NAMA : FITRA ADI PRAYOGO NIM : 24020112130110 TUGAS RESUME KULIAH REKAYASA GENETIKA
RESUME 1 : PCR (Polimerase Chain Reaction) 1. PCR : Teknik memperbanyak atau mengamplifikasi suatu sekuens tertentu dari total DNA. 2. Prinsip Dasar : Reaksi polimerase berulang yang dimulai dari suatu primer yang dirancang khusus untuk memperbanyak sekuens target. 3. Primer : Oligonukleotida pendek sekitar 20 bp yang pada urutan basanya sama pada ujung-ujungnya. 4. Primer ada 2 : Primer Forward dan Primer Reverse. 5. Primer Forward : Menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5’ ------- 3’. 6. Primer Reverse : Menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 3’ ------- 5’. 7. Tahap Tahap PCR :
Pre-Denaturasi : Tahap ini merupakan tahap untuk mempersiapkan proses berikutnya, yaitu denaturasi (Pemanasan), Suhu yang digunakan 95°C. Hanya terdiri dari satu siklus selama 5 menit.
Denaturasi : Tahap pemisahan antara untai satu dengan yang lain sehingga masing – masing menjadi untai tunggal. Suhu yang dipakai 94°C. Proses yang tidak sempurna dapat memutuskan rantai DNA. Jika terlalu lama dapat menghilangkan aktivitas enzim polimerase.
Annealing : Tahap terpenting. Faktor yang mempengaruhi adalah suhu annealing dan primer. Suhu rendah dapat mengakibatkan primer tidak dapat melekat pada untai DNA dengan kurang sempurna. Suhu Tinggi dapat mengakibatkan salah sasaran, atau primer melekat pada urutan basa yang salah. Suhu melting annealing primer optimum dapat diukur dengan rumus Tm = 2 ( A+T ) + 4 ( G + C ). Setelah itu dari masing masing dikurangi 5°C ( Suhu = Tm - 5°C ). Lalu hasil keduanya dihitung rata – ratanya.
Ekstention : Proses pemanjangan untai DNA yang telah melekat pada primer. Suhu optimal yang dipakai 72°C, bertujuan untuk mengaktifkan Enzim Taq Polimerase. Enzim Taq Polimerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus. Penggandaanya n2.
Post PCR : Tahap ini hanya tahap optimalisasi proses running. Suhu 72°C, 1 Siklus, 7 Menit.
Finalizing : Tahap penyelesaian. Suhu 4°C.
8. Fungsi Penambahan :
ddH2O : Pelarut dalam PCR mix.
Buffer dream Taq : Penyangga larutan.
dNTP : Pembentuk Basa Komplementer dan Penyusun DNA. Terkandung DNA template, Sepassang Primer, dan campuran nukleotida. Berisi dATP, dGTP, dCTP, dTTP.
DNA template : cetakan DNA yang akan diamplifikasi. Berisi sekuens target untuk penempelan primer.
Taq Polimerase : Enzim Polimerase.
9. Faktor yang mempengaruhi :
PCR mix (DNA template, Enzim Polimerase, Buffer, dNTP, Primer)
Temperature Annealing
Panjang Siklus Tahap – tahap PCR.
10. Amplifikasi DNA : Metode untuk melipatgandakan untai DNA target.
RESUME 2 : Elektroforesis
1. Prinsip Kerja : Migrasi fragmen DNA yang bermuatan negatif ke kutub positif tangki elektroforesis melalui membran matrix gel agarose akibat dialiri medan listrik. 2.
Elektroforesis adalah teknik pemisahan senyawa yang memiliki muatan dengan
meletakkannya pada medan listrik. 3.
Gel yang digunakan Gel Agarose karena gel agarose memiliki kemampuan untuk
menampung ukuran fragmen yang lebih besar. 4. Gel agarose yang digunakan memiliki konsentrasi 0,8 %, karena dengan konsentrasi tersebut diharapkan ideal bagi ukuran fragmen yang dipakai pada praktikum ini. 5. Pada prinsipnya dalam memilih konsentrasi gel agarose semakin besar konsentrasi gel agarose yang digunakan semakin kecil ukuran fragmen yang dapat digunakan. 6. Running Elektroforesis ini bertipe Reptetion (Seperti Reptil). 7. Buffer TAE (50ml) : Memiliki fungsi sebagai penyangga dan media penghantar listrik yang tepat. 8. Loading Dye (1µl) : Berisi pelarut ddH2O, Pewarna Bromophenol Blue/Silen Silanol, pemberat Sukrosa/Gliserol. 9. Ethidium Bromida (EtBr) : Berfungsi untuk mengikat DNA dan menyebabkan DNA yang ada pada gel agarose dapat berpendar saat disinari UV. 10.Elektroforesis ada dua macam : Elektroforesis Horizontal dan Vertikal. 11.Berdasarkan jenisnya Elektroforesis terbagi menjadi dua, yaitu : Elektroforesis Zona dan Elektroforesis Bebas. 12.Elektroforesis Bebas : Molekul yang akan dipisahkan disebar ke seluruh permukaan gel, dan kemudian diliri listrik. Akibat aliran listrik tersebut akan membentuk batas diantara dua larutan.
13.Elektroforesis Zona : Molekul diletakkan pada zona – zona yang telah dibuat dan ditentukan, yang kemudian dialiri listrik. Akibat dari aliran listrik tersebut terjadinya migrasi. 14.Power Supply yang digunakan : 400mA, 90 V, 30 Menit. 15.Marker yang digunakan 3µl, 1 kb. 16.Faktor yang mempengaruhi Elektroforesis :
Ukuran Molekul DNA
Konsentrasi Gel
Bentuk Molekul
Arus Listrik dan Voltase
Arah Medan Listrik
Densitas Muatan
17.Gel Doc : Perangkat digital yang digunakan untuk mendokumentasikan hasil elektroforesis yang memanfaatkan sinar UV untuk memendarkan fragmen DNA. 18.Componen Gel Doc : Camera, Komputer (Software), dan Sinar UV.
RESUME 3 : Squencing
1. Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA yang relatif pendek . Pengurutan ( sequencing ) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetic dari molekul DNA. 2. Prinsip dasar : DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing. 3. Yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah: Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang)
seperti PCR
ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan
menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa. 4. Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA
Metode Maxam-Gilbert
Metode Maxam-Gilbert merupakan metode yang didasarkan atas pemotongan DNA didaerah spesifik oleh zat-zat kimiawi selain enzim. Akan tetapi, metode ini sekarang jarang digunakan .
Metode Sanger. Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun
1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP. 5. Komponen-komponen yang terlibat dalam proses squencing meliputi:
Beberapa kopi dari template DNA utas tunggal
Primer yang sesuai (sepotong DNA yang dapat berpasangan dengan DNA template yang bertindak sebagai titik mulai untuk replikasi)
DNA polymerase (suatu enzim yang meng-kopi DNA, menambahkan nukleotid baru pada ujung 3’ dari template)
Suatu ‘kolam’ berisi nukleotida normal
Sejumlah kecil dideoksinukleotida terlabel (radioaktif atau dengan pewarna fluoresent
6. Hasil dari skuencing adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang diperiksa. 5. DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) untuk mengetahui apakah individu tersebut membawa varian tertentu dari satu gen atau mengetahui adanya mutasi dan aplikasi lainnya.
RESUME 4 : Hibridisasi 1. Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNA–DNA, DNA–RNA, atau RNA–RNA dapat terbentuk melalui proses ini[1] .Hibridisasi DNA–DNA terbentuk dalam Southern blotting sedangkan hibridisasi DNA–RNA terbentuk dalam Northern blotting. 2.
RESUME 5 : Pustaka Genom dan cDNA
3. Genom dalam genetika dan biologi molekuler modern, adalah keseluruhan informasi genetik yang dimiliki suatu sel atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam nuklet yang memuat informasi tersebut. Secara fisik, genom dapat terbagi menjadi molekul-molekul asam nukleat yang berbeda (sebagai kromosom atau plasmid), sementara secara fungsi, genom dapat terbagi menjadi gen-gen.
4. Pustaka genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan. 5. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA genom yang dipelajari 6. DNA komplemen atau comlementary DNA (cDNA) merupakan DNA untai tunggal (single-stranded) sintetik/buatan yang disalin dari untai mRNA menggunakan teknik PCR dengan memanfaatkan enzim reserve transcription. Penggunaan cDNA ini sangat luas, terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika. mRNA berkas tunggal atau transkriptom bersifat tidak sabil karena mudah dicerna dan dilebur dalan sel. Pengubahan mRNA berkas tunggal menjadi cDNA membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah dilebur). 7. Sintesis cDNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim reverse transkriptase dan primer oligo dT yang akan menempel pada daerah ekor poli A yang merupakan ciri khas dari mRNA 8. Tahap sintesis: a) isolasi mRNA : mRNA yang digunakan merupakan hasil isolasi dari eukariot. mRNA digunakan karena lebih spesifik terhadap ekspresi gen yang dihasilkan. mRNA digunakan karena pada mRNA terdapat ekor polyA karena adanya proses poliadenilasi yang tidak dimiliki oleh RNA lainnya, seperti rRNA dan tRNA . b) visualisasi : menggunakan gel agarosa untuk mengetahui hasil isolasi. c) sintesis cDNA untai pertama : pada tahapan ini diperlukan enzim reverse transcriptase yang akan mengkatalisis sintesis pita tunggal DNA dari cetakan mRNA dengan bantuan primer oligo dT yang akan menempel pada poli A ujung 3’ dari mRNA. Kemudian, mRNA didegradasi dengan menggunakan ribonuklease atau larutan basa.
RESUME 6 : Particle Bombardment 1. Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metoda gene gun atau particle bombardment. Metode transfer gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau jaringan tanaman. Dengan cara partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam secara independen. Telah didemonstrasikan bahwa teknik ini efektif untuk metransfer gen pada bermacam–macam eksplan. Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan
sel selama
proses
penembakan berlangsung.
Penggunaan particle
bombardment membuka peluang dan kemungkinan lebih muda dalam memproduksi tanaman transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan turfgrass. 2. Particle bombardment Yaitu teknologi yang menggunakan metode penembakan partikel atau gen gun. DNA yang melapisi partikel ditembakkan secara langsung ke dalam sel atau jaringan tanaman (Klein et al.1988). Partikel yang mengandung DNA tersebut menembus dinding sel dan membran, kemudian DNA berdifusi dan menyebar di dalam sel secara independen. Metode transformasi dengan penembakan partikel pertama kali diaplikasikan pada jagung oleh Gordon-Kamm et al. (1990) dan berhasil mendapatkan jagung transgenik yang fertil.
RESUME 7 : Transformasi Agrobacterium tumefaciens
1. Transformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel tanaman, dimana pemulian tanaman dapat memasukkan gen asing kedalam sel atau jaringan tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk kepada tingkat hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis. Teknologi pemindahan gen atau transfer gen dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung Contohnya adalah perlakuan
pada
protoplas
tanaman
dengan
eletroporasi
atau
dengan polyethyleneglycol (PEG), penembakan eksplan gen dengan gene gun atau di
vortex dengan karbit silikon. Kedua yaitu tidak langsung contohnya adalah dengan bantuan bakteri Agrobacterium. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau bagain lain 2.
dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan
3.
suatu tanaman transgenik. Proses : Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat
diekspresikan tumbuhan. 4. Peran Agrobacterium sangat besar dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini ialah sebagai
pembawa gen (DNA) yang diinginkan. Agrobacterium tumefaciens
merupakan bakteri aerob obligat gram negatif yang hidup alami di tanah. Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit ini berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti) yang dijumpai dalam bakteri tersebut.
