RESUME GENETIKA 2 Kelompok 8 Nama Kelompok : Isfatun Chasanah Nurul Hikmah
REGULASI EKSPRESI GEN DARI EUKARIOT Jalur Regulasi Ekspresi Gen Eukariot: Pendahuluan
Dimensi Regulasi Gen Eukariot Regulasi gen dapat dilihat dari bagaimana Tripanosoma dilawan oleh sistem imun. Gen-gen vsg yang berbeda diekspresikan pada waktu yang berbeda pula, sehingga gen vsg diregulasi secara temporal. Gen diregulasi dalam dimensi ruang pada eukariot, khususnya organism multiseluler. Regulasi yang meyebabkan perbedaan pada ekspresi gen menandakan bahwa organism eukariot multiseluler memiliki fisiologi kompleks, karena gen terekspresi dalam waktu dan ruang tertentu. Seperti pada prokariot, ekspresi gen pada eukariot melibatkan transkripsi DNA ke RNA dan translasi selanjutnya RNA menjadi polipeptida. Meskipun demikian, aktivitas awal hingga translasi pada kebanyakan RNA eukariot adalah ‘diproses’. Selama pemrosesan, RNA memiliki cap ujun 5i dan polyadenilasi pada ujung 3’, dan dapat berubah secara internal dengan kehilangan skuens intron noncoding. RNA prokariot tidak memiliki modifikas terminal dan internal tersebut. Ekspresi gen pada eukariot lebih sulit daaripada prokariot. Hal ini disebabkan karena sel eukariot memiliki sistem membrane sel yang tergolong rumit. Kompartemen tersebut membagi sel dalam organel-organel yang terpisah, seperti nucleus yang paling mencolok,
sel eukariot juga
memiliki mitokondrio, kloroplas (pada sel tanaman), dan reticulum endoplasma. Setiap organel tersebut memiliki fungsi yang berbeda. Nukleus menyimpan materi genetic, mitokondria dan kloroplas merupakan menghasilkan energy dan reticulum mentansport zat dalam sel. Bagian sel eukariot yang memisah dapat menjadi organel karena ada ekspresi gen. Kejadian utama, transkripsi DNA menjadi RNA dalam nucleus. Transkrip RNA juga dimodifikasi dalam nucleus dengan cara caping, polyadenilasi, dan penghilangan intron. Kemudian, hasil mRNA dikeluarkan ke dalam sitoplasma dimana produk tersebut saling berhubungan dengan ribosom, yang terletak di membrane reticulum endoplasma. Saat mRNA terhubung dengan ribosom maka mRNA mentranslasi menjadi polipeptida. Pemisahan fisik pada saat ekspresi gen menjadikan mRNA dapat
melakukan regulasi di tempat tertentu yang berbeda. Regulasi dapat terjadi dalam nucleus pada tahap DNA atau RNA, atau level RNA atau polipeptida dalam sitoplasma. Transkripsi Terkontrol pada DNA
Pada prokariota, ekspresi gen diatur dengan mengontrol transkripsi DNA menjadi RNA. Sebuah gen yang tidak ditranskripsikan merupakan gen yang tidak diekspresikan. Transkripsi terjadi di prokariota saat molekul regulasi negatif seperti protein lac represor dihapus dari sekitar gen dan molekul regulasi positif seperti protein katabolit aktivator (CAP) / cAMP telah terikat (Bab 18). Interaksi protein-DNA ini apakah dikontrol atau tidak oleh gen yang dapat diakses oleh RNA polimerase. Selain itu, mekanisme yang telah berevolusi untuk mengontrol transkripsi pada organisme ini dapat merespon dengan cepat terhadap perubahan lingkungan. Seperti pada Bab 18, control rambut pemicu ini merupakan strategi yang efisien untuk bertahan hidup pada prokariotik. Kontrol transkripsi lebih kompleks pada eukariota daripada di prokariota. Salah satu alasannya adalah bahwa gen diasingkan di nukleus. sebelum lingkungan dapat memiliki efek pada tingkat transkripsi, mereka harus dikirimkan dari permukaan sel, di mana mereka biasanya diterima, melalui sitoplasma dan membran nuklear, dan ke kromosom. Oleh karena itu sel-sel eukariotik perlu diteliti mengenai sistem internal untuk mengontrol transkripsi DNA. Faktor lain yaitu bahwa eukariot merupakan multiseluler. Syarat lingkungan mungkin harus melewati lapisan sel untuk dapat memberi dampak pada transkripsi gen dalam jaringan tertentu. Oleh karena itu hubungan interseluler adalah aspek penting dari regulasi transkripsi eukariotik. Seperti di prokariota, regulasi eukariotik transkripsi pada eukariotik dimediasi oleh interaksi protein-DNA. Positif dan negatif protein regulator mengikat daerah tertentu dari DNA dan mensimulasi atau menghambat transkripsi. kelompok, protein inilah yang disebut sebagai faktor transkripsi. Banyak jenis yang berbeda telah diidentifikasi,dan sebagian besar tampaknya memiliki peran karakteristik yang memungkinkan mereka untuk berinteraksi dengan DNA. Struktur protein ini, dan interaksi mereka dengan DNA, akan dibahas pada bagian selanjutnya Penyambung Alternatif dari RNA Kebanyakan gen eukariotik memiliki intron, daerah nonkoding memotong sekuens (urutan) yang menentukan asam amino dari polipetida. Masing-masing harus dihapus dari transkrip RNA dari sebuah gen pada urutan agar sekuen koding diekspresikan dengan benar.
Proses ini melibatkan penggabungan yang tepat dari sekuens koding , atau ekson, ke dalam sebuah mRNA. Gen dengan beberapa intron menghadirkan beberapa masalah yang aneh pada kelengkapan penyambungan RNA. Intron ini dapat dihapus secara terpisah atau dalam kombinasi, tergantung pada bagaimana kelengkapan splicing berinteraksi dengan RNA. Jika dua intron berturut- turut tergeser bersama-sama, maka ekson antara mereka juga akan tergeser. Dengan demikian, kelengkapan penyambungan memiliki kesempatan untuk mengubah sekuens koding dari RNA dengan menghapus beberapa eksonnya. Fenomena dari penyambungan transkrip RNA pada jalur yang berbeda nampaknya merupakan cara menghemat pada informasi genetic. Ternyata duplikasi atau potongan gen, penyambungan akternatif dari transkrip memungkinkan sebuah gen tunggal untuk mengkodekan polipeptida yang berbeda. Satu contoh dari dari penyambungan alternative terjadi selama ekspresi dari gen pada troponin T, protein yang ditemukan dalam otot rangka vertebrate, ukuran protein ini berkisar 150 sampai 250 asam amino. Pada tikus, gen troponin T lebih panjang 16 kb dan berisi 18 ekson yang berbeda. Transkrip gen ini disambung dengan cara yang berbeda untuk membuat susunan besar mRNA. Saat diterjemahkan, banyak polipeptida troponin T yang berbeda diproduksi. Semua polipeptida ini berbagai asam amino dari 1-3, 9-15, dan 18. Namun, daerah ini dikodekan oleh ekson 4-8 mungkin ada atau tidak ada, tergantung pada pola penyambungan. Dan tampaknya dalam kombinasi apapun. Variasi tambahan disediakan oleh ada atau tidaknya aderah yang dikodekan ole ekson 16 dan 17, jika 16 ada, 17 tidak dan sebaliknya. Bentuk- bentuk yang berbeda dari troponin T mungkin berfungsi dalam cara yang sedikit berbeda dalam otot, berkontribusi terhadap variabilitas aksi sel otot. Untuk menilai variasi yang dapat dihasilkan oleh penyambungan alternative dari RNA, kerja melalui pemecahan: yaitu menghitung mRNA.
Kontrol Sitoplasma pada Stabiltas mRNA Pesan RNAs dikirim dari nukleus ke sitoplasma dimana mereka menjalankan sebuah templet untuk sintesis polipeptida. Setelah di dalam sitoplasma, mRNA ditranlasikan oleh beberapa ribosom untuk dipindahkan sepanjang sekuennya. Pada proses translasi pemasangan tetap berlanjut hingga mRNA didegradasi. mRNA di degradasi oleh titik kontrol lainnya dalam keseluruhan proses pada ekspresi gen. mRNAs yang berumur panjang mampu menyelesaikan rentetan pada sintesis polipeptoda, sebaliknya mRNA berumur pendek tidak dapat melakukan hal tersebut. mRNA harus didegradasi dengan cepat karena mungkin akan terus bertambah sellama proses transkripsi berlangsung. Sebaliknya, polipeptida yang telah dikode akan berhenti disintesis. Sintesis polipeptida bisa saja terjadi, tentu, mungkin bagian dari perkembangannya. Sesekali polipeptida hasil translasi tersebut tidak berpengaruh, itu mungkin tidak lagi diperlukan, faktanya, apabila sintesis diteruskan mungkin akan berbahaya. Dalam beberapa kasus, degradasi yang cepat pada mRNA harus mempertimbangkan secara rasional untuk mencegah hal yang tidak diinginkkan terjadi pada sintesis polipeptida. RNA messenjer longevity mungkin bisa terpengaruh oleh beberapa faktor. Poly (A) tails tampaknya untuk menstabilkan mRNAs. Bagian 3’ (3’ UTR)
pada sekuen tidak
ditranslasiikan terdahulu sebuah poly (A) tails tampaknya juga mempengaruhi stabilitas mRNA. Beberapa mRNAs memiliki sekuen AUUUA yang diulang beberapa kali dalam bagian 3’ yang tidak ditranslasikan. Ketika sekuen ditransferkan secara semu ke bagian 3’ yang tidak ditranslasi pada kebanyakan mRNA yang stabil, mereka, juga, menjadi tidak stabil. Faktor kimia, berupa hormon, juga mempengaruhi stabilitas mRNA. Pada katak Xenopus laevis, gen vitellogenin melakukan transkripsi karena diaktivasi oleh hormoon steroid tepatnya estrogen. Akan tetapi, tambahan untuk mempengaruhi transkripsi pada gen ini, estrogen juga meningkatkan longevity pada mRNA. Penelitian terbaru mengungkapkan bahwa stabilitas mRNAs dan translasi pada mRNAs menjadi polipeptida juga diregulasi oleh molekul kecil, nonkoding mollekul RNA yang dikenall dengan interferiing RNAs (siRNAs) atau mikroRNAs (miRNAs). Regulasi molekul RNA ini, panjangnya antara 21-26 nukleotida, diproduksi dari sangat besar, yaitu double strand RNAs dalam varietas yang berbeda pada organismme eukariot, termasuk fungi, tumbuhan, dan hewan. Interfering pendek dan mikroRNAs base-pair dengan sekuen dalam mRNAs spesifik, apabila dipasangkan,, salah satu dari kedua komponen tersebut sebab mRNA mungkin terbelah dan dengan sub sekuen yang terdegradasi, atau mereka menjaga mRNA dari wujud translasi polipeptida. Pada tumbuhan, molekul RNA kecil selalu menyediakan agen pertahanan terhadap infeksi oleh viruus RNA, dan pada tumbuhan dan hewan lainnya regulasi ekspresi gen terbawa dalam pematangan dan perkembangan.
Induksi pada Aktivitas Transkripsi dengan Faktor Lingkungan dan Biologi Ekspresi gen pada eukariotik dapat diinduksi dengan faktor lingkungan seperti suhu dan molekul signal seperti hormon dan faktor pertumbuhan Dalam penelitian mereka tentang operon laktosa pada E. coli, Jacob dan Monod menemukan bahwa gen untuk metabolisme laktosa secara khusus ditranskrip ketika laktosa masuk ke dalam sel. Dengan demikian, mereka menunjukkan bahwa laktosa adalah inducer transkripsi gen. Mengikuti jejak Yakub dan Monod, banyak peneliti telah berusaha untuk mengidentifikasi inducer spesifik transkripsi gen eukariotik. Meskipun upaya ini telah ditemukan dengan cukup sukses, sejauh keseluruhan yang gen eukariotik diinduksi oleh faktor lingkungan dan nutrisi tampaknya masih kurang jika dibandingkan dengan prokariota.
Di sini kita akan mempertimbangkan dua contoh dari ekspresi gen yang diinduksi di eukariota. Temperatur : Gen heat-shock Ketika organisme dikenakan pada suhu tinggi, mereka merespon oleh sintesis sekelompok protein yang membantu untuk menstabilkan sel internal terhdap lingkungan. Protein heat-shock ini, ditemukan di prokariota dan eukariota, antara polipeptida yang biasa ditemukan. Perbandingan dari urutan asam amino dari protein heat-shock dari organisme yang beragam seperti E. coli dan Drosophila menunjukkan bahwa mereka 40 sampai 50 persen identik.
Ekspresi protein heat-shock diatur pada tingkat transkripsi; yaitu, stres panas khusus yang menginduksi transkripsi gen yang untuk mengkode protein. Pada Drosophila misalnya,
salah satu protein heat-shock disebut HSP70 (untuk protein heat-shock, molekul dengan berat 70 kilodaltons) dikodekan oleh kelompok gen yang terletak di dua cluster terdekat di salah satu autosom. Secara keseluruhan, ada lima sampai enam salinangen hsp70 ini dalam dua kelompok. Bila suhu melebihi 33oC, sama halnya pada hari-hari musim panas, masingmasing gen ditranskripsi menjadi RNA, yang kemudian diproses dan diterjemahkan untuk menghasilkan polipeptida HSP70. Transkripsi dengan inksi panar ini dari gen HSP70 dimediasi oleh polipeptida disebut faktor transkripsi heat-shock, atau HSTF, yang hadir dalam inti sel Drosophila. Ketika Drosophila yang terkena stress panas, HSTF secara kimiawi diubaholeh fosforilasi. Dalam keadaan yang berubah ini, ia mengikat secara khusus urutan nukleotida ujung dari gen HSP70 dan membuat gen lebih mudah diakses oleh RNA polimerase II, enzim yang mentranskripsi gen yang paling sering mengkode protein. Transkripsi gen HSP70 kemudian dengan tenaga penuh dirangsang. Urutan dimana terfosforilasi HSTF mengikat disebut elemen respon panas-shock (HSES). Molekul Sinyal: Gen yang Respon Terhadap Hormon
Pada eukariotik multiseluler, salah satu jenis sel mendapat sinyal lain dengan mengeluarkan hormon. Hormon yang beredar melalui tubuh, melakukan kontak dengan sel target mereka, dan kemudian menginisiasi serangkaian peristiwa yang mengatur ekspresi gen tertentu. Pada hewan ada dua bagian umum hormone. Bagian pertama adalah hormon steroid yang kecil, molekul lipid larut yang berasal dari kolestrol. Karena sifat lipid mereka, mereka memiliki sedikit atau tidak ada kesulitan untuk melewati membrane sel. Contohnya pada esterogen dan progesteron, yang memainkan peran penting dalam siklus reproduksi wanita, testosterone yang merupakan hormon perubahan dan perilaku laki-laki, glukotiroid yang terlibat dalam pengaturan kadar gula darah, dan ecdysone yang merupakan hormon yang mengontrol peristiwa perkembangan pada serangga. Hormon yang telah memasuki sel, mereka akan berinteraksi dengan protein sitoplasma atau protein inti sehingga disebut reseptor protein. Reseptor/hormon kompleks dibentuk kemudian akan berinteraksi dengan DNA, dan bertindak sebagai faktor transkripsi untuk regulasi ekspresi gen-gen tertentu. (Gambar 19.4). Bagian kedua dari hormon adalah hormon peptida yang merupakan rantai linier asam amino. Seperti kebanyakan polipetida yang lain, molekul ini dikode oleh gen. Contohnya adalah insulin, yang meregulasi tingkatan gula darah, somatotropin yang merupakan hormone pertumbuhan, dan prolactin yang menargetkan jaringan di payudara mamalia betina. Karena hormon peptida biasanya terlalu besar untuk melewati membrane sel, maka sinyal yang mereka sampaikan harus dikirim ke bagian dalam sel dengan ikatan membran protein reseptor (Gambar 19.5). Ketika hormon peptide berinteraksi dengan reseptor, hal itu menyebabkan perubahan konformasi pada reseptor yang akhirnya mengubah protein lain didalam sel. Melalui cara perubahan tersebut, maka sinyal hormone akan ditransmisi melalui sitoplasma sel dan masuk dalam nukleus, dimna akhirnya hormone tersebut berdampak pada regulasi ekspresi gen tertentu. Proses mentrasmisi sinyal hormon melalui sel dan masuk kedalam nukleus disebut transduksi sinyal.
Gambar 19.4 Regulasi ekspresi gen oleh hormone steroid. Hormon berinteraksi dengan reseptor didekat sel target. Pada contoh ini, reseptor pada sitoplasma, reseptor hormone steroid yang lain terletak pada nukleus. Kompleks hormon steroid/reseptor berpindah kedalam nukleus dimana terjadi aktivitas transkripsi partikel gen.
Gambar 19.5. Regulasi ekspresi gen oleh hormone peptide. Hormon (sinyal ekstraseluler) berinteraksi dengan reseptor pada membran di sel target. Aktivitas kompleks hormon/ reseptor yang dihasilkan mengaktifkan protein sitoplasma yang memicu perubahan intraseluler. Perubahan ini merupakan transmisi sinyal kedalam nukleus, dimana faktor transkripsi memicu ekspresi gen tertentu. Hormon penginduksi ekspresi gen dimediasi oleh sekuen tertentu pada DNA. Sekuen ini, disebut elemen respon hormone (HREs), yang sejalan dengan respon elemen panas yang dibahas sebelumnya. Mereka terletak dekat dengan gen mereka yang mengatur dan melayani untuk mengikat protein tertentu, ketika bertidak sebagai faktor transkipsi. Dengan hormon steroid seperti esterogen, HERs akan diikat oleh kompleks hormon/ reseptor ketika stimulasi transkpisi. Kekuatan respon transkripsi tergantung pada angka HREs yang tersaji. Ketika ada elemen respon ganda, kompleks hormon/ reseptor akan mengikat secara kooperatif satu sama lain, secara signifikan akan meningkatkan tingkat transkripsi, bahwa gen dengan dua elemen respon yang ditranskripsi lebih dari dua kali dianggap sebagai kekuatan gen hanya satu. Dengan hormon peptide, reseptor biasanya tersisa didalam membrans sel, bahkan setelah membentuk kompleks dengan hormone. Sinyal hormon yang disampaikan untuk nukleus dengan protein lain, beberapa diantaranya mengikat urutan yang dekat dengan gen yang diatur oleh hormon. Protein kemudian bertindak sebagai faktor transkripsi untuk mengontrol ekspresi gen. Aktivitas transkripsi dapat diinduksi oleh banyak jenis protein yang bukan merupakan hormon atau dalam arti lain tidak diproduksi oleh kelenjar tertentu atau organ. Ini termasuk berbagai disekresikan, molekul faktor pertumbuhan saraf, faktor pertumbuhan epidermal, dan faktor penurunan platelet, dan molekul noncirculating lain yang terkait dengan permukaan sel atau dengan matriks antara sel-sel. Meskipun masing-masing dari protein ini memiliki kekhasan sendiri, mekanisme umum dimana mereka menginduksi transkripsi menyerupai hormon peptida. Interaksi antara protein signaling dan reseptor membran-terikat memulai rantai peristiwa di dalam sel yang akhirnya menghasilkan faktor transkripsi spesifik yang mengikat gen tertentu, yang kemudian ditranskripsi. Kontrol Molekular Transkripsi Pada Eukariot Banyak penelitian tentang ekspresi gen eukariotik yang fokus pada faktor yang mengontrol transkripsi. Hal ini dititikberatkan pada kontrol transkripsi yang merupakan bagian dari perkembangan teknik eksperimental yang sudah memperbolehkan aspek regulasi
gen untuk dianalisis secara rinci. Akan tetapi, hal itu juga menarik ide yang dimunculkan dari penelitian gen prokariotik. Pada prokariot dan eukariot adalah suatu kejadian primer dalam ekspresi gen. Oleh karena itu, bagian besar tingkat dasar yang mana ekspresi gen dapat dikendalikan. Sekuen DNA terlibat pada Kontrol Transkripsi Transkripsi diinisiasi pada gen promoter, bagiannya dikenal dengan RNA polimerase. Akan tetapi, inisiasi yang akurat pada transkripsi dari gen promoter eukariotik memerlukan beberapa protein aksesoris atau faktor transkripsi basal (basal transcription factors). Masingmasing protein mengikat sekuen sampai promoter untuk memudahkan RNA polimerasi pada keadaan yang tepat pada strand template DNA.
Transkripsi gen eukariotik juga dikontrol oleh variasi dari faktor transkripsi spesiel (special transcription factors), seperti yang terlibat pada regulasi gen heat and hormoneinducible yang telah didiskusikan. Faktor-faktor ini mengikat respon elemen atau umumnya ke sekuen disebut enhancers berlokasi di sekitar gen. Faktor transkripsi spesial yang mengikat enhancers berinteraksi dengan faktor transkripsi basal dan RNA poimerase yang mana mengikat gen promoter. Interaksi bertempat diantara Faktor transkripsi spesial, Faktor transkripsi basal dan RNA polimerase yang mengatur aktivitas gen. Enhancers memperlihatkan 3 properti general: (1) mereka berperan secara relatif pada jarak yang panjang- lebih dari beberapa ribu pasangan basa dari gen regulasi mereka; (2) pengaruh mereka pada ekspresi gen berorientasi bebas, mereka berfungsi baik dengan kata lain normal atau orientasi terbalik dalam DNA; dan (3) efek mereka posisinya bebas, mereka berlokasi dihulu, hilir atau sampai intron dari gen dan masih mempunyai efek yang dalam pada ekspresi gen. Tiga karakteristik ini membedakan enhancer dari promoter, yang mana secara khas berlokasi dihulu gen dan hanya berorientasi pada satu fungsi. Enhancer bisa relatif besar , sampai beberapa ratus pasang basa yang panjang . Mereka kadang-kadang mengandung urutan berulang yang memiliki aktivitas peraturan parsial sendiri.Sebagian besar enhancer berfungsi dalam jaringan secara spesifik ; yaitu, mereka merangsang transkripsi hanya di jaringan tertentu .Dalam jaringan lain mereka hanya diabaikan . Yang jelas
Misalnya kekhususan jaringan ini berasal dari studi tentang gen kuning di Drosophila (Figure 19.6). Gen ini bertanggung jawab untuk pigmentasi di banyak bagian tubuh yaitu pada bagian sayap , kaki , dada , dan perut . Tipe liar lalat menunjukkan berwarna hitam kecoklatan gelap pigmen dalam semua struktur ini , sedangkan lalat mutan menunjukkan ringan coklat kekuningan pigmen. Namun, dalam beberapa mutan , ada pola mosaik pigmentasi , berwarna hitam kecoklatan di beberapa jaringan dan coklat kekuningan pada orang lain . Pola-pola mosaik adalah karena mutasi yang mengubah transkripsi gen kuning di beberapa jaringan namun tidak pada orang lain . Pamela Geyer dan Victor Corces telah menunjukkan bahwa gen kuning diatur oleh beberapa enhancer , beberapa di antaranya berlokasi di dalam intron , dan bahwa setiap enhancer mengaktifkan transkripsi dalam jaringan yang berbeda . Jika , misalnya , penambah yang ekspresi di sayap yang bermutasi , bulu pada sayap coklat kekuningan bukannya berwarna hitam kecoklatan. Baterai enhancer terkait dengan gen kuning memungkinkan ekspresi harus dikontrol dengan cara spesifik jaringan . Untuk melihat cara lain belajar enhancer , bekerja melalui Keterampilan Pemecahan Masalah : Mendefinisikan Urutan Diperlukan untuk ekspresi suatu Gen. Selain promoter, banyak gen eukariot yang diatur oleh oleh elemen cis yang disebut enhancerdan silencer. Enhancer meningkatkan transkripsi dan silencer menurunkan transkripsi dai gen yang bersangkutan.Sifat dasar enhancer yang dapat membedakannya dari promoter adalah sebagai berikut: 1) Dapat bekerja dari jarak yang relatif jauh hingga beberapa ribu pasang nukleotida, 2) Tidak dipengaruhi orientasi, baik normal maupun terbalik, dan 3) Tidak dipengaruhi posisi, baik upstream (5’) maupun downstream (3’). Bagaimana enhancer mempengaruhi transkripsi gen ? Hasil dari banyak penelitian menunjukkan bahwa protein yang mengikat enhancer mempengaruhi aktifitas protein yang mengikat promotor, termasuk factor-faktor transkripsi basal dan RNA polymerase. Dua jenis protein yang dibawa dalam kontak fisik dengan komplek multimerik terdiri setidaknya 20 protein yang berbeda. Kompleks mediator menekuk DNA dengan sedemikian rupa sehingga protein-protein terikat pada enhancer disejajarkan dengan protein yang terikat pada promotor. Dengan cara ini, maka, protein terikat pada enhancer menekan kontrol transkripsi, yang dimulai pada promoter.
Protein Yang Terlibat Dalam Pengendalian Transkripsi: Faktor Transkripsi
Sejumlah besar protein eukariotik yang merangsang transkripsi. Banyak dari protein ini tampaknya memiliki setidaknya dua domain kimia penting: domain DNA-mengikat dan aktivasi transkripsi domain. Domain ini mungkin menempati bagian yang terpisah dari molekul, atau mereka mungkin tumpang tindih. Dalam faktor GAL4 transkripsi dari ragi, misalnya, domain DNA-binding terletak dekat ujung amino polipeptida. Dua domain aktivasi transkripsi yang hadir dalam polipeptida ini, satu lebih atau kurang di tengah dan satu di dekat ujung karboksi. Dalam reseptor hormon steroid
protein, yang merupakan faktor
transkripsi pada hewan, domain DNA-mengikat terletak di pusat dan tampaknya tumpang tindih domain aktivasi transkripsi yang memanjangmenuju terminal amino. Reseptor hormon steroid juga memiliki domain ketiga yang secara khusus mengikat hormon steroid. Aktivasi transkripsi tampaknya melibatkan interaksi fisik antara protein. Faktor transkripsi yang telah terikat peningkat dapat melakukan kontak dengan satu atau lebih protein pada enhancer lain, atau mungkin berinteraksi langsung dengan protein yang telah terikat di wilayah promotor. Melalui kontak dan interaksi, domain aktivasi transkripsi faktor maka dapat menyebabkan konformasi perubahan dalam protein dirakit, membuka jalan bagi RNA polimerase untuk memulai transkripsi. Banyak motif rantai
yang
faktor
transkripsi
dihasilkan
polipeptida
mereka.
dari Salah
eukariotik
memiliki
hubungan
antara
satu
motif
ini
karakteristik asam
adalah
zinc
amino finger,
struktural dalam sebuah
lingkaran peptida pendek yang terbentuk ketika dua sistein dalam salah satu bagian dari polipeptida dan dua histidine di bagian lain di dekatnya bersama-sama mengikat ion seng; segmen peptida antara dua pasang asam amino kemudian menjorok keluar dari tubuh utama protein sebagai semacam jari (Gambar 19.7a).
GAMBAR 19.7 Motif Struktural dalam berbagai jenis faktor transkripsi. (A) motif Zinc-jari di mamalia yang transkripsi faktor SP1. (B) motif Helix-turn-helix di homeodomain sebuah faktor transkripsi. (C) A leusin motif ritsleting yang memungkinkan dua polipeptida untuk dimerisasi dan kemudian mengikat DNA. (D) A helixloop-heliks motif yang memungkinkan dua polipeptida untuk dimerisasi dan kemudian mengikat DNA. Analisis mutasi telah menunjukkan bahwa jari memainkan peran penting dalam DNA mengikat. Sebuah motif kedua di banyak faktor transkripsi adalah helix-turnhelix, hamparan tiga heliks pendek asam amino yang dipisahkan dari satu sama lain secara bergantian (Gambar 19.7b). Genetik dan biokimia analisis menunjukkan bahwa segmen heliks paling dekat dengan terminus karboksi diperlukan untuk DNA mengikat; heliks lainnya tampaknya terlibat dalam pembentukan dimer protein. Dalam berbagai faktor transkripsi, motif helixturn-helix bertepatan dengan wilayah sangat kekal dari sekitar 60 asam amino yang disebut homeodomain, dinamakan demikian karena terjadi di protein yang dikodekan oleh gen homeotik Drosophila.
Sebuah motif struktural ketiga ditemukan di faktor transkripsi adalah leucine zipper, hamparan asam amino dengan leusin di setiap ketujuh posisi (Gambar 19.7c). Polipeptida dengan fitur ini dapat membentuk dimer oleh interaksi antara leucines di setiap ritsleting mereka daerah. Biasanya, urutan ritsleting berdekatan dengan positif stretch dibebankan asam amino. Ketika dua ritsleting berinteraksi, ini daerah dibebankan melebarkan dalam arah yang berlawanan, membentuk permukaan yang dapat mengikat bermuatan negatif DNA. Sebuah motif struktural keempat ditemukan di beberapa faktor transkripsi adalah helix-loophelix, hamparan dua daerah heliks asam amino yang dipisahkan oleh sebuah lingkaran nonhelical (Gambar 19.7d). Itu daerah heliks memungkinkan dimerisasi antara dua polipeptida. Kadang-kadang motif helix-loop-helix berdekatan dengan hamparan dasar (positif dibebankan) asam amino, sehingga ketika dimerisasi terjadi, asam amino ini dapat mengikat untuk bermuatan negatif DNA. Protein dengan fitur ini ditandai HLH dasar, atau bHLH, protein. Pada prinsipnya, menggabungkan dengan polipeptida seperti diri untuk membentuk homodimers, atau mereka bisa menggabungkan dengan polipeptida yang berbeda untuk membentuk heterodimer. Kemungkinan kedua ini menunjukkan cara di mana pola yang kompleks ekspresi gen dapat dicapai. Transkripsi gen dalam jaringan tertentu mungkin tergantung pada aktivasi oleh heterodimer, yang dapat membentuk hanya jika polipeptida penyusunnya adalah disintesis dalam jaringan itu. Selain itu, dua polipeptida ini harus hadir dalam jumlah yang benar untuk mendukung pembentukan heterodimer selama sesuai homodimers.
modulasi
halus
dalam
ekspresi
gen
mungkin
karena
itu
dicapai
dengan menggeser konsentrasi dari dua komponen heterodimer.
Regulasi Ekspresi Gen Posttranscriptional Oleh RNA Interference RNAs noncoding dapat meregulasi ekspresi pada gen eukariotik melalui interaksi dengan messenger RNAs yang dihasilkan oleh gen tersebut. Meskipun banyak regulasi gen pada eukariotik terjadi pada tingkat transkripsi, penelitian
terbaru
telah
menunjukkan
bahwa
mekasinme
posttranscriptional
juga
memerankan peran penting dalam mengatur ekspresi gen pada eukariotik. Beberapa mekanisme ini melibatkan RNAs noncoding. Atas dasar pasangan dengan sequences target pada molekul messenger RNA, small RNAs ini yang mengganggu ekspresi gen. oleh karena itu, tipe regulasi gen
posttranscriptional disebut RNA interference, sering disingkat RNAi. Sebagian besar jenis organisme eukariotik memiliki RNAi. Diantara model organisme genetic, fenomena ini telah diteliti pada nematoda Caenorhabditis elegans, pada Drosophila, dan pada Arabidopsis. Hal ini juga terdapat pada mamalia, termasuk manusia. Kapasitas yang besar pada organisme eukariotik untuk meregulasi ekspresi gen oleh RNAi memungkinkan para ahli genetika untuk menganalisis fungsi gen pada organisme yang tidak setuju dengan pendekatan genetika standar. Jalur RNAi Fenomena RNA interference (gambar 19.8) melibatkan molekul RNA kecil yang disebut short interfering RNAs (siRNAs) atau microRNAs (miRNAs). Molekul tersebut memiliki panjang 21 sampai 28 pasangan basa, yang dihasilkan dari molekul RNA untai ganda oleh reaksi enzimatik dari untai ganda RNA-specific endonuclease. Karena endonuclease ini “dice/dadu” RNA besar menjadi potongan-potongan kecil, sehingga disebut Dicer enzim. Pada nematoda Caenorhabditis elegans menghasilkan satu jenis Dicer enzim; pada Drosophila menghasilkan dua Dicer enzim yang berbeda; dan pada Arabidopsis menghasilkan setidaknya tiga Dicer enzim. Dalam C. elegans dan Drosophila, enzim ini bertindak dalam sitoplasma; di Arabidopsis, mungkin bertindak dalam nukleus. siRNAs dan miRNAs dihasilkan oleh aktivitas seluruh panjang pasangan basa Dicer enzim kecuali 3’ bagian terakhir, dimana terdapat da nukleotida yang tidak berpasangan. Pada sitoplasma, siRNAs dan miRNAs menjadi bergabung ke dalam partikel ribonukleoprotein. Untai ganda siRNA atau miRNA pada partikel ini dilepaskan, dan salah satu untai istimewanyanya dieliminasi. Untai tunggal RNA yang tetap bertahan kemudian mampu berinteraksi dengan molekul RNA messenger tertentu. Interaksi ini dimediasi oleh pasangan basa antara RNA untai tunggal pada kompleks RNA-protein dan urutan komplementer pada molekul RNA messenger. Kerena interaksi ini mencegah ekspresi gen yang menghasilkan mRNA. Partikel RNA-protein ini disebut RNA-Induced Peredam Complex (RISC). RISCs dari organisme yang berbeda variasinya dalam hal ukuran dan komposisi. Namun, semuanya mengandung setidaknya satu molekul dari whimsically yang bernama protein Argonaute family. Fungsi dari protein-protein tidak sepenuhnya dipahami. Setiap kali pasangan basa antara RNA dalam RISC dan sequence target pada mRNA sempurna atau
hampir jadi, RISC yang membelah target mRNA di tengah-tengah area pasangan basa. mRNA yang dibelah kemudian terdegradasi. Setelah pembelahan, RISC bersatu dengan molekul lain dari mRNA dan menginduksi pembelahannya sendiri. Karena RISC dapat digunakan berulang kali tanpa kehilangan kemampuannya untuk menargetkan dan membelah mRNA. Berperan sebagai katalis. RISC bergabung dengan RNAs menghasilkan pembelahan mRNA yang biasanya disebut short interfering RNAs. Setiap RNA menghasilkan pasangan RISC yang tidak sempurna dengan sequence target, mRNA biasanya tidak dibelah, sebaliknya, translasi mRNA menjadi terhambat. RISC bergabung dengan RNAs yang dapat memberikan dampak disebut microRNAs. Pada hewan, sequence target oleh RISCs ditemukan pada 3’ area yang tidak ditranslasi dari molekul mRNA, dan sering terdapat (hadir) pada beberapa kali dalam 3’ area yang tidak ditranslasi (UTR). Pada tumbuhan, sequence target oleh RISCs biasanya terletak dalam area pengkode mRNA, atau dalam mRNAs 5’ UTR.
Sources Of Short Interfering Rnas And Micrornas Beberapa molekul RNA kecil yang menginduksi RNAi berasal dari transkrip gen microRNA. Gen-gen ini, biasanya dilambangkan dengan simbol mir. Gen-gen tersebut ditemukan di genom berbagai jenis eukariota; sekitar 100 gen mir yang hadir dalam C. elegans dan genom Drosophila, dan sekitar 250 yang hadir dalam genom vertebrata. Awalnya, beberapa gen ini diidentifikasi melalui analisis mutasi yang mengubah regulasi gen yang lain. Ketika gen mir didefinisikan oleh mutasi lalu dianalisis pada tingkat molekuler, mereka ditemukan memiliki potensi proteincoding yang sedikit atau tidak ada. Namun sebaliknya, mereka memiliki struktur aneh. Pada masing-masing gen terdapat bentangan pendek nukleotida berulang dalam orientasi yang berlawanan pada sekitar segmen singkat intervensi
dari DNA. Ketika ditranskrip, struktur tersebut menghasilkan RNA yang dapat melipat kembali pada dirinya sendiri untuk membentuk batang untai ganda pendek di dasar loop beruntai tunggal seperti pada gambar berikut:
Gambar tersebut menjelaskan mengenai regulasi ekspresi gen oleh interferensi RNA. (A) struktur Stem loop dari transkrip dari C. elegans microRNA gen lin-4. (B) Base-pairing antara microRNA berasal dari lin-4 transkrip dan urutan dalam 3 yang diterjemahkan dari wilayah lin-14 yang berasal dari RNA. Beberapa RNA yang menginduksi RNAi yang berasal dari transkripsi unsur-unsur lain dalam genom seperti transposon dan transgen, dan mereka juga berasal dari virus RNA. Para peneliti telah menemukan bahwa RNAi dapat juga disebabkan oleh untai ganda RNA yang telah dipersiapkan in vitro oleh transkripsi dari gen kloning atau gen segmen. DNA ditranskripsi di kedua arah dan ditempatkan antara promotor dalam orientasi yang berlawanan dalam vektor kloning yang cocok, atau dengan memasukkan salinan terbalik dari DNA hilir dari promotor tunggal. Gene Expression and Chromatin Organization Kromosom eukariotik terdiri dari bagian yang sama dengan DNA dan protein. Secara kolektif, kita menyebut bahan ini sebagai kromatin. Karakteristik kimia kromatin bervariasi sepanjang kromosom. Di beberapa daerah, misalnya, histon, yang merupakan sebagian besar protein dalam kromatin adalah asetil, dan di daerah lain, beberapa nukleotida dalam DNA adalah metil. Modifikasi kimia ini dapat mempengaruhi aktivitas transkripsi gen. Aspek lain
dari organisasi kromatin misalnya, kehadiran protein “packaging” berperan dalam regulasi gen. Pada bagian ini, kita memikirkan bagaimana komposisi dan organisasi kromatin mempengaruhi ekspresi gen EUCHROMATIN AND HETEROCHROMATIN Variasi kepadatan kromatin dalam inti sel mengarah ke diferensial pewarnaan bagian dari kromosom. Bahan pewarnaan yang mendalam disebut heterochromatin, dan pewarnaan ringan disebut eukromatin. Apakah jika ada dapat berfungsi
secara siknifikan untuk
membedakan tipe-tipe kromatin? Kombinasi analisis genetik dan molekuler telah menunjukkan bahwa sebagian besar gen eukariotik terletak di eukromatin. Apalagi ketika gen eukromatin secara artifisial dialihkan ke lingkungan heterokromatik, mereka cenderung berfungsi normal, dan, dalam beberapa kasus, tidak berfungsi sama sekali. Terganggunya kemampuan ini dalam fungsinya dapat membuat campuran karakteristik normal dan mutan pada individu yang sama, kondisi ini disebut sebagai posisiefek varigasi. Istilah ini digunakan karena variabilitas fenotip disebabkan oleh perubahan posisi gen eukromatin, khususnya dengan memidahkannya ke heterochromatin. Banyak contoh posisi-efek varigasi telah ditemukan di Drosophila, biasanya berkaitan dengan inversi atau translokasi yang memindahkan gen eukromatin ke heterokromatin tersebut. Alel berbintik-bintik putih adalah contoh yang baik. Dalam kasus ini, sebuah alel wild type dari gen putih telah dipindahkan oleh inversi, dengan satu dekat lokus putih eukromatin dan yang lainnya di bagian basal heterochromatin dari kromosom X. Penataan ulang ini mengganggu ekspresi normal dari gen putih dan menyebabkan fenotipe berbintik-mata ( Gambar 19.10). Rupanya, gen putih eukromatin tidak dapat berfungsi dengan baik dalam lingkungan heterochromatic.
Ini
dan
contoh
lainnya
telah
menyebabkan
pandangan
bahwa
heterochromatin merepresi fungsi gen, mungkin karena terkondensasi menjadi bentuk yang tidak dapat diakses oleh mesin transkripsi. Perilaku gen putih lalat dengan menyusun ulang kromosom X menunjukkan bahwa ekspresi gen dapat dipengaruhi oleh kondisi yang tidak mengubah urutan nukleotida gen. Selain itu, karena gen putih dinyatakan dalam beberapa daerah mata, tetapi tidak pada yang lain, kita tahu bahwa setelah kondisi ini dibentuk, mereka mewarisi pembagian clonally sel mata. Karena kondisi ini didukung pada struktur dasar dari gen putih, kita dapat menyebutnya epigenetik. Pada bahasa yunani "epi" berarti "di atas," dan dari sini digunakan untuk menyampaikan gagasan bahwa sebagian besar diwariskan dalam bentuk selain urutan sebenarnya gen regulasi dari ekspresi gen. Dalam hal ini, keadaan epigenetik diwariskan
dengan melibatkan beberapa aspek organisasi kromatin dekat dengan reposisi gen putih. Pada bagian berikutnya, kita akan menemukan contoh lain dari regulasi epigenetik ekspresi gen. MOLECULAR ORGANIZATION OF TRANSCRIPTIONALLY ACTIVE DNA Apakah yang dimaksud dengan organisasi molekular DNA transkripsional aktif? Apakah DNA ini lebih "terbuka" dari DNA nontranskribel? Pertanyaan-pertanyaan ini telah dijawab dengan mengukur sensitivitas dari DNA di kromatin untuk aksi deoksiribonuklease pankreas I (DNase I), suatu enzim yang memecah molekul DNA dan mengubahnya ke nukleotida penyusunnya. Pada tahun 1976, Mark Groudine dan Harold Weintraub menunjukkan bahwa DNA transkripsional aktif lebih sensitif terhadap DNase I dari pada DNA nontranskribsi. Groudine dan Weintraub mengekstrak kromatin dari sel darah merah ayam dan dicerna sebagian dengan DNase I. Kemudian mereka menyelidiki residu kromatin untuk mengetahui urutan dua gen, β-globin, yang aktif ditranskripsikan dalam sel darah merah, dan yang tidak adalah ovalbumin. Mereka menemukan bahwa lebih dari 50 persen dari DNA β-globin telah dirombak oleh enzim DNase I, dibandingkan dengan hanya 10 persen dari DNA ovalbumin. Hasil ini sangat tersirat bahwa gen aktif ditranskripsikan lebih "terbuka" untuk serangan nuklease. Penelitian selanjutnya menunjukkan bahwa sensitivitas nuklease gen transkripsional aktif tergantung pada setidaknya dua protein nonhistone kecil, HMG14 dan HMG17 (HMG untuk kelompok mobilitas tinggi, karena mereka memiliki mobilitas tinggi selama elektroforesis gel). Ketika protein ini dikeluarkan dari kromatin aktif, sensitivitas nuklease hilang, ketika mereka ditambahkan lagi, kembali seperti semula. Perlakuan pada isolasi kromatin dengan konsentrasi DNase I yang sangat rendah menyebabkan DNA akan dibelah di beberapa situs tertentu, yang disebut situs hipersensitif DNase I. Beberapa situs telah terbukti mengecoh awal gen transkriptional aktif, baik promotor atau wilayah enhancer. Fungsi yang signifikan dari situs-situs hipersensitif masih belum jelas, namun beberapa bukti menunjukka bahwa mereka dapat menandai daerah di mana DNA adalah locally unwound, mungkin karena transkripsi telah dimulai. Dalam kasus gen manusia untuk β-globin, beberapa situs hipersensitif Dnase I terletak di sepanjang 15-kb daerah kontrol lokus (LCR) awal dari gen itu sendiri (Gambar 19,11). Gen β-globin manusia berada di cluster yang mencakup 28 kilobases pada kromosom 11. Setiap gen dalam cluster adalah duplikat dari β-globin gen leluhur. Seiring waktu evolusi, gen individu dalam cluster telah menyimpang satu sama lain dengan mutasi acak sehingga hari ini, masing-masing dari mereka mengkode polipeptida yang sedikit berbeda. Dalam salah
satu gen, mutasi nonsense telah menghapuskan kemampuan untuk membuat polipeptida. Gen noncoding seperti ini disebut pseudogen, dan mereka biasanya dilambangkan dengan huruf psi Yunani demikian, (psi) β gen dalam cluster ini. Gen β-globin manusia diatur secara spasial dan temporal. Bahkan, fitur yang luar biasa dari cluster gen ini adalah bahwa anggotanya disajikan pada waktu yang berbeda selama pengembangan. Gen ε dinyatakan dalam embrio, dua γ gen diekspresikan pada janin, δ dan β gen muncul pada bayi dan orang dewasa. Aktivasi ini berurutan dari gen dari satu sisi ke sisi lain dalam cluster tampaknya terkait dengan kebutuhan untuk menghasilkan jenis yang sedikit berbeda dari hemoglobin selama perkembangan manusia. Embrio, janin, dan bayi memiliki kebutuhan oksigen yang berbeda, sistem peredaran darah yang berbeda, dan lingkungan fisik yang berbeda. Switching temporal ekspresi gen β-globin tampaknya merupakan adaptasi untuk berbagai perubahan kondisi. LCR dari cluster gen β-globin berisi situs yang terikat faktor transkripsi yang preactivate dari gen individu untuk transkripsi. Preactivation terdeteksi oleh peningkatan sensitivitas DNA dalam LCR untuk perombakan dengan konsentrasi DNase I yang rendah. Transkripsi gen β-globin tampaknya memerlukan preactivation ini dan dirangsang oleh faktor transkripsi yang mengikat enhancer spesifik di kompleks gen β-globin. Namun, jaringan dan spesifisitas temporal ekpresi gen β-globin tergantung pada urutan tertanamnya di LCR tersebut. Studi dengan tikus transgenik menunjukkan bahwa LCR bukan hanya koleksi besar enhancer yang melakukan kontrol atas berbagai gen β-globin. LCR harus terletak awal dari gen β-globin dan dalam orientasi alami untuk mengendalikan ekspresi gen. Artinya, berfungsi secara orientasi tergantung. Enhancer biasanya berfungsi secara orientasi-independen dan dalam posisi yang berbeda relatif terhadap promotor gen ini. LCR memiliki satu fitur lain yang membedakannya dari enhancer sederhana: ia dapat mengontrol ekspresi gen β-globin ketika seluruh cluster gen (LCR ditambah gen β-globin) dimasukkan dalam posisi kromosom yang berbeda. Enhancer, sebaliknya, sering gagal berfungsi saat mereka dan gen yang terkait yang dialihkan ke lokasi kromosom yang berbeda. Dengan demikian, LCR tampaknya mengisolasi gen β-globin dari pengaruh kromatin di sekitar mereka. CHROMATIN REMODELING Eksperimen yang menilai sensitivitas DNA untuk perombakan dengan DNase I telah menetapkan bahwa ditranskripsi DNA lebih mudah diakses pada nukleosom? Jika ya, apa
perubahan struktural terjadi di nukleosom selama transkripsi? Apakah nukleosom "membuka" dan "tertutup" sebagai RNA polimerase melewati sepanjang template DNA? Upaya untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan ini telah melibatkan kombinasi pendekatan genetik dan biokimia yang telah menunjukkan bahwa DNA ditranskripsi dan dikemas ke dalam nukleosom. Namun, dalam transkripsi DNA , nukleosom yang diubah oleh kompleks multiprotein yang pada akhirnya memfasilitasi tindakan dari RNA polimerase. Perubahan nukleosom ini dalam persiapan untuk transkripsi disebut kromatin remodeling. Dua jenis umum kompleks kromatin-remodeling telah diidentifikasi. Salah satu jenis terdiri dari enzim yang mentransfer gugus asetil dengan asam amino lisin pada posisi tertentu di histon dari nukleosom. Enzim ini disebut histon asetil transferase (HATs). Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa asetilasi histon berkorelasi dengan peningkatan ekspresi gen, mungkin karena penambahan kelompok asetil mengendurkan ikatan antara DNA dan octamers histone di nukleosom. Enzim kinase yang mentransfer gugus fosfat ke molekul, mungkin juga memainkan peran bersama dengan kompleks kromatin-remodeling tersebut. Hal ini diketahui, misalnya, bahwa asetilasi lisin-14 di histone H4 sering didahului oleh fosforilasi serin-10 dalam molekul itu. Bersama-sama, dua modifikasi ini histon H4 tampaknya "membuka" kromatin untuk meningkatkan aktivitas transkripsi. Tipe lain dari kompleks kromatin-remodeling mengganggu struktur nukleosom di sekitar promotor gen. Yang paling intensif dipelajari dari kompleks ini adalah kompleks SWI / SNF ditemukan di ragi roti. Kompleks ini adalah nama untuk dua jenis mutasi (switching-menghambat dan sukrosa nonfermenter) yang menyebabkan penemuan protein penyusunnya. Kompleks yang terkait telah ditemukan dalam sel-sel dari organisme lain, termasuk manusia. The SWI / SNF kompleks terdiri dari setidaknya delapan protein. Ini mengatur transkripsi dengan menggeser octamers histone sepanjang DNA terkait di nukleosom; itu juga dapat mentransfer octamers ini ke lokasi lain pada molekul DNA. Nukleosom dikatalisis oleh kompleks SWI / SNF rupanya memberikan akses transkripsi DNA. Faktor-faktor ini kemudian merangsang ekspresi gen ini. Kami telah membahas kromatin renovasi dari sudut pandang aktivasi gen. Namun, kromatin aktif juga bisa diremodeling menjadi kromatin tidak aktif. Remodeling terbalik ini tampaknya melibatkan dua modifikasi biokimia ke histon di nukleosom: deasetilasi, dikatalisasi oleh deacetylases histone (HDAC), dan metilasi, dikatalisasi oleh transferase histon metil (HMTs). Sebagaimana dibahas dalam bagian berikutnya, beberapa nukleotida dalam DNA juga dapat termetilasi oleh sekelompok enzim yang disebut DNA metil
transferase (DNMTs). Kromatin yang telah mengalami modifikasi ini cenderung transcriptional diam. Metilasi DNA Modifikasi kimia pada nukleotida juga penting terhadap regulasi gen pada beberapa eukariot, terutama mamalia. Dari sekitar 3 milyar pasangan basa pada genom mamalia, sekitar 40% adalah pasangan G:C dan sekitar 2-7 % dari jumlah tersebut sudah dimodifikasi dengan adisi gugus metil pada basa sitosin. Kebanyakan sitosin yang dimetilasi ditemukan pada pasangan basa doublet dengan struktur: dengan mC menyatakan methylcytosine dan p diantara C & G menyatakan ikatan fosfodiester di antara nukleotida yang berdekatan pada masing-masing strand DNA. Struktur ini sering disingkat dengan komposisi dari satu strand: mCpG. Dinukleotida mCpG dapat dideteksi dengan mencerna DNA dengan enzim restriksi yang sensitif terhadap modifikasi kimia pada sisi pengenalnya. Sebagai contoh, enzim Hpa II mengenali dan memecah sekuen CCGG, namun ketika sitokinin kedua para sekuen ini termetilasi, Hpa II tida dapat memecah sekuens tersebut. Jadi DNA yang termetilasi dan tidak memberikan pola yang berbeda dari fragmen restriksi ketika dicerna dengan enzim ini. Dinukleotida CpG terjadi lebih sedikit dari yang diperkirakan pada genom mamalia, kemungkinan karena mereka sudah termutasi menjadi dinukleotida TpG melalui proses evolusi. Distribusi nukleptida CpG tidak merata, dengan banyak segmen DNA pendek memiliki lebih banyak dinukleotida CpG dari pada region lain pada genom. Segmen kaya CpG tersebut, biasanya sepanjang 1-2 kb, disebut dengan pulau CpG. Pada genom manusia, ada sekitar 30.000 pulau, dan banyak yang terletak di dekat tempat transkripsi dimulai. Analisis molekular sudah mendemonstrasikan bahwa sitokinin pada pulau tersebut jarang termetilasi dan keadaan "undermethylated" kondusif terhadap transkripsi. Jadi DNA yang berada dalam wilayah pulau CpG hipersensitif pada terhadap enzim DNase I , dan nukleosomenya biasanya sedikit berbeda dengan nukleosom yang ada dalam region lain pada genom -biasanya kekurangan histon H, dan beberapa pusat histon terasetilasi. Ketika DNA termetilasi ditemukan, hal tersebut diasosiasikan dengan represi transkripsional. Hal ini paling banyak terlihat pada mamalia betina di mana kromosom X inaktif termetilasi secara ekstensif. Region region dr genom mamalia yang mengandung sekuen repetitif, termasuk juga region yang kaya akan transposable element, juga ttermetilasi kemungkinan sebagai cara untuk melindungi organisme dari efek delesi dari ekspresi transposon dan pergerakannya. Mekanisme yang menyebabkan DNA termetilasi menjadi "silent" ketika ditranskripsi masih belum diketahui; namun, ada sedikitnya 2 protein yabg
merepresi transkripsi yang dapat berikatan dengan DNA yang termetilasi dan salah satunya yaitu MeCP2 dapat menyebabkan perubahan pada struktur kromatin. Sangatlah mungkin bahwa dinukleotida mCpG berikatan dengan protein spesifik dan membentuk kompleks yang mencegah transkripsi dari gen tetangga. Keadaan termetilasi di transmit melalui pembelahan se. Ketika sebuah sekuens DNA ternetilasi, kedua strand dari sekuens tersebut memperoleh gubus metil. Setelah DNA termetilasi, masing-masing dupleks anakan akan memiliki 1 sekuen DNA parental yang termetilasi dan satu sekuen yang tidak. DNA methyltransferase, enzim yang melekatkan gugus metil pada DNA dapat mengenali keadaan asimetris tersebut dan menambahkan gugus metil pada sekuen yang tidak memiliki gugus metil. Jadi keadaan termetilasi dapat terbentuk pada dupleks anakan. Dengan cara tersebut, pola metilasi dapat ditransmit melalui replikasi DNA pada saat pembelahan sel. Metilasi DNA adalah modifikasi epigenetik dari kromatin. Asetilasi histon juga dapat dimasukkan pada modifikasi epigenetik walaupun masih belum jelas bagaimana pola asetilasi diturunkan melalui pembelahan sel. IMPRINTING Metilasi dna pada mamalia juga menangani masalah yg tidak biasa seperti pada ekspresi gen yang di kontrol oleh parental yang original. Contoh nya pada mencit, gen Igf2 yang mengkode faktor penumbuh seperti insulin di ekspresikan ketika diwariskan dari ayah tapi bukan dari ibu. Sebaliknya, gen H19 di ekspresikan ketika dari ibu bukan dari ayah. Ketika ekspresi gen tergantung pada kondisi parental origin, ahli genetik mengatakan bahwa gen tersebut mengalami “Imprinted” yang artinya suatu kondisi yang dimaksudkan untuk menyatakan bahwa gen tersebut telah ditandai dengan suatu cara sehingga gen tersebut dapat mengetahui asalnya dari parental yang mana. Analisis molekular terbaru menunjukkan bahwa suatu tanda yang mengkondisikan ekspresi gen adalah metilasi satu atau lebih dinukleotida CpG pada sekitaran gen tersebut. Dinukleotida yang bermetilasi terbentuk pada sel germinal parentalnya. Sehingga pada contoh gambar 19.13 gen Igf2 mengalami metilasi pada sel germinal betina tidak pada jantan. Ketika fertilisasi, hasil metilasi gen Igf2 yang berkontribusi secara maternal bergabung dengan gen Igf2 yang tidak metilasi dari pihak paternal. Selama embriogenesis, bagian yang metilasi dan tidak metilasi akan melindungi dirinya selama gen bereplikasi. Karena gen yang mengalami metilasi itu diam, hanya gen Igf2 yang berkontribusi secara paternal yang dapat di ekspresikan oleh hewan yang berkembang.
Kejadian sebalikanya terjadi pada gen H19 dimana metilasi terjadi pada sel germinal jantan bukan pada betina. Lebih dari 20 gen “imrinted” berbeda yang sudah teridentifikasi pada mencit dan manusia. Dimana imprin termetilasi dibentuk di sel germinal parental. Namun gen termetilasi yang diwariskan dari satu kelamin bisa menjadi tidak termetilasi ketika gen tersebut melintasi keturunan dari kelamin yang berbeda. Sehingga imprint termetilasi akan direset di tiap generasi, tergantung pada kelamin hewan tersebut. Fakta bahwa beberapa gen termetilasi di satu kelamin tetapi tidak di yang lainnya menyatakan bahwa faktor kelamin-spesifik mengontrol proses metilasi.
6. Aktivasi Dan Inaktivasi Keseluruhan Kromosom Organisme dengan sistem penentuan jenis kelamin XX/XY atau XX/XO menghadapi masalah dalam menyamakan aktivitas gen terpaut-X pada kedua jenis kelamin. Pada
mamalia, masalah ini diselesaikan dengan menonaktifkan salah satu dari dua kromosom X pada betina secara acak; oleh karena itu setiap individu betina memiliki gen terpaut-X yang aktif secara transkripsional dengan jumlah yang sama dengan jantan. Pada Drosophila, tak satu pun dari dua kromosom X pada betina yang tidak aktif; sebaliknya, gen pada kromosom X tunggal dalam individu jantan ditranskripsi lebih keras untuk memberika hasil yang sama seperti gen-gen pada dua kromosom X dalam individu betina. Masih solusi lain untuk masalah jumlah yang tidak sama dari gen terpaut-X yang telah ditemukan pada nematoda Caenorhabditis elegans. Pada organisme ini, individu XX adalah hermafrodit (mereka berfungsi sebagai jantan dan betina), dan individu XO adalah jantan. Aktivitas transkripsi terpaut-X disamakan kedudukannya dalam dua genotipe ini dengan represi parsial gen-gen pada kedua kromosom X dalam individu hermafrodit. Oleh karena itu, mamalia, lalat, dan cacing telah memecahkan masalah dosis gen terpaut-X dengan cara yang berbeda (Gambar 19.14). Pada mamalia, salah satu kromosom X pada betina tidak aktif; pada Drosophila, kromosom X tunggal pada jantan diaktifkan secara berlebih (hyperactivated); dan di C. elegans, kedua kromosom X pada hermafrodit yang sedikit diaktifkan (hypoactivated). Ketiga mekanisme yang berbeda dari kompensasi dosis yaitu inaktivasi, hiperaktivasi, dan hipoaktivasi-memiliki fitur penting secara umum: banyak gen yang berbeda diatur secara terkoordinasi karena berada pada kromosom yang sama. Pengaturan kromosom secara keseluruhan ini ditumpangkan pada semua mekanisme pengaturan lain yang terlibat dalam ekspresi spasial dan temporal gen-gen ini. Apa yang mungkin bertanggung jawab atas sistem regulasi global seperti ini? Selama beberapa dekade, ahli genetika telah mencoba untuk menjelaskan dasar molekuler kompensasi dosis. Hipotesis dikemukakan yaitu bahwa beberapa faktor atau faktor mengikat
secara khusus pada kromosom X dan mengubah
kegiatan transkripsinya. Penemuan terbaru telah menunjukkan bahwa hipotesis ini benar.
INAKTIVASI KROMOSOM X PADA MAMALIA Pada mamalia, inaktivasi kromosom X dimulai pada situs tertentu yang disebut pusat inaktivasi X (X Inactivation Center / XIC) dan kemudian menyebar pada arah yang berlawanan menuju ujung kromosom. Anehnya, tidak semua gen pada kromosom X yang inaktif tidak mengalami transkripsi. Salah satu yang tetap aktif disebut XIST (X inactive specific transcript); gen ini terletak di dalam XIC (Gambar 19.15). Dalam tubuh manusia gen XIST yang mengkodekan transkrip 17-kb tanpa ada frame baca terbuka yang signifikan. Oleh karena itu tampaknya tidak mungkin bahwa gen XIST mengkode protein. Sebaliknya, RNA sendiri mungkin adalah produk fungsional dari gen XIST. Melalui polyadenylasi, RNA ini dibatasi pada inti dan secara spesifik terlokalisasi untuk meng-inaktivasikan kromosom X; serta tidak muncul terpaut dengan kromosom X aktif baik pada jantan atau betina.
Pada mencit, analisis berdasarkan percobaan yang cukup rinci telah dilakukan, para peneliti telah menemukan bahwa gen homolog XIST manusia telah ditranskripsikan selama tahap awal saat perkembangan embrio pada tingkat rendah dari sepasang kromosom X yang ada pada wanita. Transkripsi dari setiap gen xist mencit betina masih tidak stabil dan tetap berhubungan erat pada gen masing-masing. Sebagai hasil dari pengembangan, transkrip dari salah satu gen akan menstabilkan dan pada akhirnya akan menyelubungi seluruh kromosom x pada lokasi gen tersebut, transkripsi dari gen Xist lainnya akan hancur, dan terjadinya transkripsi lebih lanjut adalah dari gen yang ditekan oleh keberadaan methylai nukleotida di gen promoter tersebut. Demikian pada mencit betina, satu kromosom X - salah satunya adalah gen Xist akan melanjutkan proses transkripsi – kromosom tersebut menjadi dilapisi dengan RNA xist dan pada bagian lainnya tidak. Kromosom yang akan dilapisi dengan gen xist tersebut dipilih secara acak. Meskipun mekanisme pelapisan tersebut masih belum terlalu dipahami, dampak dari mekanisme pelapisan tersebut nampaknya telah jelas: sebagian besar gen pada kromosom yang telah dilapisi kemudian ditekan, sehingga pada kromosom tersebut menjadi kromosom X yang tidak aktif. Sistem compensation dosis pada mamalia oleh karena itu kromosom X yang tetap aktif akan merepresi gen Xistnya. Kromosom X yang tidak aktif dapat segera diidentifikasi pada sel mamalia. Selama interfasi sel tersebut mengalami kodensasi sehingga menjadi lebih gelap perwarnannya dan terkait dengan massanya pada membrane inti. Pada berat jenis tersebut barr body akan
dikondensasi selama fase S untuk mengizinkan kromosom X yang belum aktif melakukan replikasi. Namun, karena dekondensasi memakan beberapa waktu, kromosom X yang belum aktif akan melakukan replikasi secara berulang pada kromosom yang tersisa. Kromosom X yang belum aktif harus memeiliki struktur kromatin yang berbeda daripada kromosom lainnya. Perbedaan tersebut sebagian ditentukan oleh protein histon yang terkait dengan DNA. Satu dari empat protein histon, H4, dapat secara kimiawi termpdifikasi dikarenakan bertambahnya kelompok asetil ke salah satu dari beberapa lisin pada raintai polipeptida. Asetat H4 dikaitkan dengan seluruh kromosom pada gen manusia. Namun, kromosom X yang belum aktif tampaknya akan dibatasi untuk tiga bands yang cukup sempit, setiap koresponden berada pada daerah yang berisi gen yang aktif. Asetat H4 juga habis pada daerah heterokromatin pada kromosom lainnya. Temuan ini menunjukka bahwa menipisnya asetat H4 adalah penyebab dari tidak aktifnya kromosom X.
HYPERAKTIVASI KROMOSOM X PADA DROSOPHILA Pada Drosophila, penggantian dosis membutuhkan protein yang diproduksi oleh setidaknya lima gen yang berbeda. Tidak adanya mutasi pada gen ini menghasilkan letalitas (kematian/lethality) yang spesifik pada jantan karena kromosom X tunggal pada jantan tidak dihiperaktivasi (tidak diaktivasi secara berlebihan). Jantan mutan biasanya mati ketika fase akhir larva atau fase pupa awal. Oleh karena itu, gen pengurang dosis ini disebut lokus male-spesific lethal/msl (lethal spesifik jantan), dan produknya disebut protein MSL. Antibodi yang disiapkan untuk melawan protein tersebut telah digunakan sebagai pengawas untuk melokalisir protein dalam sel. Sebuah temuan menyatakan bahwa tiap protein MSL berikatan secara spesifik pada kromosom X jantan (Fig. 19.16). protein ini tidak berikatan pada kromosom lain pada genom jantan, dan tidak berikatan dengan kromosom apapun, termasuk kromosom X pada genom betina. Berikatannya protein MSL pada kromosom X jantan difasilitasi oleh 2 tipe molekul RNA yang disebut roX1 dan roX2 (untuk RNA pada kromosom X) yang ditranskripsi dari gen-gen pada kromosom X. Model terikini menyatakan bahwa protein MSL membentuk suatu komplek yang tergabung dengan roX RNA. Komplek ini kemudian
berikatan pada 30-40 titik sepanjang kromosom X jantan, termasuk lokus yang mengandung 2 gen roX. Dari tiap titk ikatan, komplek MSL/roX menyebar secara bidireksional (2 arah) hingga mencapai semua gen pada kromosom X jantan yang perlu dihiperaktivasi. Proses hiperaktivasi bisa jadi mencakup remodeling kromatin oleh komplek MSL/roX. Salah satu protein MSL adalah protein histon asetiltransferase, dan versi histon H4 yang
diasetilasi
sangat
berhubungan
dengan
kromosom
X
yang
dihiperaktivasi.
HIPOAKTIVASI KROMOSOM X PADA CAENORHABDITS Pada C. elegans, perubahan dosis melibatkan represi parsial dari gen X-yang saling terhubung pada sel somatic hermafrodit. Mekanismenya belum dimengerti secara keseluruhan, namun produk dari beberapa gen terlibat. Seperti protein MSL pada Drosophila, proteon yang dikode oleh gen tersebut berikatan secara spesifik pada kromosom X. bagaimanapun, tidak seperti situasi pada Drosophila, protein tersebut hanya berikatan ketika 2 kromosom X ada. Protein tersebut rupanya tidak mau berikatan pada kromosom X tunggal pada jantan, maupun pada autosom pada jantan ataupun hermafrodit. Oleh karena itu, pengaturan dosis pada C. elegans sepertinya melibatkan mekanisme yang berlawanan denagn
mekanisme pada Drosophila. Komplek protein berikatan pada kromosom X dan merepresi transkripsi, bukan meningkatkannya.
Pertanyaan : 1. Mengapa model aksi enhancer dan silencer pada Eukariot menyerupai mekanisme regulasi operon ara E. coli? Lantas, bagaimana cara membedakannya? Jawab: Saat enhancer diletakkan pada gen, akan meningkatkan tingkat transkripsi gen. hal ini sama seperti prinsi CAMP-CAP pada regulasi operon ara E. coli dimana keberadaannya dapat membuat transkripsi terjadi. Hanya saja pada eukariot protein regulator yang terlibat lebih banyak. 2. Kapankah terjadi regulasi gen? Jawab: Selama perkembangan tanaman dan hewan, ekspresi gen kelihatannya diregulasi pada beberapa level yang berbeda, yaitu pada saat transkripsi, pemprosesan pre-mRNA, stabilitas mRNA, translasi, pemprosesan protein post translasi, stabilitas protein dan fungsi enzim. Akan tetapi, data yang ditunjukkan saat ini bahwa ekspresi gen pada dasarnya diregulasi pada level transkripsi dan pemprosesan pre-mRNA. Jelasnya, regulasi juga terjadi pada level- level lainnya. Regulasi pada level translasi adalah hal yang penting untuk kontrol keseluruhan proses metabolik pada makhluk hidup. Akan tetapi, mekanisme regulasi yang memiliki efek terbesar terhadap fenotip yaitu pada level transkripsi dan pemprosesan DNA.
