientos pueden ser por difusión lateral, rotación o flip-flop (un fosfolípido de una capa cambia por el que esta paralelo a él en la otra capa). Sin embargo, hay distintos eventos que restringen el movimiento, como por ejemplo la interración entre proteínas periféricas de dos células que se encuentran cerca. Las rpoteinas de membrana pueden ser integrales, con formados por aminoácidos mayormente no polares, o periféricas p eriféricas que son afines a porciones de proteínas integrales que sobresalen de la membrana o están cargadas de manera que se atraen con las cabezas polares de los fosfolípidos. Se realizaron distintos experimentos que ayudan a validar el modelo de mosaico fluido:
Recuperación de fluorescencia posterior al foto blanqueado: Este experimento consistió en marcar la memrana con anticuerpos anti proteínas de membrana cuyo grupo constante poseían una fluorescencia roja debido una marcación con rodamina. Los anticuerpos reconocieron a las proteínas y por lo tanto la célula se vio con de fluorescencia roja. Luego se procedió a quemar la fluorescencia con laser en una porción de la membrana dejando una zona blanqueada blanqu eada irreversible. Al incubar a
37°C (ya que en frio la membrana es rígida) y al cabo de un tiempo se vio que la mancha blanca fue desapareciendo gradualmente y la célula volvió a ser roja. Esto se debió por la difusión lateral de los fosfolípidos que llevan a las proteínas que a su vez llevaban los anticuerpos. De esta manera se ratifica el modelo de mosaico fluido.
Experimento de Frye y Edidin:En este experimento se resuspendieron células de ratón y humanas cuyas membranas se debilitaron con el fin de que se forme lo que se llama un heterocarión formado por una fusión de membrana ratón y humana donde las proteínas de membrana de cada especie se encuentran de un lado o del otro. Se agregaron anticuerpos anti proteína de ratón marcados con fluorescencia roja y anticuerpos anti proteína de humano marcados con fluorescencia verde. De esta manera el heterocarión fluoresce rjo de un aldo y verde del otro pero con el tiempo y mientras se enceuntre a 37 °C debido al movimiento de los lípidos los colores se van mezclando. Esto apoya entonces al modelo de mosaico fluido. Experimento de patching y capping: En este experimento se agregaron anticuerpos marcados con fluorescencia roja (rodamina) para que se unan a las proteínas periféricas de membrana. Sin embargo, los anticuerpos anticue rpos utilizados aquí fueron divalentes, es decir que poseen dos partes variables, que por lo tanto pueden reconocer distinta proteínas y agarrarlas de a dos que entonces se moverán juntas De esta manera, fueron quedando parches, donde cada proteína fue reconocida por dos anticuerpos (la parte variable de uno y la parte variable de otro). Con el tiempo, gracias al movimiento de los fosfolípidos, se juntaron todas formando un CAP. Este experimento apoya el modelo de mosaico fluido.
Es posible separar los distintos tipos de proteínas guiándose por protocolos diferentes. Utilizando un protocolo suave se pueden separar la membrana con las proteínas integrales de las proteínas periféricas gracias a soluciones salinas o cambios de PH. Si se utiliza un protocolo fuerte, puede separarse proteínas pr oteínas periféricas e integrales de la membrana, gracias a un detergente que forme una micela y “limpie” la membrana. También es posible realizar un fraccionamiento subcelular para posterior análisis de proteínas periféricas e ntegrales ya que separa s epara organelas. Para ello se corta co rta un pedaso de tejido, en general hígado, y los pedacitos se meten en un homogeneizador tipo “dounce” que es un tubo con un pistón que al empujarlo aplasta las células por presión rompiendo las membranas plasmáticas. La homogeneización es por lo tanto la ruprua de células y lo que se obtiene de ello es un homogenato donde se encuentran las organelas libres. Una vez obtenido el homogenato se pasan a hacerse varias centrofugaciones diferenciales con potenciales y tiempos cada vez mayores. Luego de la primera centrifugación se encuentran en el pellet los núcleos, en la segunda mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, en el tercer
pellet están los microsomas (retículo endoplasmático roto) y finalmente en la última centrifugación obtengo un pellet de ribosomas y en el sobrenadante citosol puro. La membrana plasmática tiene varias FUNCIONES entre ellas están recibir información externa, permitir la entrada y salida de moléculas dentro y fuera de la célula y aportar movimiento y expansión a la célula. Dependiendo la conformación de los lípidos y las proteínas la bicapa posee dos dominio, del lado citosólico o del lado extracelular. En la parte de adentro, el espacio entre capas lipidicas, llamada espacio periplasmido, y entre las colas hrodrofóbicas se encuentran moléculas de colesterol que dan una estrucutra llamda balasa de lípidos que si bien es muy rígida, es más grande y por lo tanto, juntos, producen mayor fluidez global. Además, las prtoteinas del dominio extracelular, tanto periféricas como integrales que sibresalen sibr esalen pueden estar glicosiladas y por lo tanto formando un glicoma.
Proteínas integrales
Linkers Enzimas Receptores: Con dominio extracelular el cual sufre un cambio conformacional con la llegada de una señal o ligando que se propaga y se cambia el dominio cotisólico que hace que distintas proteínas se peguen a él. Por ejemplo, si la señal es una hormona de crecimiento, se cambia el dominio extracelular y luego el citosólico que indica a la célula que crezca. Transportes
Transporte pasivoA favor del gradiente de concentración, es decir de donde hay más a donde hay menos concentración y por lo tanto sin gasto de energía. Difusión simple: pequeñas moléculas no polares que pasan por la membrana y agua que pasa por osmosis. Difusión facilitada: por canales, proteínas que se abren y dejan pasar moléculas polares o por transportadores mediados que cambian conformacionalmente para dejar pasar a la molécula polar. Transporte activo En contra del gradiente y por lo tanto con gasto de energía. Transporte acoplado: una molécula se pasa, en contra del gradiente, mientras un canal está abierto haciendo difusión facilitada. Bombas: pasa moléculas en contra del gradiente gracias a que hay hidrolisis de ATP. Bombas activadas por la luz: pasa moléculas en contra del gradiente pero utilizando como fuente de energía a la luz. Por ejemplo bomba de protones, donde la membrana posee un
grupo proteíco que absorbe luz cambiando su conformación trasnfiriendo H+ de adentrohacia afuera de la célula pasivamente formando un gradiente de [H+] Sin embargo, una segunda proteína de membrana llamada atpasa reversible utiliza los protones para formar ATP a partir de ADP+P. Para que entren y salgan macromoléculas, la membrana forma compartimentos especiales: Endocitosis: La membrana forma una vesícula cuyo interior es topológicamente equivalente al medio exterior de la célula donde se meten moléculas exteriores cercanas a la membrana y que estas no toquen el citosol. Exocitosis: Se forma una vesícula dentro de la céula que encierra moléculas, la vesícula se funde con la membrana plasmática y libera las moléculas al medio extracelular.
TRANSLOCACIÓN DE MEMBRANA El retículo endoplasmático se encuentra cerca del núcleo y consiste en membranas que forman sacos y separan el interior o lumen del RE del citosol. El aparato de Golgi se eneuntra cerca del retículo endoplasmático y consiste en membranas que separan el interior o lumen del Golgi del citosol citosol formando tres sacos donde el primero es el Golgi cis o cara formadora el del medio se llama Golgi medio y el último se llama Golgi trans o cara de maduración.Su función es la de distribuir vesículas, que brotan de él. Estas son compartimentos que sirven como transporte de moléculas de un organelo a otro o de un organelo a la membrana plasmática. Estas son secreciones del RE o del Golgi y pueden encontrarse revestidas por proteínas llamadas clatrina o no revestidas. A) COTRADUCCIONAL1. Proteínas de secreción 2. Proteínas de membrana (N afuera, C adentro, C afuera, nada adentro, C afuera, N adentro, multipaso) 3. Proteínas de la membrana del RER 4. Proteínas del lumen del RER 5. Proteínas de lisosomas
1. Proteínas de secreción La hipótesis de la señal explica el camino de las proteínas que se hacen la célula pero funcionan hacia afuera de ella y se basa en que las proteínas de secreción poseen seguidillas de aminoácidos hidrofóbicos en su extremo N terminal. La síntesis de la proteína comienza en un ribosoma libre del citoplasma, sin embargo, si la proteína que se está formando tiene una cola N terminal con aminoácifdos hidrofóbico se le llama PÉPTIDO SEÑAL al cual se le pega una ribonucleoproteina llamada SRP afín a los aminoácidos hidrofóbicos que
produce la detención de la traducción ya que se ubica en el sitio A del ribosoma y no deja entrar al siguiente aminoacil. Esta proteína posee varios sitios, el de reconocimiento de péptido señal, el de reconocimiento al receptor de srp y el dominio que bloquea la traducción. El pedazo hidrofóbico de la proteína también se llama START TRANSFER ya que frente a esto una proteína de la membrana del retículo endoplasmático actúa como receptor del SRP y ancla al ribosoma a la membrana. Como el SRP es más afin al receptor que al péptido señal se disocia y la traducción vuelve a iniciarse pero el ribosoma se alojo justo arriba de un canal sellandolo para que cuando se abra lo único que pase por él es el péptido, con aminoácidos cargados, que se está formando ahora en el lúmen. El péptido señal, hidrofóbico sale por una salida lateral del canal y se mete en la membrana del retículo endoplasmático donde una PEPTIDASA DE LA SEÑAL corta esta cola hidrofóbica del resto de la proteína. El péptido señal se termina degradando y el resto queda en el lumen sin haber tocado nunca al citosol. Este paso de la proteína que se hace en el medio extracelular que pasa a hacerse en el lumen se llama TRANSLOCACIÓN COTRADUCCIONAL y el complejo proteico que permite que esto pase se llama TRANSLOCÓN (canal, receptor de SRP, peptidasa de la señal). Del lumen del retículo endoplasmático rugoso pasa al lumen del retículo endoplasmático liso. Luego, se forma una vesícula de trasnporte que lo lleva al aparato de Golgi donde se funde con su membrana y la proteína entra al lumen del Golgi. Finalmente, se arma una vesícula del secreción que sale del Golgi y hace exocitosis. Por lo tanto se puede decir que EL CAMINO POR OMICIÓN ES LA SECRECIÓN. Entonces, las proteínas de secreción se hacen en el lumen y luego pasan de lumen a vesícula y al medio extracelular sin nunca tocar el citosol ya que estos tres medios son topológicamente equivalentes. Para ser proteínas de secreción debe tener péptido señal “start transfer” N terminal
con sitio de corte para peptidasa.
2. Proteínas de membrana Tipo I:Para que una proteína termine siendo una proteína de membrana debe tener, además del primer péptido señal START TRANSFER que frena la traducción y transloca el ribosoma para que luego el resto de la proteína se haga dentro del lumen del ER mientras que él, hidrofóbico, se ancla a la membrana, un segundo péptido señal, STOP TRANSFER que al ser hidrofóbico también se ancla a la membrana frenando al translación para que el ribosoma retome la traducción del lado citosólico. De esta manera, la proteína formada tendrá tres dominios: un C terminal citosólico, uno dentro de la membrana, y un N terminal (que quedo del corte del péptido start transfer por la peptidasa de la señal) en el lumen del RE. Al transportarse en las vésiculas de transporte, el C terminal quedará expuesto al citosol mientras que el N terminal se encontrará dentro de la vesícula (medio topológicamente equivalente al extracelular) y finalmente, al llegar a la membrana,
de vuelta, el C terminal se encontrará del lado citosólico mientras que el N terminal del lado extracelular y se anclará a la membrana por el STOP transfer hidrofóbico. Tipo II: Si sucede que lo primero que se traduce en el ribosoma libre es una porción hidrofílica y luego hay un START TRANSFER interno, este es reconocido por el SRP traslocado a la membrana del RE donde se retoma la traducción normalmente dentro del lumen del RE. Sin embargo, como el N terminal era hidrofílico en el dominio citosólico, el START TRANSFER queda anclado en la membrana (y no se corta porque no tiene sitio de corte) y el resto de la proteína con el C terminal en el lumen. Por lo tanto, tanto en la vesícula de trasnporte como al finalizar la exocitosis quedará un proteína con tres dominios: el N terminal del lado citosólico y el C terminal del lado extracelular y se anclará a la membrana por el START transfer hidrofóbico.
Leyes que rigen el destino natural de proteínas de membrana Péptido señal “start trasnfer” N terminal con sitio de corte para peptidasaSecreción Péptido señal “strat trasnfer” N terminal con sitio de corte para peptidasa + péptido señal “stop trasnfer” internoUn paso de membrana con N hacia afuera y C hacia citosol. (tipo I).
Péptido señal “start transfer” N terminal sin sitio de corte para peptidasa
Proteína de membrana solo con C terminal hacia afuera (sin dominio citosólico)
Péptido señal “start trasnfer” interno sin sitio de corte para peptidasaUn
paso de membrana con C hacia afuera y N hacia citosol. (tipo II).
Péptido señal “start transfer” interno sin sitio de corte para peptidasa+ “stop trasnfer”Dos pasos de membrana con N y C terminales hacia citosol. ( si
hay varios start y stop trasnfer alernados cada dos, hay un paso más de membrana). En procariotas, al no haber RE, esto ocurre igual pero directamente en la membrana plasmática de la célula.
Glicosilación El proceso por el cuál a las proteínas de membrana se le agrega un azúcar solo se hace en células de eucariotas y se llama glicosilación. Para que se produzca, la proteína debe poseer el aminoácido asparagina (ASN) que se encuentre en el dominio del lumen, ya que le azúcar es hidrofílica y lo suficientemente expuesto como para que oligosacárido se una
covalentemente a él, y solo si se da la secuencia consenso: ASN-X-SER o ASN-X-THR donde el X puede ser cualquier aminoácido menos PRO ya que torcería la proteína. La enzima que cataliza esta reacción se encuentra en el translocón y se llama oligosacarido trasnferasa anclada a la membrana por una unión a un lípido de membrana llamado dolicol (dador) pero su sitio activo se encuentra, lógicamente, en el lumen del ER. El oligosacárido que se adhiere a la proteína posee 2 glucosainas, unidas a 9 manosas unidas a 3 glucosas que quedan expuestas. Se dice Triming al proceso por el cual ciertas enzimas del ER rugoso le quitan azucares al oligómero. Sin embargo, en el complejo del Golgi se le vuelven a agregar ázucares. Estas pueden ser solo manosas formando “glicoproteínas con alto contenido de manosas” ó otros azucares complejos formando “glicoproteínas complejas”. Luego de ser secretadas o
llevadas a la membrana plasmática los azúcares quedan del lado extracelular. Esto es lógico ya que se hicieron en el lumen. Las funciones de la glicolisación son:
Control de calidad de plegamiento (en RE rugoso). Dirigir a las proteínas lisosomales a los lisosomas (en el Golgi). Generar un ambiente muy hidrofílico en la cara externa de la membrana plasmática (en MP). Reconocimiento de una célula con la vecina (en MP).
Control de plegamiento Si una proteína se pliega “bien”, una enzima glucosidasa le quita la glucosa que se le cedió en la glicosilación y esta sigue su ruta correcta. Sin embargo, si la proteína se pliega “mal”
no puede proseguir su camino ya que la glucosidasa no puede quitarle la glucosa. No obstante, otra enzima, la glucosil trasnferasa, le agrega una glucosa y, gracias a esto, es reconocida por un chaperona anclada a la membrana del ER que la ayuda a plegarse “bien” para que ahora si la glucosidasa le quite la glucosa que le fue dada y pueda seguir su camino. Como se sabe que la glucosil trasnferasa solo reconoce proteínas mal plegadas debido a que exponen sus aminoácidos hidrofóbicos, que son reconocidos por ella, se puede decir que estar “bien” plegada quiere decir que esconden sus aa hidrofóbicos. Puede pasar que algunas proteínas mal plegadas nos sean reconocidas por la glucosil transferasa. Si esto pasa, como la chaperona no la reconoce se acumulan en el lumen del RE y son traslocadas al citoplasma donde se ubicuitinan y se degradas. Esto se llama retronslocación o purificación de proteínas mal plegadas.
3. Membrana del retículo endoplasmático rugoso Para que una proteína termine siendo una proteína de membrana del ER rugosos debe tener: Péptido seña “start transfer” amino terminal con sitio de corte para peptidasa + péptido señal “stop transfer” interno + una secuencia consenso en el C terminal KKXX-COOH (lys-lys-cualquier aa-cualquier aa). La proteína que se hace sale en un vesícula, en
dirección al Golgi y luego a la membrana plasmática, con su N terminal dentro de la vesícula y su C terminal con KKXX fuera. Cuando llega al complejo de Golgi cis, en vez de seguir hacia la membrana, sale por una vesícula que contiene adhosada una proteínas llamada COP I que interacciona con el KKXX del N terminal, expuesto al citosol y por lo tanto a ser reconocido por esta proteína, y hace que vuelva al RE y se aloje en su membrana, con el N hacia el lumen y el C hacia el citosol. El KKXX-C es una etiqueta de recuperación y no de retención, ya que las proteínas van hasta el Golgi y vuelven, si no tuviesen esa etiqueta serían de membrana tipo I. Para ser una proteína de la membrana del retículo endoplasmático rugoso debe tener péptido señal “star transfer” N terminal con sitio de corte de peptidasa + péptido señal “stop transfer” interno + KKXX-C.
4. Lúmen del retículo endoplasmático rugoso Parra que una proteína termine siendo una proteína del lumen del ER rugoso debe tener: “start trasnfer” N terminal con corte para peptidasa + una secuencia consenso en el C terminal KDEL-COOH. Van en vesículs hasta el aparato del Golgi cis (cara formadora), donde normalemnte seguiría su ruta a la secreción pero si se encuentran en una vesícula con una proteína KKXX que es reconocido por el COP I que las vuelve a traer al RE, vuelve y se queda en el lumen del RE. El KDEL-C es una etiqueta de recuperación, si no tuviese la etiqeuta serían de secreción. Para ser una proteína del lumen del RE deben tener péptido señal “start trasnfer” N terminal con sitio de corte para petidasa+ KDEL-C.
5. Lisosomas Los lisosomas son vesículas que se forman en el aparato de Golgi trans (cara de maduración) y portan en su interior, que posee PH 5, enzimas hidrolasas ácidas provenientes de distintos genes pero todas con un PH 5,2 óptimo gracias al cual son capaces de degradar macromoléculas (son nucleasas, glicosilasas, proteasas, lipasas fosfatasas, fosfolipasas). Estas no se degradan a sí mismas, al igual que las proteasas que no se cortan entre sí, ya que no poseen sitios de reconocimiento para ellas. Si bien el contenido del lisozoma es muy peligroso par la célula, este no es efectivo a PH 7, el PH normal de la célula, y por lo tanto si las enzimas solo pueden ejercer su actividad degradadora dentro del lisosoma. Para que una enzima llegue al lisosoma debe hacerse en el lumen del RE donde se glicolisan y salen por vesículas hasta el complejo de Golgi. Desde este paso hay dos maneras por las cuales pueden entrar al lisosoma.
Vía endógena:Al llegar al Golgi trans, se le agrega un fosfato a una manosa de la proteína glucosilada para que sea reconocida por un receptor de manosa fosfatada en la membrana de la vesícula que se está formando. Esta vesícula con receptores MAN-P es el lizosoma ahora lleno de enzimas hidrolasas ácidas. Vía de recuperación: En vez de empaquetarse, en el Golgi trans, en vesículas con receptores de manosa, se meten en vesículas de secreción, por lo que son secretada al medio extracelular. Sin mebargo, en la membrana palsmática hay receptores MAN-P que las hacen entran por endocitos y forman un vesícula nueva. Esta vesícula con estos receptores es el lizosoma, ahora qlleno de enzimas hidrolasas ácidas que recuperó. Tabién puede pasar que en el Golgi trans no se le agregue un fosfato a una manosa por lo que los receptores manosaP del lisosoma que se está formando no reconoce a ninguna enzima y queda vació y las hidrolasa ácidas son secretadas al exterior. No obstante, en el medio extracelular hay una enzima I que reconoce la conformación común (parche conformacional) de las enzimas lisosomales y le agrega un azúcar-P-manosa al oligómero que ya poseía la enzima lisosomal. Luego otra le quita el último azúcar para que quede la MAN-P para que al entrar nuevamente a la célula y al lisosoma por la vía de recuperación. Para ser enzimas lisosomales deben tener péptido señal “start transfer” N terminal con sitio de reconocimiento de peptidasa + estar glicosiladas en el lumen del RE + agregado de MAN-P en el Golgi trans (+ enzimas extracelulares que agreguen MAN-P si no se le agregaron en el Golgi). Hay un tipo de lisosomas llamados lisosomas secundarios. Los fagolisosomas aquellos donde entran bacterias llamadas fagosomas que se meten en la célula por endocitosis y viajan al lisosoma en vesículas. Otro tipo de lisosomas secundarios son los autofagosomas formados por organelos englobados por el RE (proceso llamado autofagia). B) POST- TRADUCCIONAL1. Proteínas de peroxisomas 2. Proteínas de mitocondrias (matríz mitocondrial, espacio intermembrana)
1. Proteinas de peroxisomas Los peroxisomas son vesículas que se forman en el RER y poseen en su interior catalasas y enzimas oxidativas con funciones detoxificadoras ( las sustancias tóxicoas son hidrofóbcas y se acumulan dentro de las bicapas por lo que son muy peligrosas). Las enzimas del peroxisoma usan como sustrato al O2 del aire para oxidar, agregan un oxígeno, a las sustancias tóxicas haciéndolas hidrófilicas e impidiendo su capadidad de meterse en las membranas por lo quu pueden ser “lavadas”. Como el O2 puede formar H202 (o agua oxigenada) también es tóxica en grandes cantidades la enzima catalasa la rompe formando agua y O2. El agua queda en el citosol y el O2 es consumido en mitocondrias (para la formación de ATP) y por las enzimas oxidativas del peroxisoma. Las enzimas del peroxisoma entran a él gracias a una etiqueta SKL en su C terminal. Se
hacen en el citoplasma pero un péptido llamado PEX 19 lo reconoce y transporta al peroxisoma donde PEX 16 y PEX 3 ayudan a que entre. 2. Proteínas de mitocondrias A matriz mitocondrial:Las proteínas que están en la matriz mitocondrial son aquellas que poseen un PÉPTIDO DE TRASNITO MITOCONDRIAL N terminal, con aminoácidos hidrofóbicos + algunos aminoácidos cargados positivamente. La proteína que se hizo en el citosol es reconocida por un receptor adyacente a un canal (COMPLEJO DE TOM) de la membrana externa que se desplaza por ella hasta que el canal se encuentra en el mismo lugar de un canal de la membrana interna (COMPLEJO DE TIM). Esto sucede en regiones de la mitcondria donde ambas membranas se tocan. Al estar los canales acoplados (uno abajo del otro) la proteína entra a la matriz sin tocar el espacio intermembrana donde una chaperona la ayuda a plegrse y una peptidasa de la señal mitocondrial corta el péptido de tránsito mitocondrial que es degradado. A espacio intermembrana: Las proteínas del espacio intermembrana deben tener dos péptidos de señal mitocondriales seguidos. Hay dos maneras por las cuales una proteína puede entrar al espacio intermembrana de las mitocondrias. El modelo A o conservativo es por el cual una proteína que ya llego a la matriz, la cual fue plegada y se le cortó el primer péptido de transporte mitocondrial y gracias al segundo, vuelve a pasar por un TIM hacia el espacio intermembrana, donde se le corta de vuelta. El modelo B es por el cual la proteína que d en el espacio intermembrana ya que cuando está pasando por el ensamble de los dos canales, TOM y TIM, estos se separan (antes se le corta el primer péptido de transporte mitocondrial). Una vez en el espacio intermembrana la proteína es plegada y se corta el péptido de transporte mitocondrial. C) PASAJE DE COMPUERTAS1. Núcleo
1. Núcleo Las proteínas entran al núcleo por los poros que tiene la membrana nuclear por lo que no necesitan desplegarse para entrar. Hay tres maneras de que entren al núcleo: 1) Las proteínas del núcleo tiene una etiqueta o “señal de localización nuclear
(NLS) que puede ser una sola seguidilla de aminoácidos con carga positiva en cualquier lugar de la proteína o dos seguidillas de aa con carga positiva separados por otros aminoácidos. 2) Proteínas que no tengan la etiqueta pero que se asocien a una que si la tenga. 3)Si proteínas que entran librementepor difusión simple por los poros se unen a DNA inmovilizándose siguen entrando por difusión ya que adentro habrá menos concentración de proteínas libres que afuera.
Tránsito de vesículas. El tránsito de vesículas en la célula está dirigido por ciertas proteínas de la membrana de la vesícula que dirigen a las vesículas a sus compartimentos blancos basándose en las distintas proteínas de membrana de estos. Estas proteínas de membrana se llaman SNARES, V-SNARE si son de membrana de la vesícula o T-SNARE si son de membrana de los compartimentos blancos y se atraen tan fuertemente que se da una reorganización en los fosfolípidos de sus membranas por lo que se fusionan sin necesidad de una enzima y el contenido de la vesícula pasa al compartimento blanco. Es así como las vesículas que brotan del RE liso poseen V-SNARES que se pegan a los TSNARES del aparato de Golgi cis y las vesículas del aparato de Golgi trans poseen VSNARES que se pegan a los T-SNARES de la membrana plasmática sacando hacia afuera el contenido de la vesícula. Hay fagos que poseen una membrana de lípidos y proteínas llamadas fusogénicas ya que poseen tanto V-snares como T-snares por lo tanto se pueden fusionar con la membrana plasmática y meterse en la célula.
RESUMEN DIRECCIONAMIENTO DE PROTEÍNAS A) SIN TRANSLOCACIÓN NI PASAJE DE COMPUERTAS 1. proteínas del citosol: Proteínas que se hacen en el citosol y no tiene “start transfer” ni entran al núcleo por
difusión pasiva.
B) TRANSLOCACIÓN COTRADUCCIONAL 1. Proteínas de secreción: Proteínas con péptido señal “start transfer” N terminal con sitio de corte para peptidasa.
2. Proteínas de membrana:
Péptido señal “start trasnfer” N terminal con sitio de corte para
peptidasaSecreción
Péptido señal “strat trasnfer” N terminal con sitio de corte p ara peptidasa + péptido señal “stop trasnfer” internoUn paso de membrana con N hacia
afuera y C hacia citosol. (tipo I).
Péptido señal “start transfer” N terminal sin sitio de corte para peptidasa
Proteína de membrana solo con C terminal hacia afuera (sin dominio citosólico) Péptido señal “start trasnfer” interno sin sitio de corte para peptidasaUn paso de membrana con C hacia afuera y N hacia citosol. (tipo II). Péptido señal “start transfer” interno sin sitio de corte para peptidasa+ “stop trasnfer”Dos pasos de membrana con N y C terminales hacia citosol. (si
hay varios start y stop trasnfer alernados cada dos, hay un paso más de membrana).
3. Proteínas de membrana del RE: Proteínas con péptido señal “star transfer” N terminal con sitio de corte de peptidasa + péptido señal “stop transfer” interno + KKXX-C.
4. Proteínas del lumen del RE: Proteínas con péptido señal “start trasnfer” N terminal con sitio de corte para petidasa+ KDEL-C. 5. Proteínas lisosomales: Proteínas con péptido señal “start transfer” N terminal con sitio de reconocimiento de peptidasa + estar glicosiladas en el lumen del RE + agregado de MAN-P en el Golgi trans (+ enzimas extracelulares que agreguen MAN-P si no se le agregaron en el Golgi).
C) TRANSLOCACION POST-TRADUCCIONAL Proteínas secretadas en el citoplasma, es decir sin péptido señal “start transfer”
1. Proteínas de peroxisomas Con una etiqueta SKL-C.
2. Proteínas de mitocondrias Proteinas de matriz mitocondrial: con péptido de tránsito mitocondrial. Proteínas de espacio intermembrana mitocondrial: con dos péptidos de tránsito mitocondrial.
D) CON PASAJE DE COMPUERTAS 1. Proteínas del núcleo:con señal de localización nuclear (NLS), o estar asociadas a proteínas con NLS, o entrar al núcleo por transporte pasivo y pegarse al ADN.
INMUNOLOGÍA El sistema inmune es un sistema complejo de células que se encargan de la defensa del organismo frente a agentes que reconoce como extraños (antígenos). Estás células se localizan en todos los tejidos del cuerpo ya que un antígeno puede aparecerse en cualquier tejido y es por esto que son muchas, tantas que el peso de todas las células del sistema inmune es igual que el del órgano más grande del cuerpo, el cerebro.
Células del sistema inmune Todas las células que circulan en la sangre, que pueden o no tener función imunológica provienen de una misma célula madre llamada TRONCAL PLURIPOTENTE HEMOPOYETICAque se produce en la médula ósea y pasa por distintos procesos de diferenciación para dar lugar a las posibles células hijas. La diferenciación está dirigida por factores de diferenciación que dan señales a la célula para que siga un camino u otro.Las células provenientes de la misma célula madre son: sin función inmunológica, los eritrocitos (células precursoras de glóbulos rojos) y plaquetas, los granulocitos que pueden o no tener función inmunológica y con función inmunológica los macrófagos y linfocitos. LINFOCITOS Estos últimos pueden a la vez diferenciarse en dos tipos, los linfocitos T y los linfocitos B).. Los primeros dan unaA) respuesta inmune celular(la respuesta ocurre en la célula) mientras que los segundos dan B) una respuesta inmune humoral(la respuesta ocurre en el medio acuosa en donde flota la célula. Los tejidos o glándulas del sistema inmune se diferencian en dos grandes grupos:
Tejidos linfáticos primarios: donde se diferencian las células del sistema inmune. (médula ósea y timo) Tejido linfático secundario: donde actúan las células del sistema inmune. (nódulos linfáticos, placa de peyer en el intestino delgado, apéndice, bazo, amígdala, vasos linfáticos)
Diferenciación del linfocito T (pretimocitotimocitolinfocito T) Dentro de la médula ósea (tejido linfático primario), la célula madre sufre ciertos cambios por los cuales pasa a ser otra célula llamada pretimocito. Esta, sale de la médula ósea y entra a una glándula llamada timo (tejido linfático primario) donde se trasnforma, primero en timocitos y luego estos sufren varios pasos de maduración por lo que adquieren las propiedades de los linfocitos T maduros, convirtiéndose finalmente en ellos y pasan a otra glándula (tejido linfático secundario).
Diferenciación del linfocito B (preBlinfocito B) Dentro de la médula ósea, la célula madre se trasnforma en una célula llamada preB, En aves, la preB sale de la médula ósea y entra en una glándula llamada bursa de fabricius (tejido linfático primario de aves) donde finalmente se transforma en linfocitos B y pasan a otra glándula (tejido linfático secundario). Sin embrago, en mamíferos, como no existe bursa de fabricius o ninguna glándula parecida,el preB pasa directamente de la médula ósea al tejido linfático secundario y allí termina de madurar. Como los tejidos linfáticos secundarios están difusos cerca de los demás tejidos de todo el organismo, hay un sistema de circulación específico, además del sanguíneo que los conecta con estos tejidos. Los vasos sanguíneos que no son ni arterias ni venas son los llamados vasos linfáticos por donde en vez de sangre circula una sustancia acuosa, sin globulos rojos, llamada LINFA. (La linfa circula más lento que la sangre ya que está sometida a menos presión, es como tener una manguera (venas y arterias) conectada a la canilla (corazón) a la cual se le hizo dos agujeros y se le puso otra manguera (vasos linfáticos), en esta el agua (linfa) corre con menos presión, más lento). La sangre sale del corazón por las arterias, cuando se choca con una glándula linfática secundario se divide en linfa y sangre normal. La linfa sigue su camino al corazón por vasos linfáticos mientras que la sangre normal lo hace por las venas. LA FUNCIÓN de este mecanismo es, si las glándulas se encuentran antes del tejido en cuestión, los comunica con ellos para que los linfocitos se encarguen de atacar sus infecciones. Si las glándulas están después del tejido, se encargan de retener las bacterias muertas que atacaron al tejido, dándose cuenta y avisando que hay una infección. Además también se encargan de recolectar otros desperdicios que salen del tejido. Tráfico de linfocitos Los linfocitos deben estar en movimiento todo el tiempo, pasando de un tejido a otro o de una glándula linfática a otra. El proceso por el cual una célula puede salir de un tejido y entrar en otro se llama HOMING y lo que hace que esto suceda es una señal. Las señales son proteínas que se encuentran en las paredes internas de los vasos linfáticos que reconocen al linfocito y se adhieren fuertemente a él formando un sistema de moléculas de adhesión a la altura del tejido en el cuál va a entrar haciendo que el linfocito se quede fijo en esa posición. Luego de atravesar la membrana del vaso por un proceso fisicoquímico, el linfocito atraviesa la matriz extracelular y es reconocido por otra proteína de la pared externa del tejido al cuál va a entrar, se adhiere y atraviesa la membrana del tejido entrando finalmente a este (filmina 490).
Los linfocitos se dividen en T y B pero a la vez estos se dividen en otros tipos: Linfocitos Tcitotóxicos: realizan la acción inmunológica helpers: ayudan a la realización de la acción inmunológica Linfocitos B linfocitos: listos para actuar plasmocitos: actuando, es decir, secretando anticuerpos que atacan al antígeno. Cada uno posee proteínas de membrana diferentes pero que realizan las siguientes funcione: 1. Proteínas de reconocimiento del antígeno. En linfocitos T se llaman receptor T o TCR y en linfocitos B se llaman anticuerpos de membrana o inmunoglobulinas (luego secretados por plasmocitos) 2. Proteínas de activación: activan a los linfocitos cuando se detecta un antígeno 3. Proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHCI y MHCII): hacen que el sistema inmune reconozca lo propio como tal (mutado en enfermedades autoinmunes) Al ser algunas de las proteínas propias de cada subgrupo, se las puede utilizar como etiquetas para los distintos linfocitos. Por ejemplo, hay unas proteínas que solo se encuentran en las membranas de los linfocitos T helpers por lo que también se llaman CD4 (CD quiere decir claster definition, o sea, grupo de célula con mismo estadio de diferenciación) y a los linfocitos T citotóxicos se les llamas CD8. MACRÓFAGOS Son células también llamadas monocitos cuando, en vez de estar en el tejido, se encuentran circulando n la sangre cuyas principales funciones son la CAPACIDAD FAGOCÍTICA y la colaboración a los helpers en su función de ayuda a los citotóxicos. Existen dos teorías sobre el funcionamiento del sistema uno. La teoría de la hipótesis intrsuctiva y la TEORÍA DE LA SELECCIÓN CLONAL. La primera, falsa, afirma que todos los linfocitos son capaces de reconocer a cualquier tipo de antígeno mientras que la segunda, afirma correctamente que para cada tipo de antígeno hay un tipo de linfocito capaz de atacarlo debido a que cada subgrupo posee proteínas características para ello. Para llegar a esta conclusión se hizo un experimento sobre un ratón al cual le extirparon todos los linfocitos del sistema inmune y los pasaron por una columna de afinidad en la cual se encontraba fija un cierto antígeno. Los linfocitos que lograron pasar por la columna, es decir los que no se pegaron al antígeno, fueron inyectados en un ratón gemelo al primero (es decir, genéticamente igual) el cual fue previamente irradiado con luz U.V con el fin de anular la respuesta de sus propios linfocitos. Finalmente, le inyectaron al ratón gemelo que poseía solamente los linfocitos que no reconocieron al antígeno fijo en la columna y por lo tanto salieron de ella, el antígeno en cuestión obteniendo como resultado la muerte del
ratón. Se puede concluir entonces que la teoría cierta es la de selección clonal ya que los linfocitos inyectados en el ratón no reconocieron el antígeno. Si fuese cierta la teoría de la hipótesis instructiva, cualquier linfocito podría matar al antígeno y el ratón no habría muerto. Además, como control se efectuaron los siguientes pasos: se inyectaron todos los linfocitos del ratón a su gemelo, es decir también los que reconocen al antígeno, y el ratón vivió. S i hubiese muerto, es porque ninguno de los linfocitos lo reconoció. Se inyectar varios antígenos al ratón gemelo para ver que no solo no reconoce a ese antígeno si no a muchos otros tampoco. Se utilizó otro método de separación de linfocitos a parte de la cromatografía de afinidad para descartar un problema en ella. Es posible trazar un gráfico de la respuesta d anticuerpos relativa en función del tiempo en el cual se puede visualizar cómo funciona el sistema inmune humoral, es decir como los linfocitos B secretan anticuerpos que realizan la acción inmunológica. Si es la primera vez que un antígeno infecta al organismo, es decir que el sistema inmune daría una RESPUESTA PRIMARIA se observa que la respuesta inmune tarda unos diez días en aparecer y disminuye hasta desaparecer a los 40 días. Sin embargo, si el antígeno ya había entrado al organismo, el cuerpo da una RESPUESTA SECUNDARIA donde el anticuerpo reacciona de manera inmediata y con una potencia mucho mayor. Esto sucede con cada tipo de antígeno. (filmina 494) En este hecho se basa la vacunación: se inyecta un antígeno e inducen respuestas primarias para que luego el cuerpo de una respuesta secundaria, más rápida y potente, al infectarse naturalmente con el antígeno. Clones celulares linfocitarios Que un linfocito este maduro quiere decir que es capaz de reconocer un antígeno gracias a que se formó correctamente su proteína que lo reconoce. Se dice que una vez maduro y al encontrarse en reposo el linfocito está virgen. Este linfocito virgen, al reconocer al antígeno se divide dando lugar a muchas células hijas o clones celulares linfocitarios. Cada una de estas hijas si bien tienen la misma proteína de reconocimiento al mismo antígeno que su antecesor pueden diferenciarse en dos grupos: células efectoras (realizan la acción inmunológica) o células de memoria (respuesta secundaria en el caso de una segunda infección). Cada subgrupo que se forma de la célula virgen y a las vez de las diferentes hijas, que también proliferan, se llama claster diferentiation y es posible afirmar que todo clon está compuesto por distintos clasters pero también que todo claster está formado por distintos clones (por ejemplo el CD11 que es el claster de tods las células T).
A) Respuesta inmune humoral Los linfocitos B se encargan de la respuesta inmune humoral, más específicamente los plasmocitos que secretan anticuerpos que ejercen la acción inmunológica contra en antígeno. Los ANTICUERPOS son proteínas que poseen una estructura en bisagra y por
lo tanto pueden reconocer a un antpigeno que se encuentra dos veces en la misma estructura, uno con cada una de sus sitios, o reconocer a un antícuerpo que se enceuntra en una estructura y otro igual en otra. Posee tres cadenas aminoacídicas unidas entre sí por puentes disulfuro llamadas liviana y dos pesadas -que se encuentra a la vez unida también por puentes disulfuro-. Tiene dos sitios idénticos de unión al antígeno que se encuentra en el amino terminal de la cadena liviana y pesada mientras que el el carboxilo terminal se encuentran glicosiladas. Gracias a esta estructura, hay dos tipos de enzimas que cortan a los anticuerpos. La papaína, es una enzima que corta el primer enlace disulfuro de la cadena pesada, es decir en la bisagra, dando lugar a dos fragmentos iguales unidos por otro puente S entre el resto de la pesada y la liviana o Fab, ambos monovalentes, que reconoce al antígeno y un fragmento del resto de la pesada unida por puentes disulfuro llamado FC. La pepsina, corta el segundo enlace disulfuro de la cadena pesada, es decir, debajo de la bisagra, dejando un fragmento divalente unidos por puentes disulfuro donde además la liviana y la pesada están unidas (F(ab)2), y un fragmento FC que al no estar unido por puente disfulfuro se degrada. (filmina 496) Cada anticuerpo tiene una REGIÓN VARIABLE (que reconoce al antígeno y se encuentra hacia el N terminal) y una REGIÓN CONSTANTE (que se encuentra hacia el C terminal)en sus dos cadenas, pesada y liviana. Dentro de la región variable hay una zona llamada hipervariable que le adhiere más especificidad a cada anticuerpo. Esta región es por lo tanto, idéntica en cada tipo de anticuerpo. Sin embargo, la región constante de las cadenas livianas poseen subtipos k o landa que si bien poseen igual función biológica le otorgan un mayor grado de diferenciación al anticuerpo. Por otro lado las cadenas pesadas, que serán idénticas, pueden tener 5 distintos tipos de secuencias con funciones distintas. Cadena pesada Alfa inmunoglobulinas igA
delta igD
Épsilon igE
gama igG
Mu igM
IgA:Es una inmunoglobulina, en general un dímero, que se encuentra en secreciones ya que puede atravesar facilmente la mucosa. IgD:Es predominante en células en reposo y por lo tanto no participa en fases efectoras pero ayuda en losmecanismos de diferenciación de los linfocitos B. IgE: Son reconocidos por granulocitos, células que secretan histamina. La histamina participa en el proceso de dilatación (para que lleguen los linfocitos) y contracción (para que el antígeno no se disperese) de vasos. IgG: es la inmunoglobulina más abundante en el organismo y la principal responsable de la respuesta inmune secundaria (aunque tambi´ne puede participar en la primaria). Estos anticuerpos recubren al antígeno reconociéndolo gracias a su parte variable específica y a la vez, son reconocidos por macrófagos que poseen receptores para la parte FC de todos los anticuerpos IgG que dejaron expuesta. El macrófago invagina a la bacteria favoreciendo su
fagocitosis. A este proceso de inducción de la fagocitosis por los macrófagos que reconoces la parte FC de las inmunoglobulinas IgG se lo llama obsolisación. IgM: estas inmunoglobulinas solamente actúan en la respuesta inmune primaria, por lo tanto se puede afirmar que si se ven solo IgM quiere decir que el antígeno es nuevo. Forma un pentámero que le permite tener diez regiones variables, es decir diez sitios de unión al antígeno (dos por anticuerpo). Realiza la acción inmunológica activando un sistema de complemento que consiste en un conjunto de proteínas inactivas o complejo lítico que circulan por el plasma y se van reclutando entre sí hasta formar un complejo lítico activo capaz de perforar la membrana del antígeno recubierto por los anticuerpos IgM. Existen otro tipo de linfocitos llamados linfocitos K que reconocen y atacan antígenos que ya se encuentran recubiertos por anticuerpos. Estos secretan una sustancia citotóxica que lo daña. Esta acción inmunológica se llama ABCC o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Genética de la diversidad de anticuerpos Las cadenas livianas, iguales entre sí, están formadas por dos dominios, uno constante, producto de un gen que puede ser el gen de kapa o el gen de landa, y otro variable que lleva el sitio de unión al antígeno. Para cada cadena liviana, hay una región variable kapa que interacciona con la región constante kapa y hay una región variable landa que interacciona con la región constante landa. Las cadenas pesadas, iguales entre sí, están conformados por cuatro dominios, tres constantes, producto de un mismo gen con 5 secuencias repetidas, mu, delta, gamma, épsilon y alfa y una región variable que lleva al sitio de unión al antígeno. Para cada cadena pesada hay una misma región variable que puede interactuar con cualquiera de las cinco posibilidades de regiones constantes. Cada anticuerpo está compuesto por dos cadenas livianas, y dos cadenas pesadas que interactúan entre sí por puentes disfulfuro. El gen que codifica para la región variable (V) de las cadenas pesadas está repetido varias veces, al igual que los dos genes que codifican para la región variable kapa y landa de las cadenas livianas. Hay un proceso que comienza durante la maduración de los linfocitos B (en médula ósea, bursa de fabricius) y que se llama RECONMINACIÓN SOMÁTICA en el cuál se elige un gen V y se deletan todos las otras posibilidades seleccionando de esta manera la parte variable que se expresará y por lo tanto, como es en la región variable donde se encuentra el sitio de unión al antígeno, este proceso lleva a la diferenciación del anticuerpo indicando que antígeno reconocerá. En las cadenas livianas, si bien la región constante (C) si codifica para los 110 aminoácidos que posee, la región variable (V) solo codifica para aprox 90 aa y necesita entonces de una región J, entre la V y la C que codifica los 20 aa restantes de la región variable. Es por esto
que se deben seleccionar un V, de los muchos que hay, y un J , entre 5 y 10, para dar lugar a una región variable de 110 aa de manera totalmente azarosa, lo que incrementa la variabilidad. En este proceso, enzimas recombinasas cortan secuencias consenso río arriba delos J y río debajo de los V y se seleccionan dos que se unirán, por lo que todo lo que se encuentra entre estos dos se deleta. Como cada V posee un promotor propio, todo lo que queda río arriba del V seleccionado no se transcribe y los J río abajo del J seleccionado se remueven por splicing. Por lo tanto, el RNA maduro y luego la proteína resulta tener una región V y una región J que en conjunto hacen 110 aa de la región variable y una región C que son los 110aa de la región constante. Como la secuencia consenso que reconoce la recombinasa no es muy estricta la enzima puede correrse unos cuantos nucleótidos río abajo o río arriba aumentando la tasa de variabilidad pero a la vez disminuyendo al tasa de efectividad debido al resultado posible de secuencias abortivas que no se pueden expresar correctamente. Se puede hacer recopilando toda esta información un cálculo de la variabilidad que se da gracias a la recombinación somática de las cadenas livianas. En Kapa este esquema se encuentra repetido dos veces en el genoma, dos alelos, uno derivado de cada cromosoma. Sin embargo la recombinación solo sucede en un alelo, si sale bien en ese no se hace en el otro, esto se llama exclusión alélica. Por otro lado, en Landa este esquema se encuentra repetido 12 veces, 6 en cada alelo pero de todas maneras la recombinación se produce en uno solo. La cadena pesada además de tener genes con porciones codificantes V y J poseen otra región génica D que codifica para 13 aa y se encuentra entre V, que codifica para 74 aa y J que codifica para 13aa. Esto, aumenta la variabilidad ya que se puede dar una unión entre 80 V, 6J y 50D además de dos veces la posibilidad de que se corra la recombinasa. En esta cadena hay también exclusión alélica, es decir que si sucede en un alelo no sucede en el otro. Si se suman todas los factores de variabilidad: las dos posibles cadenas livianas (k y l) y de la cadena pesada + combinación entre la liviana y la pesada al armarse el anticuerpo + mutaciones somáticas (muy probables ya que son proteínas que se recombinan y dividen mucho)= de unos pocos genes se pueden producir 18 billones de anticuerpos distintos. La primera recombinación somatica se produce en la médula ósea cuando la célula madre se diferencia en pre B y siempre la primera es la de la cadena pesada. Esto es así ya que esta es la más “difícil” ya que posee mas chances de error por haber más opciones de unión
(además de J hay D y hay 5 posibilidades de C). Si la recombinación de la cadena pesada sale bien en un alelo, no se hace en el otro por exclusión alélica, si sale mal, es decir si tiene como producto una secuencia no codificante, en un uno se intenta en el otro y sisale mal en los dos el pre B nunca podrá madurar y ser linfocito B por lo que se enciendde una señal de apostosis celular y la célula muere. Que la reconmibnacón en la cadena pesada sea
exitosa garantiza casi en un 100% que la recombinación en la cadena liviana a va a ser exitosa también. En un primer lugar se realiza la recombinación en la cadena kapa y otra vez, si sae bien en un alelo no se hará en el otro y si sale mal en uno se prueba en el otro. Si en ninguno de los dos kapa fue posible una correcta recombinación, se hace la cadena liviana landa que posee 12 posibilidades de hacer correctamente la recombinación, 6 de un alelo y 6 del otro donde de todas maneras solo uno estará recombinado. Es decir, en total hay 14 posibilidades de recombinar la cadena liviana. Cabe aclarar que este proceso sucede con las dos livianas y las dos pesadas que coforman al anticuerpo. En resumen: 1. Recombinación de la cadena pesada con 2 posibilidades 2. Recombinación de la cadena kapa o cadena landa (si la kapa sale mal) con 14 posibilidades. Al hacerse correctamente la recombinación somática de la cadena pesada se expresa una cadena mu que al expresarse termina dando una célula B inmadura con IgM de membrana. Esta es la señal que avisa que la recombinación de la pesada fue exitosa y se puede proseguir con la recombinación de la liviana. El segundo paso que determina la maduración de la célula B es la coexpresión de IgM con IgD, ambos de membrana y es el ÚNICO caso en el que dos cadenas pesadas se expresan al mismo tiempo. Esta célula B virgen preparada para reconocer al antígeno prolifera en plasmocitos o células B de memoria. Cada plasmocito en presencia de antígno nuevo secreta un anticuerpo con UN SOLO TIPO DE CADENA PESADA, o IgM o igA o IgG o IgE pero NUNCA igD, en células B de memoria se hacen IgA o IgG o IgE pero NUNCA ni IgD ni IgM (que es solo para respuesta primaria) y que quedan en membrana. 1. Coexpresión de IgM e IgD en membrana de linfocito B: El gen de la cadena pesada posee para cada región constante cinco secuencias posibles que se encuentran en el siguiente orden de río arriba a río abajo: Cmu, Cdelta, Cgamma, Cepsilon y Calfa todas río abajo de las regiones V, D y J. La región génica donde se enceuntra cada uno se llama casillero y cada casillero posee dos señales y sitio de corte y poliadelinación (ya que si no tuviese solo se haría Cmu). Se hace hasta el Cgamma y por lo tanto se expresa Cmu y Cgamma ya que los sitios de corte y poli A del Cmu se encuentran inacivados, hay POLIADELINACIÓN ALTERNATIVA, y por lo tanto se transcribe hasta el segundo sitio de corte y poliA que resulta ser el de Cgamma. Luego, por SPLICING ALTERNATIVO se produce un ARNm con Cmu que codifica un IgM y otro ARNm con Cgamma que codifica un IgD. 2. Porque una célula B madura prolifera a plasmocito y porque a de memoria: Al haber dos sitios de poliadelinacion por POLIADELINACIÓN DIFERENCIAL pueden hacerse dos transcriptos distintso, uno más largo o uno más corto. El más largo se da porque por splicing se deleciona el primer sitio de corte y poli A para usar el segundo que incluye un extremo C terminal hidrofóbico que hace que se ancle a
membrana. Estos son los que hacen células de memoria y que si además poseen splicing alternativo se encuentran en células B madura (con IgM e IgD). El corto que termina antes del consenso aceptor y por lo tanto no sufre splicing posee un C terminal hidrofílico y por lo tanto es de secreción. Estos son los que hacen plasmocitos. 3. Como pasa de IgM y IgD a los demás posibles regiones constantes: Por un proceso llamado SWITCH DE CLASE. Bajo el estímulo de antígeno, es decir una vez que ya se seleccionó la variable y se tiene un linfocito B virgen que proliferó, para dar lugar a las células hijas (palsmocitos y de memoria) el DNA se selecciona nuevamente pero solo a nivel de la región constante (la variable sigue iual). Se selecciona un casillero y se deletan los que se encuentran río arriba de este. Una célula de memoria nunca puede tener ni Igm ni IgD ya que la enzima que corta el ADN tiene sitio de corte río debajo de Cmu y Cdelta. Es por esto que IgD nunca hace anticuerpo e IgM está presente siempre y solamente en la respuesta primaria. Una célula de memoria que posee Cgamma puede hacer hijas IgG, IgE y IgA (porque también posee Cepsilon y Calfa río abajo) mientras que una célula de memoria que posee Cepsilon puede dar lugar a hias IgE y IgA (porque también posee Calfa) y una célula de memoria que posee Calfa solo puede hacer hijas IgA ya que solo posee esta información. RECONOCIMIENTO DEL ANTÍGENO Como ya dije, los linfocitos B poseen inmunoglobulinas en su membrana que reconocen al antígeno. Estos receptores se llaman BCR. A su vez, los linfocitos T poseen en sus membranas receptores llamados TCR que son incapaces de reconocer al antígeno por si solos y para ello necesitan células presentadoras de antígenos (APC) que le informen de la llegada del patógeno. Hay dos vías de presentación antigénica:
La vía exógena (el patógeno viene de afuera de la célula): La APC del linfocito T helper son células que poseen MHC II y en general es una célula llamada macrófago. El macrófago fagocita al patógeno haciéndolo entrar a la célula en una vesícula o endosoma donde hay un procesamiento antígenica que degrada parcialmente al patógeno. Luego van al lisosoma y puede que sea los pedazos de antígeno sean degradados completamente allí pero si no sale nuevamente en endosomas. A estos, se les fusiona una vesícula que contiene MHC II, proteína de membrana que se hizo en el lumen del RER y salió por una vesícula del aparato de Golgi trans. Una vez fusionadas las vesícula que lleva al antígeno y al MHC II es anclada en la membrana del macrófago donde el TCR del linfocito T helper puede reconocerlo (los Thelper solo reconocen antígeno si está unido a MHC II). La vía endógena: Las células que funcionan como APC de los linfocitos T citotóxicos son aquellas que poseen MHC I, es decir todas las células con núcleo del
organismo. Hay proteínas nativas de la célula que por distintas razones (por ejemplo si están mal plegadas) son degradadas por un complejo llamado proteasoma que da como resultado varios péptidos más pequeños. En la membrana del RER hay dos proteínas de membrana que funcionan como bombas, llamdas TAP 1 y TAP 2 que meten a estos péptidos dentro del lumen donde se enceuntra MHC I, una proteína de membrana. Estos péptidos se cargan con MHC I y salen del retículo endoplasático hasta llegar y anclarse a la membrana plasmática donde el TCR del linfocito T citotóxico lo reconoce. Si la proteína reconocida por el proteasoma no es nativa sino es una proteína proveniente de un virus que entró a la célula, el TCR que gracias a que está con MHC I puede reconocerla y enterarse de la presencia del virus y poder atacarlo. El propio linfocito T citotóxico es el que hace la acción secretando moléculas que agujerean la membrana de la célula infectada y mandando una señal de apostósis. Es decir, el Tcitotóxico mara a la célula infectada para que no prolifere. Como lo necesario para que un linfocito Tcitotóxico reconozca a un antígeno es la presencia de MHC I y dado que todas las células con núcleo la poseen, son todas estas las que pueden funcionar como APC. ACTVACIÓN A la fase de reconocimiento del antígeno le sigue la fase de ACTIVACIÓN del linfocito T helper. Al reconocer al antígeno, el Thelper secreta unas proteínas llamadas interleuquinas (I-L) que funcionan como señales de activación entre linfocitos. Cabe aclarar que hay dos tipos de Thelpers que se diferencian según las interleuquinas que secretan. 1. Los TH1: secretan I-L2 y a su vez receptores IL-2 que se alojan en su membrana y reconocen la IL-2 que ellos mismos secretaron que contiene una señal de proliferación que hace que los TH1 proliferen. No obstante, la IL-2 secretada no es utilizada solamente por el mismo TH1 que la formó sino por otros TH1 y por Tcitotoxicos que si o si deben poseer receptores de IL-2 y solo lo tienen los que ya saben de la existencia del antígeno. Estos linfocitos que reconocieron la IL-2 recibieron la señal y por lo tanto proliferan. La señal que la célula se dio a si misma es una señal autocrina mientras que la señal que le dio a los demás Thelpers 1 y Tcitotóxicos cercanos es una señal paracrina. Los TH1 son entonces los Thelpers que colaboran con el sistema inmune celular (proliferación de linfocitos T). 2. Los TH2: secretan I-L4 y I-L5. Los linfocitos que poseen receptors de I-L4 y I-L5 son los linfocitos B que no necesitan presentación previa del antígeno sino que lo reconocen gracias a sus inmunoglobulinas de membrana. Solo los linfocitos B que reconocieron al antígeno son los que poseen receptroes I-L4 y I-L5 y por lo tanto reciben la señal de I-L4, de proliferación, y la señal I-L5 de diferenciación . Los TH2 son entonces Thelpers que colaboran con el sistema inmune humoral (proliferación y diferenciación de linfocitos B).
Los Thelpers se diferencian en 1 o 2 una vez que el macrófago (o el APC que sea) le presenta al antígeno. Antes de reconocerlo se encuentra en reposo y es un TH0, una vez que lo reconoció se activa y diferencia, secretando I-L2 si es TH1 para colaborar con la proliferación de otros linfocitos T o secretnado I-L4 y IL-5 colaborando con al proliferación de linfocitos B. Esta diferenciación se da debido a tres razones: 1) La expresión de factor de transcripción. Si se expresa el F.T de TH1 llamado “Tbet” se da genotipoTH1 y si se expresa el F.T de TH2 llamado “gataB” se da genotipo TH2. 2) La interleuquina presente. La I-L1 promueve el TH1 e inhibe el TH2 mientras que la I-L4 promueve el TH2 e inhibe el TH1. Es decir que la célula se polariza hacia uno u otro genotipo. 3) Dependiendo el patógeno. Hay patógenos que son atacados por la respuesta celular, es decir necesitan genotipo TH1 y otros que son atacados por la respuesta humoral, necesitan genotipo TH2.Además, esto cambia según el indiviuo, contra un mismo antígeno un individuo expresa respuesta de TH1 y otro repsuesta de TH2. LINFOCITOS B COMO APC Los linfocitos B pueden actuar como APC. Reconocen al antígeno a través de sus inmunoglobulinas de membrana y lo endocitan. Al endosoma que contiene al antígeno se le fusiona una vesícula que contiene MHC II y van a la membrana palsmática el linfocito B donde el antígeno puede ser reconocido por el TCR del linfocito Thelper. Este, que el TH2 se activa y secreta I-L4 y I-L5 que es reconocido por los receptores de I-L4 y I-L5 del linfocito B (el que hizo de APC o/y otros (que si o si hayan visto al antígeno y posean receptores) recibieindo la señal de proliferación. De esta manera, ambas células, linfocito B y linfocito TH2 colaboran entre sí. COACTIVACIÓN Toda célula inmune necesita para activarse además de una primera señal de reconcoieminto del antígeno (que se le sea presentado si es un linfocito T) una segunda señal de coactivación. En el caso de los linfocitos TH1 que reconocen al antígeno solo si un macrófago (u otro APC) se los presenta, necesitan como coactivador I-L1 que es secretada por el mismo macrófago y potencia la activación del TH1. Además, el mismo TH1 activo secreta una proteína llamada interferón gamma que estimula al macrófago para que siga secretando IL1. Este proceso es de feedback positivo ya que cuanto más TH1 activo, más interferón gamma y más IL-1 que activa al TH1. En el caso de los linfocitos TH2 que reconocen al antígeno gracias a un linfocito B que actúa como APC, necesitan como activador B7, una proteína de membrana del linfocito B que es reconocida por un receptor CD28 del helper y actúa de la misma manera que el I-L1.
Esta señal de coactivación es necesaria ya que el enhancer del gen de I-L2 posee dos sitios de respuesta: uno que responde al CD3 (explicado más adelante) y uno que responde al B7 (si es TH2) o al I-L1 (si es TH1). Otras proteínas necesarias Para linfocito T helper:
CD40: Una proteína que secreta el linfocito B llamada C40 cuyo receptor se enceuntra en el TH2 y sin el cual no habría switch de clase al proliferar. CD4 y moléculas de adhesión:Hay moléculas que ayudan a que la unión entre el TCR y el MHC II sea lo suficientemente estable como para que el TCR reconozca al antígeno estabilizando al complejo. Entre ellas se encuentra CD4 en la membrana del helper y las otras moléculas trabajan de a par, una en el linfocito T y otra en el APC. CD3: Cerca del TCR se encuentra una proteína llamada CD3 que cambia conformacionalmente debido al cambio conformacional que sufre el TCR al reconcoer al antígeno. El cambio del CD3 es en efecto la señal de activación ya que produce señal hacia adentro de la célula T disparando la secreción de Il-2 que a su vez da la señal de proliferación, y diferenciación, a ella misma y a todas las células T con receptor de I-L2 (es decor todas las que vieron al antígeno).
Para linfocito T citotóxico: Es lo mismo pero la señal de coactivación es B7 y en vez de ser CD4 la molécula que estabiliza el complejo TCR-antígeno-MHC es CD8. De allí el nombre CD8 a los T citotóxicos y CD4 a los T helpers.
BARRERAS DE DEFENSA La primer barrera de defensa contra un patógeno es la piel y las mucosas. Si se rompe esta barrera y el patógeno entra al cuerpo aparece el macrófago que lo fagocita y trata de destruirlo en el lisosoma. Esta respuesta se llama RESPUESTA INMUNE INNATA y también posee cierta especificdad. Las células fagocitarias (dendríticas, fijas bajo la piel malos fagocitadores pero muy buenos presenadores, macrófago, buenos fagocitadores y presentadores, y neutrócilos, buenos fagocitadores pero no preentan) secretan interleuquina, lo que produce la inflamación, y tienen receptores de distintos antígenos TLR. Es decir la respuesta inmune innata presentan especificidad pero no tan alta como los TCR, no reconocen un antígeno en especial pero si reconocen patrones moleculares del patógeno. Por ejemplo, TLR 4 reconoce bacterias, TLR5 reconoce hongos y TLR2 reconoce RNA
con alta carga de C-G, o sea, virus. Sin embargo, si esta respuesta no es suficiente se pasa a activar la RESPUESTA INMUNE ADQUIRIDA (linfocitos T y B).
DECLINAIÓN DE LA ACIVIDAD DEL SISTEMA INMUNE. El sistema inmune detiene su acción en la fase homostática en donde se retoma el equilibrio de la célula antes de la llegada del antígeno mediante una actividad regulatorio. Además de diferenciarse en TH1 y TH2, los Thelpers también se diferencian en TH17 y Treguatorio. Este último sintetiza interleuquinas cuya función es la de detener la expresión génetica de linfocitos, es decir suprimir la proliferación. También ayuda en macrófago, que además de secretar I-L1, secreta, en determinados momentos, I-LRA que se adhiere al receptor de I-L1 del TH1 e impide que este ultimo la reciba y por lo tanto parando la secreción de I-L 2 y con ella la proliferación. Es decir, LAS PROPIAS CÉLULAS INMUNES REGULAN EL SISTEMA. Ademáss del sistema neuronal endocrino que secreta hormonas glucocorticoides que frenan la actividad del sistema inmune. Como su actividad produce inflamación, cuando el macrófago secreta mucha interleuquina, o fibere, causada por la IL1, se recetan corticoides que frenan la respuesta inmune. Naturalmente, este medicamento no puede ser ingerido crónicamente ya que el individuo no presentaría actividad inmunológica.
RECONOCIMIENO DE LO PROPIO: “sistema de aprendizaje” Es en el Timo que los timocitos, futuros linfocitos T, se recombinan y diferencian armando sus TCR definitivo. Si se arma mal la célula emite una señal de apostósis y muere. A esto se le llama selección negativa. Por otro lado, las linfocitos con TCR bien formados prosiguen pero sus TCR pueden reconocer y llevar al linfocito a actuar contra un antígeno exógeno o contra lo propio. Para que lo segundo no pase, ya que sería muy peligroso poruqe el sistema inmune mataria células del propio individuo, hay una selección positiva por lo que las células que poseen TCR contra lo propio son eliminadas. Esto se da gracias a que en el Timo hay una célula que expresa absolutamente todas las proteínas del genoma del individuo y por lo tanto los linfocitos que pasan por allí y que tienen un TCR que reconoce a lo propio, reconoce alguna de las proteínas que secreta esta célula y al reconocerlo se activa una señal de apostósis contra el mismo linfocito. Para las células B este proceso de eliminación del linfocito que reconoce lo propio no es tan importante ya que si o si un linfocito B necesita un linfocito Thelper que colabore con el (dándole I-L4 y I-L5) para activarse. De todas maneras, ciertos linfocitos T escapan del sistema de aprendizaje y salen del Timo como linfocitos T maduros con TCR que reconocen a lo propio. Esto podría ser muy
peligroso para el organismo si no fuese que en los tejidos inmunes periféricos anergizan (le quitan energía) a estos linfocitos cuando se activan (cuando quieren atacar a algo propio) y entonces quedan en reposo y no actúan. Las enfermedades autoinmunes se dan porque: los linfocitos anergizados lograron despertar. Hubo una infección muy grande cuyor antígenos tienen mimetismo molecular con proteínas propias entonces el sistema inmune ataca lo propio también. Si un individuo tiene muchas proteínas similares al antígeno que ingresó. RECHAZO AL TRANSPLANTE Como los MHC I de cada individuo si bien son iguales entre si pero distintos a los MHC I de otro individuo, lo linfocitos T citotóxicos que los reconocen actúan en el rechazo a transplante: si reconocen un MHC I como no propio, lo rechazan. Se dice entonces que no hubo histocompatibilidad entre el donante y el aceptor. Antes del trasnplante se hacen experimentos para asegurar que el tejido donado no será rechazado por el aceptor: 1. Testeo genético: se testea cuan parecidas son las secuencias de MHC I del aceptor y del donante. 2. Prueba de laboratorio: se saca sangre del aceptor y del donante de la cual se purifican los linfocitos T citotóxicos de ambos. Se irradian los linfocitos Tc del donante con luz ultravioleta para inactivarlos y se hace un cultivo mixto linfocitario con los lnfocitos Tc del donante, inactivos y que fueron marcados con radioactiviad y los linfocitos Tc del aceptor. Luego se mide la proliferación celular de acuerdod a la cantidad de radioactividad presente: si los Tc del aceptor reconocieron a los Tc del dador como patógenos entonces rompieron su membrana liberando la radioactividad. 3. Corticoides: a los pacientes aceptores se los medico con corticoides antes del trasplante para disminuir la actividad del sistema inmune, es decir el rechazo. Es importante entender que la respuesta inmune celular puede ser policlonal. Esto quiere decir que muchos linfocitos T (clones) pueden reconocer a un mismo patógeno ya que la APC lo fagocita entero pero se corta en el endosoma y luego cuando llega a membrana, junto al MHC, se ve un sitio antígenico de ese patógeno que es reconocido por un clon, pero puede que otro sitio antigénico del mismo patógeno sea reconocido por otro clon. Esto no quita especificidad peor aumenta la capacidad de respuesta. Por otro lado, la espuesta inmune humoral es siempre policlonal ya que los linfocitos B reconocen al patógeno por medio de sus anticuerpos de membrana y por lo tanto muchos clones pueden reconocer distintos sitios antígenicos. Como herramienta de laboratorio se produjeron anticuerpos monoclonales (que no existen naturalmente). El método consiste en diluir seriadamente una cepa de linfocitos hasta que
quede solamente uno que es fusionado con una célula tumoral, es decir que crece indefinidamene y nunca muere. De esta manera, obtengo muchos linfocitos de este único clon que reconoce solo un sitio antigénico, es decir es monoclonal.
TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES El conjunto de cambios inducido por el ambiente se da por la transducción de una o varias señales. La transducción es el proceso por el cual las células procesan señales del ambiente en el que se encuentran. Si este procesamiento falla puede derivar en una patología. El sistema de comunicación puede darse por el sistema endócrino, por el cual una célula endocrina secreta una proteína, la señal, que viaja por la corriente sanguínea y sale para ser reconocida por un receptor de otra célula. El sistema paracrino por el cual una célula paracrina secreta una señal que es captada por receptores de células cercanas (no va a la corriente sanguínea). El sistema neuronal o sinapsis por el cual la punta de la neurona libera señales y es ahí donde se encuentran los receptores de otras células. También puede pasar que si la señal no es difusible pase por contacto de la célula que la contiene y la que tiene el receptor.
Sistema de transducción de señales El sistema por el cual se transducen las señales exteriores es un camino lineal que va desde el exterior hasta el interior de la célula. El primer paso es el reconocimiento de la señal por un receptor que se encuentra en la membrana de la célula, el cual modifica su conformación y por lo tanto se hace afin a ciertas proteínas del citosol. A la vez, estas proteínas que ahora se unen al receptor cambian su conformación, se hacen afines a otras proteínas más adentro de la célula a las cuales puede unirse luego de disociarse del receptor y así sucesivamente. Esta moléculas señalizadoras o INTERRUPTORES MOLECULARES son las que van pasando la señal a lo largo de la célula gracias a este juego de adherirse a otra y cambiar su conformación para hacerse afin a otro tipo de proteína. Finalmente, la última proteína que cambio la conformación activa las moléculas efectoras que hacen la respuesta. Las moléculas efectoras pueden ser enzimas, que frente a la llegada de la señal se activan y dan un producto que antes no daban, proteínas del citoesqueleto que se modifican en función de las señales o factores de transcripción que frente a una señal se activan y por ende activan la expresión de cierto gen produciendo nuevas proteínas. De todas estas maneras, frente la llegada de una señal, la célula presenta propiedades nuevas y se comporta de manera diferente. Se puede decir que los INTERRUPTORES MOLECULARES osilan entre la conformación activa e inactiva ya que hay un quilibrio entre ellas que es invertido con la
llegada de la señal. Sin señal hay más proteínas inactivas que activas pero con señal hay más proteínas activas que activas (se cmabia el sentido del equilibrio). Cuando el interruptor pasó la señal vulve a estar en su conformación inactiva, donde el quilibrio se encuentre hacia las inactivas. Hay dos maneras de que oscilen los interruptores: 1. Por carga de GTP: Son las llamadas proteínas G que se enceuntran inactivas si están cargadas con GDP y se activan al liberar el GDP para tener espacio y que llegue un GTP que cambia su conformación. Al contrario, para inactivarse el mismo GTP que contiene se hidroliza y pierde un fosfato convirtiéndose en GDP. Esta activación no implica un cambio postraduccional de la proteína interruptor. La proteína que recibe la señal activa el interruptores se llama GEF y la que inactiva el interruptor se llama GAP. 2. Por fosforilación: Son interruptores que se encuentran inactivos si no están fosforilados y se activan por la unión del último fosfato de ATP a una Serina Tirosina o Trionina del interruptor. De esta manera, le agrega una carga negativa y cambia su conformación. Para inactivarse se le tiene que salir ese fosfato. Se puede afirmar entonces que esta activación implica un cambio postraduccional de la proteína. Si el estado fosforilado es el activo, la enzima kinasa (que fosforila) activa al interruptor y la enzima fosfatasa (quita el fosfato) lo inactiva. Si, al contrario, el estado no fosforilado es el activo, la fosfata activa al interruptor y la kinasa lo inactiva. También hay señales que poseen receptores citosólicos, y no de membrana, por lo que tienen que entrar a la célula atravezando la membrana y encontrarse con el receptor. A su evz el mismo receptor es un factor de trasncripcón que se activa al estar adosado a la señal e induce la transcripción.
Oncogenes Un oncogén es una proteína interruptor mutada de modo que se encuentra constitutivamente activa y por lo tanto activa constitutivamente a las demás interruptores y activa constitutivamente a la molécula efectora. Si esta última es un factor de transcripción y la señal dada era un factor de crecimiento, la mutación produce la expresión constitutiva de un gen de proliferación por lo que la célula se dividirá constitutivamente. Esto quiere decir que ya no funciona la regulación de la señal, y si sucede in vivo las células que se dividen todos el tiempo pueden interferir en tejidos sanos produciendo cáncer. Un tumor se forma por lo tanto, por células que creciendo descontroladamente. Cabe aclarar que los tumores pueden ser benignos o malignos. Un tumor benigno es aquel en el cual sus células crecieron de manera compactada por lo que no se dispersan afectando a otros tejidos. Al
contrario un tumor maligno es aquel que tiene células separadas que pueden viajar a otros tejidos y meterse entre sus células haciendo un tumor en otra parte del cuerpo. Este proceso de autoproducción de cáncer se llama metástasis. Mecanismos de activación de oncogenes
Mutación puntual en proteínas ras Si una proteína muta en su serina tripsina o tiropsina de su posición 12 y 61 por una proteína cargada negativamente (como si tuviese un GTP) se vuelve activa consitutivamente. Esta mutación se llama fosfomimética. Deleción Si a una proteína se le deleciona la parte del receptor que reconoce a la señal la otra parte está constitutivamente activa. Amplificación génica Si muta el promoto de una proteína normal por lo que se sobreexpresa, como el estado de actividad-inactividad se encuentra en equilibrio, y auqnue estén inactivas hay un porcentaje basal de activas, el basal de la sobreexpresada será mayor al de las demás y por lo tanto podrá activar las siguientes constitutivamente. Translocación 1) Si la parte codificante de la proteína normal se pone río debajo de un promotor fuerte, se sobrexpresa. 2) Si se fusionan partes codificantes de dos proteínas distintas y si el promotor de una es fuerte se sobrexpresa la proteína hibrida. Puede pasar también que la presencia de una proteína, aumente la concentración de la otra. De las dos maneras, estará sorexpresada.
Todos los mecanismos de encendido y apagado de cambios inducidos por señales deben estar regulados ya que si fallan puede haber formación de tumores. La transformación en células eucariotas es el pasaje de una célula normal a una transformada gracias a un oncogén y esto sucede cuando hay perdida de ciertas proteínas APC, DDC, P53 llamdas genes supresores de tumores ya que controlan de forma negativa la proliferación y si hay perdida de los mismos, hay tumor. Fallas o mutaciones dadas en genes que activan la proliferación favorecen la formación de un tumor si son mutaciones que producen ganancia de funciones. Aunque pasa en un solo alelo igual hay proteína constitutivamente activa, es decir la mutación en genes activadores de la proliferación es dominante. Por otro lado, mutaciones dadas en genes que inactivan la proliferación favorecen la formación de tumores si son mutaciones que producen perdida de función. Es posible afirmar entonces que todas las moléculas que participan en el camino de proliferación son potenciales oncogenes. Estas proteínas son funcionales solo si ambos alelos están mutados, es decir la mutación en genes supresores de tumores es recesiva.
En el laboratorio, es posible obtener células transformadas a partir de células normales. SI se extrae un cultivo primario de células de un ratón y se plaquean, luego de un tiempo solo unas pocas sobreviven y estas son las que poseían una mutación que les permitió prolifera más. A estas que quedaron las plaqueo en otra placa y cuando crecen, agarro algunas y las vuelvo a plaquearlas en otra y así sucesivamente para formar lo que se llama una línea celular que puedo congelar inmortalizándolas y descongelarlas cuando las necesito (son todas clones). Si se transfectan las células con plásmidos que contienen oncogenes estos impulsarán el cambion celular a estas células que sobrevivieron porque eran tenían mutaciones y por lo tanto eran propenses a transformarse. De esta manera, en la placa puedo ver como las células normales, que aunque tenían alguna mutación no se les metió el plásmido entonces no se transformaron (la transformación se da cuando se acumulan muchas mutaciones) dejan de crecer ya que poseen inhibición de crecimiento por contacto (cuando hay un número tan grande de colonias que se tocan entre sí y con las paredes de la placa dejan de crecer) pero también hay células mutadas y transformadas gracias al oncogén del plásmido que reconozco ya que no presentan inhibición por contacto y siguen creciendo, una arriba de la otra apiladas formando lo que se llama FOCO DE TRANSFORMACIÓN. De esta forma puedo separar células normales de células transformadas que si plaqueo y las hago crecer en otra placa y luego se inyectan en un ratón sano formaran un tumor y posiblemente harán metástasis. Si transfecto dos plásmidos, uno A y uno B para comprobar cual de los dos tenia un oncogén puede hacer un western blot de las células transfectadas y el que de una banda más gruesa será el que tiene el oncogén ya que la proteína se verá sobreexpresada. Tabién es necesario realizar un control negativo transfectando con plásmidos vacios esperando que las células no se transformen para asegurarnos de que no estaban previamente transformadas en el ratón. Hay un procedimiento de laboratorio para identificar cual es el gen que produce la transformación. Consiste en la extracción de DNA de células de un tumor entre las cuales hay células trasnformadas pero también células con unas pocas mutaciones. Ambos tipos de células pasan a ser incubados con una línea celular con el fin de que estas últimas sean transfectadas con el DNA tumoral. En la placa vemos que las células que incorporaron el DNA con unas pocas mutaciones y las que no incorporaron crecen pero se frenan por inhibición por contacto mientras que las células que incorporaron el DNA transformado se transformaron. Para evitar transformaciones espontáneas se realiza una segunda transfección con las células transformadas identificadas porque están en el foco que tienen DNA de ratón normal y DNA de humano trasnformada (que esta en un porcentaje mucho menor), que se incuba separado, con la línea celular anterior de ratón. EN la placa vemos células que incorporaron el DNA normal de ratón y las que no incorporaron nada que frenan su crecimiento por inhibición por contacto y células que incorporaron el ADN humano transformado y por lo tanto se transformaron y formaron un foco. Para averiguar
que gen humano es el trasnformado se toman células del foco y se les extrae el ADN para formar una biblioteca de DNA genómico. Plaqueo vectores de clonado con este ADN en bacterias que crecen multiplicando el plásmido. Como unas pocas poseen el plásmido con DNA transformado se usa como sonda una secuencia llamada “ALU” que solo se encuentra en el genoma humano (ni de plásmido, ni de bacteria, ni de ratón) que por lo tanto marca al gen transformado que finalmente puedo secuenciar. En general estos genes codifican proteínas influyentes en el camino de proliferación. Puede pasar que en vez de ser un gen humano el que se incubo con la línea celular de ratón fueron dos genes humanos entonces para averiguar cuál es el oncogén que produce la trasnformación se separan y se hace cDNA de ambos que se meten en plásmidos que se plaquean y veo cual hace foco de trasnformación. Los plásmidos que hacen, son los que poseen al oncogén. Si ambos hacen es porque ambos eran oncogenes. En la placa de petri, al tocar el fondo las células, de forma redondeada, se desparraman sobre el pero al dividirse en el proceso de mitosis vuelven a su forma original para luego volver a desparramarse. El pasaje de células a otra placa se llama TRIPTINIZACIÓN y conssite en la ruptura de proteínas con el fin de despegarlas del fondo y poder pasarlas a otro cultivo. Como vimos, los tipos de cultivo pueden ser el cultivo primario, una cepa celular y ua línea celular.
CICLO CELULAR El ciclo celular posee dos fases, una de división celular M, corta, y una interfase más larga en la cual la célula se prepara para dividirse que a la vez posee una fase llamada G1, una fase de duplicación de ADN o S y una fase G2. Este proceso es unidimensional, es decir no reversible, y posee varios ckeckpoints evolutivamente seleccionado donde la célula constata si los procesos y el ambiente en el cual se encuentra son correctos. En G1 se chequea el crecimiento de la célula (si es lo suficientemente grande) y si el ambiente es favorable, luego comienza la fase S y al finalizar la fase G2 se chequea otra vez si el crecimiento y el ambiente son favorables y además si el DNA se replicó bien, es allí donde comienza la fase M y al terminarla se chequea la maquinaria de mitosis (si están los cromosomas alineados). Existe también un G0 pero que es un caso particular de G1 en el cual la célula se encuentra pausada pero luego retoma su camino. El tiempo de división celular depende de cada célula. Por ejemplo, células humanas en cultivo se dividen cada 24 horas. Al inyectar citoplasma de células en fase M a otra célula, se ve como los ovocitos de la célula receptora entran también en fase M, cosa que no pasa si se inyecta citoplasma de
célula en interfase. Esto permite concluir que hay ciertas proteínas llamas MPF que son factores que promueven la entrada a la fase M (M-phase promoting factors). Si se mide la actividad de proteínas ciclinas durante el ciclo celular se ve que su actividad es oscilante (hay tanto en interfase como en M) y posee máximos en la fase M, es decir que concuerda con los máximos de actividad de la MPF (que solo hay en M). También se ve que hay actividad de proteínas kinasa cuya concentración es constante en todas las fases pero su actividad depende de la ciclinas (sigue el ciclo de las ciclinas) y por eso se llaman kinasas dependientes de ciclinas. Entonces, se puede concluir que para promover el ciclo celular son necesarias las ciclinas y las kinasas dependientes de ciclinas. Hay proteínas cuya activación se regula mediante fosforilación de algunos de sus aminoacidos y desfoforilación de otros por la misma señal pero que llega desfasada en el tiempo. Por ejemplo, hay factores de transcripción (más especificamente, el FT "jun") que son fosforilados en su dominio de transactivación y a la vez desfoforilados en su dominio de unión al DNA (para reducir sus cargas negativos que se repelen con los fosfatos del ADN y lograr mayor afinidad). Otro ejemplo es el complejo CdK-ciclina que al estar activo emprende el camino del ciclo celular. Una señal hace que el Cdk presente en todo el ciclo celular, se asocie a una ciclina que como tarda mucho en reaccionar se van acumulando cdk y ciclinas que a la vez son fosofrilados por una kinasa en dos sitios. Una vez que hay muhchos complejos Cdk-ciclina acumulados vuelve la misma señal, y produce que una fosfatasa activadora (ya que activa el complejo) desfosforile rapida y simplemente en un solo sitio. Por lo tanto, para que el complejo Cdk-ciclina se active es necesario una señal que parezca dos veces, en tiempos distintos, que en un primer momento haga que se unan el Cdk y la cilcina correspondiente y que una vez que haya muchos de estps complejos (reacción lenta), se desfosforilen (reacción rápida).El complejo Cdk-cilcina activo está entonces fosforilado en un solo sitio. Hay ciertos agentes inhibidores de Cdks-cilcina: Ink: es una molécula que se intercala entre el Cdk y la ciclina desarmando el complejo P21:Se unen a la CDk-cilcina y forman un complejo ternario incativo. Estos inhibidores son utiles en caso que haya DNA dañados donde señales activan un camino de transducción por lo que se activa, por fosforilación, un factor de transcripción (p53) que induce la transcripcion de un gen que codifica para un inhibidor de Cdk-ciclina, que se expresa y se une a un Cdk-cilcina y lo inactiva frenando el ciclo celular del DNA dañado. Si el DNA en cuestión se encuentra extensamente dañado el P53 se fosforila de manera diferente por lo que la señal no es de actuar como FT del inhibidor sino dar señales de muerte celular. CAMINO COMPLETO El factor de trasncripción activado por la señal de proliferación induce la expresión de una proteínas MYC, otro factor de trasncripción que induce la expresión de ciclina que luego se une al Cdk , se fosforila y finalmente se activa por desfoforlicaion (inducida por el mismo MYC) disparando el ciclo celular. El primer conjunto Cdk.cilcina se da entre las Cdk 4 o 6 y la ciclina D que es el checkpoint del G1, es decir el punto en donde se ratifica que todo
haya salido bien y es seguro proseguir con las fases siguientes. CADA COMPLEJO ES ESPECÍFICO DE CADA MOMENTO DEL CICLO CELULAR. El complejo CdK-ciclina inactiva por fosforilación al RB que activo se une al factor de trasncripción E2F reprimiendolo. Inactivo, el RB se despega del E2F que puede entonces inducir la expresión de fenes qe codifican cilcinas y otras proteínas involucradas en pasos sifueintes del cilco celular.A sy vez, el E2F también actua como inhibidor de Cdk4/6ciclina D para qe no se esacerbe la proliferación. SI HAY FACTOR DE PROLIFERACIÓN, HAY MYC QUE HACE CLICLINA QUE SE UNE AL CDK QUE ES FOSFORLIADO Y DESFOSFORILADO ACTIVANDOSE PARA DESACTIVAR EL RB Y QUE ENTONCES EL E2F HAGA MÁS CICLINAS PRA SEGUIR CON EL CILO CELULAR, ES DECIR LA PROLIFERACIÓN.
METABOLISMO ANABOLISMO: Fotosíntesis La fotosíntesis es un proceso por el cual las plantas verdes y otros organismos autótrofos transforman energía lumínica en energía química lo cual permite fabrican moléculas orgánicas a partir de moléculas inorgánicas. En esta reacción se utiliza CO2 y H2O para fabricar glucosa. La reacción se produce en los cloroplastos, un organela de las células autótofras que posee una membrana externa y una interna que encierran a granas el medio en el que se encuentra es el estroma. A sus vez las granas están formadaas por discos tilacoides cuyas membranas que delimitan el espacio tilacoide, son las que poseen la clorofila . Clorofila La clorofila es una molécula rgánica de la familia de las porfirinas, posee una estructura en cruz con cuatro grupos llamdos pitrol donde cada uno posee cuatro carbonos y un nitrógeno y por lo tanto las profirinas son tetrapitronicas, y lo que la diferencia es que en el medio se encuentra un Magnesio. Al igual que el benceno, lamolécula de clorofila es plana y posee enlaces dobles conugados (hay uno doble seguido de uno simple, seguido de uno doble y asi) y también es un híbrido de resonancia por lo que los electrones de esta molécula no se encuentran dispersos sino que poseen un solo híbrido orbital. Lo importante para el fin de esta molécula es que es hidrofóbica y proclive a ceder electrones, es decir, oxidarse en presencia de luz ya que la absorbe dependiendo la longitud de onda del fotón. La longitud de onda es indirectamente proporcional a la frecuencia y a la energía administrada, es decir que a menor longitud de onda, más frecuencia y más energía y viceversa. La clorofila absorbe el color azul y rojo pero no absorbe el verde sino que lo refleja y por eso las plantas son verdes. Hay tres procesos que se pueden dar cuando un fotón incide en la clorofila:
Fluorescencia: Cuando un electrón de la clorofila absorbe la energía lumínica es excitado a un nivel energético mayor dentro de la misma molécula por un tiempo y luego vuelve a su nivel original. Al volver, produce luz, aunque de menor energía que la que recibió ya que se perdió un poco en forma de calor, es decir de mayor longitud de onda. Resonancia: Cuando un electrón de la clorofila absorbe energía, es excitado a un nivel energético mayor y se acerca físicamente a otra clorofila, esta recibe la excitación y un electrón suyo pasa a un nivel energético mayor. Este, se acerca físicamente a otra clorofila y pasa la excitación por lo que un electrón suto pasa a un nivel mayor, y así sucesivamente. De esta manera se pasa la energía de una clorofila a otra por cercanía física. Tansferencia electrónica: Si la molécula de clorofila cuyo electrón es excitado por energía lumínica y por ende este pasa a un nivel energético mayor se encuntra entre dos moléculas no clorofilas, una de ellas se llama dador (da electrones) y otra aceptor (recibe electrones). La clorofila con el electron excitado, es decir en un nivel de energía mayor, se lo pasa, por resonancia, al aceptor y queda en un nivel de energía menor. A su vez el dador le pasa un electrón de un nivel energético mayor a la clorofila y queda en un nivel energético menor. De esta manera, el electrón del dador que estaba en un nivel más bajo de energía que el del electrón excitado de la clorofila ahora pasa a estar en un nivel más arriba en el aceptor, proceso mediado por la clorofila.
Muchas moléculas de clorofila se encuntran en la membrana tilacoide pero estas no se oxidan sino que van pasando la excitación dada por la energía de la luz por resonancia hasta unas clorofilas importantes llamadas par central finalmente si se oxidan y pasan la energía a otras moléculas por trasnferencia electrónica (también pueden oxidarse si a ellas les llega un fotón). Es por esto que todas las clorofilas que no son el apr central (trasnferencia electrónica) se llaman complejo cosechador de luz o complejo antena (LHC) (resonancia). ETAPAS El proceso de fotosíntesis posee dos etapas 1. Etapa luminosa: se produce en los tialcoides y depende de la luz (fotodependiente) 2. Etapa oscura: se produce en el estroma y no depende directamete de la luz (pero sí indirectamente ya que si o hay etapa luminosa fotodependiente no hay oscura).
Etapa luminosa El flujo de electrones aumenta con el potencial redox (oxidarse, perder electrones/reducirse, ganar electrones) que puede tener una molécula. En la etapa lumínica hay dos con distintos potencial redox que colaboran entre sí, el fotosistema I y el fotosistema II. El proceso por el
cual se ceden electrones de una molécula a otra se llama TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTÉTICO. Fotosistema I: La absorbción de luz es hecha por una clorofila llama P700, debido a que es capaz de absorber luz de longitud de onda menor o igual a 700nm, cuyos electrones se excitan con la presencia de luz y pasan a un nivel energético mayor. Este electrón es cedido, es decir la clorofila se oxida y vuelve a su nivel energético original, a una molécula llamada ferredoxina que a su vez se oxida al cederle el electrón a otra molécula llamada NADP que se reduce formando NADPH+H. En este fotosistema el último aceptor es entonces el NADP, no obstante, el dador del electrón proviene del fotosistema II. Fotosistema II: La absorción de la luz es hecha por una clorofila llamada P680, debido a que es capaz de absorber luz de longitud menor o igual a 680nm, cuyos electrones se esxcital con la presencia de luz y pasan a un nivel energético mayor. Este electrón es cedido, es decir la clorofila se oxida y vuelve a su nivel energético original, a una molécula llamada plastoquinona, que se oxida y pasa el electrón al complejo B6-f que a su vez le cede el electrón a la plastocianina que finalmente le pasa el electrón a la clorofila P700 para que haga el proceso descripto en el fotosistema I. Es decir el dador del eelectrón del fotosistema II al I es la plastocianina. Cuando el electrón excitado de la clorofila P680 es cedido y esta vuelve a su nivel energético original oxidada, se reduce al recupera un electrón (haciendo posible que el proceso vuelva a suceder) proveniente de la ruptura del H2O cuyos productos son H que quedan en el medio, Electrones, que son aceptados por P680 y O que queda como desecho. La ruptura del H2O que se da por la luz, y catalizada por una nezima, se llama FOTOLISIS DEL AGUA y es muy necesaria ya que provee de electrones a la etapa luminosa. En conclusión, el dador original es el H20 y el aceptor final es el NADP, es decir el producto de la etapa luminosa es NADPH+H. Sin embargo, además de NADPH+H es necesario obtener ATP. El proceso por el cual se obtiene ATP comienza cuando el B6f se oxida y cede electrones a la plastocianina. En este proceso se libera mucha energía, suficiente como para bombear H desde el estroma hacia el espacio tilacoide. (Todos los componentes de los fotosistemas se encuentran en la membrana tilacoide que separa espacio tialcode de estroma). De esta manera, el estroma se alcaliniza y el espacio tilacoide se acidifica y como al membrana tilacoide no es permeable a los H, estos no pueden salir al estroma a favor del gradiente y por lo tanto se genera una diferencia de PH y potencial entre los dos lados de la membrana. Por lo tanto, se establece una fuerza que impulsa a los H a salir del espacio tilacoide hacia el estroma pero como no pueden debido a la impermeabilidad de la mmebrana hay una enzimas, canales, de membrana que dejan pasa los H a favor del gradiente disipando al energía acumulada. Ante esto, la enzima, llamada ATPsintetasa gira cambiando su conformación y generando ATP fosforilando ADP +P. El fenómeno por el cual se produce ATP gracias a una ATPsintetasa
se llama Quimiosmótico.Por lo tanto, los productos primarios de la etapa lumínica son NADPH+ATP+O liberado. La formación de ATP depende entonces de que se establezca un gradiente de H debido a la diferencia de PH y V entre los dos lados de la membrana tilacoide (causado por la bomba de H producida por la liberación de energía que se dio al oxidarse el B6f, que a su vez, se dio por la oxidación de plastoquinona y antes de P680, que se dio por la presencia de luz) Es por esto que se dice que el trasnporte fotosíntetico y la fosofrilacion son dos procesos que están acoplados, es decir que si bien son diferentes, uno depende del otro. EN este casi si se desacoplan, mediante un desacoplante que disipen el gradiente de H y por lo tanto no se forme la diferencia de PH entre ambos lados de la mmebrana tilacoide, si bien la fosofrilación no podría ocurrir, el transporte fotodintético si y por lo tanto habría NADPH+H y O pero no ATP.
Etapa oscura La etapa oscura de la fotosíntesis ocurre en el estroma del cloroplasto donde una enzima llamada rubisco fija CO2 del aire el cual se une a una azúcar de 5 carbonos para formar un azúcar de 6 carbonos. A su vez este entra en el ciclo de Calvin donde se rompe en dos compuestos de 3 carbonos cada uno y van pasando por disitntas etapas reguladas por disintas enzimas en donde se reducen gracias a los productos primarios de la etapa luminosa, NADPH+H y ATP para formar glucosa. Balance enregético de la fotosíntesis Cada vuelta del ciclo de Calvin incorpora un CO2 y como la glucosa tiene 6 carbonos hacen falta seis vueltas del ciclo de Calvin por glucosa y estas equivalen a 18 ATP y 12 NADPH+H. Como para reducir un NADP se necesitan dos electrones uno por clorofila y p cuatro fotones (ya que se usan dos por clorofila), los que hacen falta para una solo glucosa, es decir reducir solo 12 NADP, son 48 fotones, que poseen la suficiente energía para 18 ATP, y más. Ecuación general de la fotosíntesis:
6CO2 + 6H2O
C6H12O6 + 6O2
CATABOLISMO: Respiración Celular RESPIRACIÓN CELULAR AERÓBICA A partir de la RCA se obtiene energía mediante la oxidación de glucosa donde el aceptor final es el oxígeno.
1. Glucólisis Proceso enzimático que ocurre en el citosol y consiste en que la glucosa, de 6 carbonos es sustrato de una reacción cuyo producto son dos moléculas de 3 carbonos cada una, dos ácidos piruvicos. Comienza cuando la glucosa es fosforilada por la glucokinasa y exokinada y pasa a ser fructosa proceso el cual pierde 2 ATP. Luego una enzima aldolasa rompe en dos azúcares de tres carbonos distintos, que se igualan y na hidronasa los oxida, liberando 2 ATP, utlizado para formar difosfoglicerato qeu se rompe, primero una y luego dos veces formandose finalmente 2 ácidos pirúvicos y liberando nuevamente 2 ATP. Los H que perdió el azucar de tres carbonos al ser oxidado por la hidronasa son captados por moléculas de NAD que se reducen en NADH+H. En conclusión la ganancia neta de esta etapa son solamente 2 ATP pero muchos NADH+H. 2.Ciclo de Krebs Este proceso ocurre en la matriz mitocondrial, en células eucariotas o en el citoplasma, en células procariotas. Allí, el ácido pirúvico que entro pierde un carbono que se libera como CO2 y queda una molécula de 2 carbonos y se une a una coenzima llamada AcetilcoA. La energía necesaria para esta reaccióne s suministrada por la oxidación del pirúvico cuando perdió un carbono mientras que los H liberados los recibio el NAD que se reducio a NADH+H. La oxidación y perdida de carbno del ácido piruvico se llama DESCARBOXILACIÓN OXIDATIVA. una vez cargado el AcetilcoA entra en el ciclo de Krebs donde va perdiendo carbonos que se liberan en forma de CO2 y los H son captados por los NAD y FAD. En total, se liberan 6 moléculas de CO2 (3 por cada ácido pirúvico, es decir por vuelta) y solo se producen 2 ATP (en realidad GTP) pero se producen 8 moléculas de NADH y FADH. En conclusion, el sustrato qeu son dos ácidos pirúvicos se convierten en 2ATP+6CO2+8NADH+FADH. 3.Cadena respiratoria Este proceso ocurre en la membrana interna de la mitocondira, en células eucariotas y en la membrana plasmática en células procariotas. Se divide en cuatro complejos: Primer complejo:Una enzima reductasa oxida a los NADH que vuelven a la matriz a captar H en el ciclo de Krebs y los H liberados reducen a la CoQ a CoQH2. Segundo complejo: Una enzima oxida al FADH2 que vuelve a la matriz a captar H en el ciclo de Krebs y los H liberados reducen a la CoQ en CoH2. Esta es hidrofóbica por lo que puede moverse por la membrana y va hacia el Tercer complejo: La CoQcitoctomoreductasa la oxida y los electrones liberados son aceptados por los citocromos mientras que los H quedan en el medio. EL primer citocromo oxidado es el CIT-B que a la vez se reduce y oxida al CIT-C1 que se reduce y oxida al CITC1. Este se encuentra en la cara externa de la membrana mitocondrial interna que da hacia el esapcio intermembrana y allí oxida al CIT-A que se reduce y oxida al CIT-A3 que finalmente oxida al Oxigeno que toma tambien los H liberados y forma H2O. El oxigeno es por lo tanto el último aceptor de electrones. Cadena respiratoria: NADH/FADh2CoQH2CIT-BCIT-C1CIT-CCIT-ACIT-AO Las reacciones de la cadena dçrespiraoria liberan energía y algunas liberan tanta (de NADH a CoQH2, de CoQH2a CIT-B, de CIT-A3 a O) que producen una bomba de H en estos tres puntos de la misma. los H pasan de la matriz al espacio intermembrana pero no peuden volver a apsar a favor del gradiente ya que la membrana es impermeable a los H,
entonces se forma una diferencia de PH y voltaje de los dos lados de la membrana. Sin embargo, una ATPasa dej apasar los H desde el espacio intermebrana a la matriz, proceos que hace ATO y se llama FOSFORILACIÓN OXIDATIVA ya que se forma ATP gracias a la cadena oxidativa que forma la diferencia de PH entre los dos lados de la membrana. Se dice que estas dos reacciones, al cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa están acopladas. Si se desacoplan con un desacoplante que disipe el gradiente de H igualando el PH en ambos lados la cadena respiratoria seguria ocurriendo pero no la fosforilación oxidativa. Es decir que habría NADH y FADH2 y H2O pero no ATP. Al entrar a la mitocondira los NADH+H pierden 1ATP y se convierten en FADH2, que tiene menos enrgía. Esto no sucede en procariotas por lo que obtienen 2 ATP más que los eucariotas. Balance energético de la glucosa Glucólisis 2ATP-->2ATP 2NADH+H citoplasmaticos (=2 FADH2 mitocondriales)-->4ATP Ciclo de Krebs 2GTP-->2ATP 8 NADH+H mitocondriales (cada uno 3 ATP)-->24ATP 2FADH1 (cada uno 2 ATP)-->4ATP En total de todo el proceso de respiración celular aeróbica es de 36ATP (en bacterias son 38). Ecuación general de la respiraciónc elular aeróbica:
C6H12O6 + 6O2
6CO2+ 6H2O+36ATP
Regulación de la Respiración Celular Aeróbica La glucolisis está regulada porque la enzima que transforma la glucosa en fructosa es una enzima alosterica por lo que posee activadores e inhibidores. El activador de la fosfofructoquinasa es el AMP mientras que le inhibidor es el ATP y el Citrato. Esto tiene sentido ya que el AMP se encuentra presente en la célula cuanod es baja la concentración de ATP presente y por lo tanto, si hay poco ATP se activa la enzima que actuva la RCA que produce ATP. Por otro lado, como si hay ATP o citrato (un ázucar presente en el ciclo de Krebs) se frena la RCA se puede afirmar que esta se regula por feedback negativo 8si hay producto se inhibe la primer enzima del proceso). FERMENTACIÓN En ausencia de oxígeno solo se puede dar la etpa de glucólisis y por lo tanto el individuo obtendria solo 2ATP. Sin embargo,, un problema mayor es el del NADH+H que no podría oxidarse, lo que frenaria la glucolisis y la célula moriría. La fermentación es el mecanismo que hac que esto no suceda.
Fermentación láctica El ácido pirúvico se reduce y pasa a ser ácido láctico gracias a una enzima llamada lactatodeshidrogenada utilizando el H del NADH que por lo tanto se oxida y puede volver a funcionar en la glucólisis. Glucosa+ ADP+P+NAD-->2 ácidos piruvicos+NADH+ATP-->2 ácidos lácticos+NAD+ADP+P Fermentación alcohólica El ácido pirúvico pierde un carbono en forma de CO2 y se genera etanal (2 carbonos) que se reduce gracias a la enzima piruvatodecorrosidasa. A su vez el etanal se reduce egracias a la enzima alcoholdesidrogenasa utilizando los H del NADh que se oxida y vuelve a ser parte de la glucolisis. Glucosa+ADP+P+NAD-->2 ácidos pirúvico+ATP+NADH-->2etanal-->2etanol
Citoesqueleto Solo existe en células eucariotas y se puede dar en tres formas: 1. Microfilamentos de tubulina 2. Microfilamentos de actina 3. Microfilamentos intermedios de diversas proteínas
1.Microfilamentos de tubulina Se forman a partir de la polimerizacón dada por uniones débiles de una unidad repetitiva en forma de dímeros (alfa y beta) de tubulina soluble globulares. Esta reacción no está regulada por ninguna enzima y existe un equilibrio entre la tubulina soluble y la despolimerizada que es indispensable para ciertos procesos de la célula (por ejemplo la formación del huso mitótico). Como estos procesos se dan en general en la división célular, exaustiva en la formación de tumores y metástasis se crearon ciertas drogas, utilizadas en quimioterapia, que inhiben este equilibrio impidiendo por ejemplo la polimerización y de esta manera impiden la duplicación celular. La estructura del microtúbulo es regular y siempre la misma con un perímetro de 13 monómeros. Cuando un monómero se une a una molécula de GTP cambia conformacionalmente haciéndose más afin a otro monómero y por lo tanto el equilibrio se desplaza hacia la polimerización. Sin embargo como el mismo puede también hidrolizar el GTP en GDP+P, es decir es una GTPasa, al hacerlo, el GDP es menos afin a otros monómeros y el equilibrio vuelve a desplazarse hacia la despolimerización. Entonces, si se inhibe la actividad de GTPasa el microtubulo polimerizaría siempre y al contrario, si se activa permanentemente, el microtubulo despolimerizaria siempre.
Los factores que regulan el equilibrio son: Polimerización: baja concentración de Calcio, alta temperatura y unión a GTP Despolimerización: alta concentración de Calcio, baja temperatura y unión a GDP. Tanto la polimerización como la despolimerización ocurre en los extremos del microtúbulo, y no en el medio. Hay cinco posibilidades de como se de este proceso de crecimiento por el cual se desplazan o giran y al ser huecos lo que entra de un lado sale del otro: 1. Si la velocidad de polimerar de un extremo es mayor a la velocidad de despolimerar del otro, entonces el microtúbulo crece 2. SI la velocidad de polimerar de un extremo es menor a ala velocidad de despolimerizar del otro, entocnes el microtúbulo se acorta. 3. Si polimeriza de dos extremos crece 4. Si despolimeriza de dos extremos se acrota. 5. Si la velocidad de polimerizar es igual a la velocidad de despolimerizar entonces el alrgo del microtúbulo permanence constante. Esto es muy raro y se le llama efector “noria” o “treadmilling”.
A los microtúbulos que crecen y decrecen se les dice microtúbulos dinámicos y, al contrario, a los microtúbulos que permanecen con longitud constante se lo llaman microtubulos estables. Cada microtúbulo dinámico tiene un extremo llamada + y un extremo llamado -. Esta nomenclatura no quiere decir que hay un exremo que polimeriza y uno que despolimeriza sino que el extremo + comienza a polimerizar a menor concentración de tubulina en el medio de la requerida para que el extremo – comienze a polimerizar ya que le extremo+ es más afin a la tubulina que el extremo -. Como la concentración de tubulina por la cual un extremo comienza a polierizar se llama concentración crítica, podemos decir que el extremo + tiene menor concentración crítica que el extremo -. Además, en general los microtúbuls están anclados en un extremo y son libres del otro para des y polimerizar. Por ejemplo del centrosoma y huso mitótico están anclados por el extremo – y libres del extremo +, más afin a la tubulina soluble. Los microtubulos estables no crecen ni decrecen ya que existen proteínas, llamadas MAP,que se adosan débilmente a sus extremos y los bloquean impidiendo que salgan o se pegen monómeros.
Flagelos y cilias Aunque ambos están formados por microtúbulos estables, rodeados por membrana plasmática con un interior que se llama cuerpo basal, los flagelos son más largos y hay pocos por célula mientras que las cilias son cortitas y hay muchas por célula. Toda cilia y flagelo posee una estructura fija y regular de 9 +2: nueve pares de microtubulos periféricos y un par central. Cada uno de los pares periféricos posee uno completo, o microtubulo A de 13 subunidades y uno incompleto, o microtubulo B de 11 subunidades, mientras que los dos centrales son completos. De cada micortubulo A salen una proteína llamada DINEINA que aporta movimiento al flagelo o cilia al cargarse con ATP. También hay dos proteínas que otorgan sostén al microtubulo llamadas RADIO (que salen de los microtubulos periféricos A hacia el centro) y NEXINA. Gracias a varios experimentos se delucidó que sin radio ni nexina el flagelo se mueve por deslizamiento y se estira gracias a la dineina pero en presencia de radio y nexina el deslizamiento está limitado y es por esto que el microtúbulo gira. Como es la dineina lo que le otorga movimiento a la célula, si una persona tiene mutado el gen de dinenina sus flagelos ni cilias no tienen movimiento y por lo tanto sufren de esterilidad (los espermatozoides tienen flagelos), problemas repsiratorios (hay cilias en el esófago que expulsan las moléculas que llegan con el aire) y en el 50% de los casos se puede dar una rara enfermedad llamada dextrocardia la cual produce que la simetría del cuerpo este invertida (tener los órganos del lado contrario). Esta última se da debido a que en el desarrollo del embrión, la simetría externa se establece en un compartimento llamado nodo, el cual posee cilias que general un flujo de liquidos con factores de crecimiento, de un lado o del otro. Si no hay cilias, hay un 50% de probailidades de que los factores de crecimiento queden del lado correcto y 50% de que queden del lado incorrecto y la persona sufra de dextrocardia. Toda célula posee una cilia primaria con receptores para distintos factores de crecimiento. El cuerpo basal o centriolo Es el principio de la cilia o flagelo y su estructura es de 9+0 con nueve tripletes de microtúbulos periféricos, un A completo y un B y C incompletos, y ninguno central. En células animales se encuentran de a dos y dentro del CENTROSOMA y por lo tanto al dividirse en la fase G1 de la división celular cada célula hija porta un centriolo que sirve de molde para la creación de uno igual, sobre el cual se polimeriza la tubulina. De esta manera cada célula hija posee dos centriolos que podrán separarse en una nueva duplicación celular. Como el hecho de tener centriolos desemboca en tener cilias y flagelos, es ventajoso el hecho que los centrilos se encuentren en los centrosomas ya que de esta manera cada célula hija podrá tener flagelos o cilias.
Cabe aclarar que no son los centriolos los que fabrican el huso de la división celular sino que son los mismo centrosomas quien lo hacen. Esto se ratifico comprobando que varias especies sin centríols igual hacen mitosis.
MITOSIS: tipo dedivisión celular donde la célula que se divide genera dos células hijas con el mismo número de cromosomas. CENTROSOMA: Es una proteína que se forma espontáneamente y posee una estructura esférica que contiene centriolos en su interior. Es ella la que forma el huso mitótico (y no el centriolo) y posee tres tipos de microtúbulos que se enganchan a ella por el extremo – gracias a una molécula en su perfieria llamada tubulina gamma. Los tres tipos de microtubulos son: 1. Microtúbulos del cinetocoro (del centrosoma al cinetocoro (centro) del cromosoma). 2. Microtúbulos polares (del centrosoma hacia el ecuador donde se cruzan) 3. Microtúbulos del áster (del centrosoma hacia cualquier lado). En la anfase hay dos fuerzas que actúan simultáneamente:
Anafase A: dada por el acortamiento de los microtúbulos del cinetocoro por despolarización principalmente del exremo + pero también del extremo – (auqne en menor medida). Esto causa movimiento y como el cinetocoro es muy afin al microtúbulo y poco afin a la tubulina soluble, se va corriendo con el y así cada cromátide va hacia un polo. Anafase B: dada por la separación de los microtúbulos polares que produce una fuerza que separa los centrosomas y a su vez las cromatides que son llevadas hacia cada polo.
Existen proteínas llamadas proteínas motor que se mueven sobre la tubulina (microtubulo estable) moviendo moléculas o vesículas por el microtúbulo. Una de ellas es la DINEINA que lleva vesículas del extremo + al extremo – y otra es la KINESINA que lleva vesículas del extremo – hacia el extremo +.
2. Microfilamentos de actina La actina es un monómero globular que al unirse a ATP favorece su propia polimerización, además del calcio, el magnesio y el NaCl que también lo favorecen. Al igual que con los microtúbulos hay drogas que inhiben la polimerización y es el extremo + el más afin a la actina por lo que tiene menor concentración de actina crítica que el extremo -. La miosina es una proteína motor que se mueve sobre la actina llamada MIOSINA.
De pendiendo a que proteína ligadora de actina se asocie forma una estructura diferente:
Fimbrina: los haces paralelos de microfilamentos de actina que componen cada microvellosidad del intestino están unidas por molécuals de fimbrina. Alfa-actinina: en el citoplasma la actina forma un gel de filamentos cruzados que le otorgan propiedades plásticas y elásticas a la célula y están unidos por alfa-actinina. Se dice que es elástica ya que si se le aplica una fuerza elástica por un cierto tiempo y luego suelto, la célula vuelve a su forma individual. Por otro lado, también es plástica ya que si lo estiro por un tiempo muylargo en el cual la alfa-actinina y actina se separan ya que son uniones débiles, la célula se deforma. Filamina y gelosina: la filamina nteraccionan con filamentos de actina al igual que la alfa-actinina pero formando geles mas gruesos. No obstante, la gelosina disuelve el gen metiéndose entre los microfilamentos y cortando las uniones. De esta manera se generan microfilamentos mas cortos que quedan como “sol”. Este cambio de gel a “sol” continuo produce movimiento.
Integrina: Proteínas de membrana que interactúan con moléculas de la matriz con las que tienen poca afinidad. Por lo tanto, se pegan y se despegan a ellas simultáneamente otorgándole movimiento a la célula. Sn embargo, si las integrinas se encuentran en parches en la membrana, al ser mas son más afines a la matriz y por lo tanto no se mueven.
3.Filamentos intermedios Son monómeros fibrosos y cada tipo se une a distintas proteínas (tabla en filmina 432). Las que vimos son las de Tipo IV, que se unen a las laminas que son proteínas que se encuentran por debajo de la envoltura nuclear formando una capa que le da rigidez y forma al núcleo. En el ciclo celular, la Cdk-ciclina fosforila las laminas que se repelen y se desarma la capa de laminas y con ella la envoltura nuclear. En la telofase, se desfosforilan y vuelven a unirse dándole forma nuevamente a la envoltura nuclear.
Uniones celulares 1. Uniones impermeables Unión estrecha Esta unión se establece entre células epiteliales físicamente cercanas y dando resultado una “costura” de las membranas de las dos células. De esta manera, las células epiteliales
forman una barrera ya que el líquido y las moléculas en el solo pasan al intestino si son
