UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN LICENCIATURA EN FARMACIA ASIGNATURA: GENÉTICA GRUPO: 1001 SEMESTRE: 2018- I REPORTE No. 2 “Aislamiento y purificación de DNA por la técnica de perclorato de sodio y electroforesis de DNA”
ASESORES: BQD. LARISA ANDRE GONZÁLEZ SALCEDO
EQUIPO 1: Aguirre Vidal Pablo Corpus Casias Gustavo García Ramírez Francisco Javier Salmerón Rodríguez Ángel Abdiel
FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE: 03 octubre 2017
Abstract
The DNA molecule is the carrier of genetic information, is the key of hereditary traits that are passed from the mother cell to daughter cells. Each individual has their own genetic information. In the experimental session we extract DNA from peripheral blood. For said extraction, we used the technical of perchlorate of sodium with the intention to meet and visualize the fibrilar estructure of DNA and its degree of packing in the cell nucleus. Once extracted DNA we proceeded to perform a horizontal electrophoresis for DNA using agarose gels which allowed separate, identify and purify DNA fragments. Keys words: DNA extraction, sodium perchlorate, electrophoresis DNA, agarose gels
Resumen
El DNA es la molécula portadora de la información genética, donde se encuentra la clave de los caracteres hereditarios que se traspasan de la célula madre a las células hijas. Cada individuo tiene su propia información genética. En la sesión experimental se realizó una extracción de DNA a partir de sangre periférica. Para dicha extracción se utilizó la técnica de perclorato de sodio, esto con la intención de conocer y visualizar la estructura fibrilar del DNA, así como su grado de empaquetamiento en el núcleo celular. Una vez extraído el DNA se procedió a realizar una electroforesis horizontal para DNA utilizando para ello geles de agarosa lo cual permitió separar, identificar y purificar fragmentos de DNA. Palabras clave: Extracción de DNA, perclorato de sodio, electroforesis de DNA, geles agarosa.
Objetivos
1. Llevar a cabo la extracción de DNA a partir de una muestra de sangre, mediante la técnica de perclorato de sodio, para revelar su estructura. 2. Realizar una electroforesis horizontal, mediante los conocimientos básicos, para conocer la concentración de DNA en una muestra sanguínea. Introducción
En la actualidad, el estudio de la variación genética entre individuos, poblaciones y especies para explicar patrones y procesos ecológico-evolutivos se aborda
mediante marcadores moleculares, segmentos de DNA con o sin función conocida que proporcionan información sobre la variación alélica y permiten distinguir individuos. La aplicación de técnicas moleculares inicia con la extracción de DNA y la obtención exitosa de datos confiables y reproducibles depende, en gran medida, de la extracción de DNA íntegro y puro. El DNA está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al
esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal.
La electroforesis es una de las técnicas más empleada en bioquímica y biología molecular, usada para separar y a veces purificar macromoléculas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, Cuando las moléculas cargadas son sometidas a un campo eléctrico, migran hacia el polo positivo (ánodo) como es el caso de los ácidos nucleicos.
La importancia de la obtención y purificación de material genético es recobrar el producto máximo de DNA de alto peso molecular lleno de libre de proteínas, fenol, e inhibidores de las enzimas de restricción de la Taq polimerasa.
Resultados Imagen 1. Resultados de electroforesis
M
1
2
3
5
4
5 4 3 2 1 M
En esta imagen se puede observar la migración de DNA a través de un Gel de agarosa. Imagen 2. Simulación de un Resultado correcto de electroforesis
Tabla 1. Resultados grupales de electroforesis
Equipo 1 2 3 4 5
Concentración (ng/μL)
112.18 147.3814 26.653 133.442 18.1
260/280 1.867 1.902 1.596 1.896 1.5008
En esta tabla se muestran los resultados obtenidos de electroforesis por cada equipo, teniendo así la concentración de DNA por cada muestra con una proporción 260/280.
Discusión
Inicialmente se realizó la extracción del DNA de una muestra sanguínea. La cual consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de DNA y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. Una de ellas es que los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción. En la sección practica se realizó la obtención de una capa de leucocitos para la obtención de DNA, resultado de centrifugar la muestra, a la que posteriormente se le agrego el buffer de lisis 1 que participa en la lisis de los eritrocitos presentes en la muestra. Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen (Alejos. L, Aragón .M y Cornejo. A). La adición del buffer, así como la centrifugación se llevaron a cabo hasta obtener una pastilla blanquecina y un sobrenadante transparente que nos indicaban que solo se tenía la presencia de leucocitos en la muestra. Por consiguiente, se agregó el buffer de lisis 2, para llevar a cabo la lisis de leucocitos y obtener el DNA contenido en ellos. Esta clase de buffer contiene EDTA, que forma un complejo con los iones de
Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNAsas (Enzima que cataliza la rotura de los enlaces fosfodiéster en el DNA). También para la extracción de DNA se emplea el uso de SDS que es un detergente que despolariza las proteínas, además de perclorato de sodio que precipita las proteínas asociadas al DNA. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al DNA en soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molécula. Pero, en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unión con cationes como Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucleótidos y permiten que el ADN precipite (Rada .t, Taboada. G. 1998). Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua estéril, el pH debe ser de 7 para permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. En la segunda parte de la práctica experimental se realizo la electroforesis de las muestras de DNA. El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por un campo eléctrico (Armendáriz, J.Sandoval, A. 2003).
Para realizar una electroforesis se requiere de una cámara de electroforesis que es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en donde se depositan las muestras, el gel sirve como medio de soporte con la finalidad de evitar perturbaciones mecánicas durante la separación. Los geles pueden ser de agarosa empleados para la separación de ácidos nucleicos, (gel empleado en la práctica), o poliacrilamida (separación de proteínas y ácidos nucleicos). Para la realización de la electroforesis se empleó TAE como buffer. El TAE constituye la mejor alternativa (en comparación al TBE) para el análisis electroforético de fragmentos grandes (> 20 kb) de DNA. Una de las desventajas del TAE como buffer de electroforesis es que no permite reciclarlo por más de tres corridas electroforéticas seguidas, a diferencia del TBE cuya efectividad permanece inalterada durante 3 o 4 días, sin importar el número de corridas electroforéticas realizadas. Se utilizó azul de bromofenol (u otro colorante como el xileno-cianol ) se usó como marcador del frente de avance de la electroforesis. Asimismo, su color es una ayuda visual durante la carga de muestra en los pocillos. En la electroforesis, por su menor tamaño, se mueve más rápido que las proteínas o que la mayoría de moléculas de DNA (siempre que éstas sean superiores a 300 pb), es decir, marca el "frente de avance". Puesto que su color azul-violeta es bien visible, permite detener la electroforesis con la confianza de que las moléculas de proteína o DNA no se hayan salido del gel. Tras la electroforesis, se visualizó el gel con una lámpara de luz UV, y se observaron diferentes bandas correspondientes a las muestras de DNA
aplicado y los marcadores de peso molecular. En la imagen 1 se pueden ver las bandas de las muestras de DNA de los 5 equipos, de los cuales se puede ver que ninguno puedo tener una banda bien identificada como esta en la imagen 2, ya que en esta nos muestra las distintas bandas y bien identificadas (por asi decirlo un resultado correcto de una electroforesis), lo que se puede decir de la imagen 1 de resultados experimentales, es que el marcador no pudo dar una banda correspondiente esto se puede deber a que este tipo de marcador pueda estar en malas condiciones o que ya esté en mal uso para su funcionamiento. Ahora las muestras de los equipos se puede observar gran cantidad de proteínas en la parte superior de todos las muestras, por lo que esta interfirió para que la muestra de DNA se mostrada en la banda, las muestras de los equipos 2, 3 y 4 bajaron partes pequeñas de muestra, esto no quiere decir que sea DNA, estos son fragmentos de RNA que pudieron colocarse en esa parte de las bandas anterior mente señaladas. Es importante señalar que las diferentes formas de ADN se mueven a través del gel a diferentes velocidades, el DNA plásmido superenrollado, debido a su conformación compacta, se mueve a través de la más rápida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal del mismo tamaño, con la forma circular abierta viajar el más lento. Al aplicar un marcador de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) puede ser calculado el tamaño aproximado del DNA en estudio. Se puede observar en la imagen 1 de las muestras de DNA que ninguna de estas corrio en primera posicion al lado del marcador de peso molecular, por lo cual no pudo determinarse el tamaño aproximado del DNA
Como parte final de esta práctica se realizó una cuantificación del DNA presente en nuestras muestras purificadas utilizando un espectrofotómetro EPOCH UV/Vis, el cual nos permitió en base a la espectrofotometría conocer la cantidad de DNA presente), se calculó la concentración de 112.18 ng/µL y ya haciendo los cálculos correspondientes nos dio un resultado de 5.609 x 10^-03 mg y esto nos demuestra la presencia de DNA y que la cantidad de DNA obtenida pudo variar por el volumen de sangre utilizado así como por errores en la aplicación de la técnica de purificación. Calculo 112.18 ng/ µL (50 µL) = 5609 ng convertimos a mg 5.609 x 10^-03 mg de DNA La concentración del ADN se puede calcular utilizando un espectrofotómetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, tal como se realizó en la práctica, debido a que las bases puricas y pirimidicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esa longitud de onda. Es importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de hidrogeno) el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario. La determinación de la pureza del ADN se estableció mediante la relación de las lecturas de las absorbancias de 260 y 280nm. Es así como una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50mcg/ml de ADN de doble cadena, a 40 mcg/ml de ARN y ADN de cadena simple y a 20 mcg de oligonucleótidos. Las preparaciones puras de ADN y ARN tienen una relación de DO 260/280 nm de 1.8 a 2.
Una parte importante en la cuantificación del DNA es el cociente 260/280, como el máximo de absorbancia de las proteínas es a 280nm, el cociente de absorbancias a 260/280 se utiliza para valorar la pureza del DNA en la disolución. Se consideran cifras óptimas de pureza aquellas que presentan n cociente de 1.7 a 2. Cocientes menores indican la presencia de proteínas en el medio y cocientes mayores indican la presencia de otras sustancias contaminantes como el etanol. (JIMENEZ, 2003). En base a esto se observa que nuestra muestra tiene un cociente dentro del valor considerado como optimo, indicándonos que la muestra tiene una pureza aceptable sin presencia de impurezas. CONCLUSIONES 1. Se logró realizar una extracción de DNA a partir de sangre periférica para la cual fue utilizada la técnica de perclorato de sodio, con dicha técnica fue posible observar la estructura fibrilar del DNA así como su empaquetamiento en el núcleo celular. 2. Se obtuvieron fibras de DNA con una muestra de sangre, obteniendo para ella en disolución una concentración de 112.18 ng/μL y lo que corresponde a 5.609 x 10^-03 mg de DNA en nuestra muestra.
3. Se evaluó la pureza del DNA purificado utilizando el cociente 260/280 de una técnica de espectrofotometría, con dicha técnica se reconoció que la primera disolución de DNA estudiada tiene una pureza
adecuada, mientras que la segunda disolución puede tener presencia de proteínas como impurezas. 4. Se conoció como evaluar el tamaño de las cadenas obtenidas por electroforesis y utilizando un marcador de peso molecular.
Referencias 1. Alejos, V., Aragón,
M. y Cornejo, A. (2010). Extracción y purificación de DNA [Archivo PDF]. Recuperado de http://www2.inecc. gob.mx/publicacio nes/libros/710/extr accion.pdf. Consultado 02-102016 2. Puerta, B. (1998). Prácticas de biología molecular. Ed. Javeriana. Madrid España. 3. Rada .t, Taboada. G. (1998).Métodos de obtención y purificación de ADN humano para su aplicación en genética molecular. Disponible en :http://www.ops.org.bo/text ocompleto/rnbiofa98060610.p df
