Se estudia estudia la la cinética cinética de de una una enzima enzima en ausenc ausencia ia y presen presencia cia de un un inhibid inhibidor or A, a una concentración 10 mM. La velocidad inicial viene dada en función de la concentración de sustrato. Los datos obtenidos son: [S] (mM) 1.25 1.67 2.50 5.00 10.00
V (mM min- ) Sin inhibidor Inhibidor A 1.72 0.98 2.04 1.17 2.63 1.47 3.33 1.96 4.17 2.38
a. Dete Determ rmin ina a Vmax y KS en ausencia y presencia del inhibidor b. ¿Qué tipo tipo de inhibic inhibición ión se produc produce? e? c. Calcula la constante de disociación (K i) de la reacción de inhibición. Solución:
Graficar 1/v versus 1[S] 1.2 1 y = 0.8582x + 0.3369
0.8
1/Vo
0.6
1/Vi
0.4 y = 0.4843x + 0.1951
0.2 0 0
0.2
0.4
Sin inhibición V max =
1
1
= 5.13mM / min b 0.1951 K S = V max * (m ) = 5.13 * 0.4843 = 2.48mM =
Con inhibición app
K S app
1
1
= 2.97 mM / min b 0.3369 app = V max * (m ) = 2.97 * 0.8582 = 2.55mM
V ´max =
=
Comaprando:
0.6
0.8
1
app V max > V max app
K S ≈ K S
Por lo tanto es una INHIBICIÓN NO-COMPETITIVA K I =
[ I ] V max app V max
=
−1
10mM 5.13mM / min
= 13.75mM
2.97mM / min
−1
2. En un experimento se midió la tasa inicial de una reacción enzimática, v, a varias concentraciones de substrato [S] . La concentración de la enzima es 10 nM. Se graficó 1/ v versus 1/[S] y se observó una línea recta en la cual el intercepto- y es 0.005 nM-1 seg y la pendiente es 200 seg. ¿Cuál es el valor de K M y el de V max para esta reacción enzimática? ¿Cuál es el valor de k cat para esta enzima? ¿Determine el coeficiente de especificidad? 30 µM de un inhibidor, E, es adicionado y se observó que el intercepto-1 y es 0.0065 nM seg y la pendiente es 260 seg. ¿Qué tipo de inhibición se observó? ¿Cuál es el valor de K i para el inhibidor con esta enzima? Solución: Se observa que se utilizó la ecuación de Lineweaver-Burk 1 K M 1 1 v
=
V max [S ]
+
V max 1/v
1/Vmax
Los datos del problema son: m = 200 s -1 b = 0.005 s nM
KM /Vmax
-1/KM
V max =
1
= 200 ⋅ nM ⋅ s
1/[S] −1
0.005 K M = 200 ∗ V max = 200 ∗ 200 = 40,000 ⋅ nM
Sabemos que V max = k cat [ E ]t, por lo tanto V max 200 ⋅ nM ⋅ s −1 −1 = = 20 ⋅ s k cat = [ E ]t 10 ⋅ nM El coeficiente de especificidad es: k cat α =
K M
=
En presencia del inhibidor tenemos m = 260 s -1 b = 0.0065 s nM
20 ⋅ s −1 40,000 ⋅ nM
−1
−1
= 0.0005 ⋅ s nM
app
V max =
app M
K
1
= 153.846 ⋅ nM ⋅ s
0.0065 = 260 ∗ V max = 260 ∗ 153.846 = 40,000 ⋅ nM app K M = K M ,
Se observa que: Por lo tanto se trata de una
−1
y
app V max > V max
Inhibición no competitiva, entonces app
V max =
V max
[ I ] 1 + K i
Despejando K i
K i =
[ I ] V max app
V max
−1
=
30,000 200 153.846
= 100,000 ⋅ nM
−1
3. Para una reacción enzimática en presencia de un inhibidor competitivo, la velocidad de reacción observada a una concentración de sustrato [S]i = 1.5 x 10-3 M es igual a la velocidad de reacción sin el inhibidor a una concentración de sustrato [S]0 = 7.69 x 10-5 M. Calcule la constante de inhibición, Ki, del inhibidor si su concentración [I] = 3.7 x 10-4 M. Solución: Para un inhibidor competitivo la relación [ S ]0 a [S ]i para observar una misma velocidad es:
