BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Belakang Kemaju Kemajuan an di bidang bidang biotek bioteknol nologi ogi tak lepas lepas dari dari berbag berbagai ai kontrov kontrovers ersii yang yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan. Rekayasa genetika genetika (Ing. genetic engineering ) dalam arti paling luas adalah penerapan
genetika untuk kepentingan manusia. Dengan pengertian ini kegiatan pemuliaaan hewan atau tanaman melalui seleksi dalam populasi dapat dimasukkan. Demikian pula penerapan mutasi buatan tanpa target dapat pula dimasukkan. Masyarakat ilmiah sekarang lebih bersepakat dengan batasan yang lebih sempit, yaitu penerapan teknikteknik genetika genetika molekular molekular untuk untuk menguba mengubah h susunan susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistem ekspresi genetik yang genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu. Obyek rekayasa genetika mencakup hampir semua golongan organisme, mulai dari bakteri, fungi, hewan tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuhtumbuhan. Bidang kedokteran dan farmasi paling banyak berinvestasi di bidang yang relati relatiff baru baru ini. ini. Sement Sementara ara itu bidang bidang lain, lain, sepert sepertii ilmu ilmu pangan, pangan, kedokt kedoktera eran n hewan, hewan, pertan pertanian ian (terma (termasuk suk petern peternakan akan dan perika perikanan) nan),, serta serta teknik teknik lingku lingkungan ngan juga juga telah telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Ilmu Ilmu terapa terapan n ini dapat dapat diangga dianggap p sebaga sebagaii cabang cabang biologi maupun sebagai ilmuilmu-ilmu rekayasa (keteknikan (keteknikan). ). Dapat dianggap, awal mulanya mulanya adalah dari usaha-usaha usaha-usaha yang dilakukan untuk menyingkap material yang diwariskan dari satu generasi ke generasi yang lain. Ketika orang mengetahui bahwa kromosom adalah material yang membawa bahan bahan terwar terwarisk iskan an itu itu (diseb (disebut ut gen) gen) maka maka itul itulah ah awal awal mula mula ilmu ilmu ini. ini. Tent Tentu u saja saja,, penemuan penemuan struktur struktur DNA menjad menjadii titik titik yang yang paling paling pokok pokok karena karena dari dari sinila sinilah h orang orang
1
kemudian dapat menentukan bagaimana sifat dapat diubah dengan mengubah komposisi DNA, yang adalah suatu polimer bervariasi. Tahap-tahap Tahap-tahap penting penting berikutnya berikutnya adalah serangkaian serangkaian penemuan enzim restriksi restriksi (pemotong) DNA, regulasi (pengaturan ekspresi) DNA (diawali dari penemuan operon laktosa laktosa pada prokariota), prokariota), perakitan teknik PCR, teknik PCR, transformasi genetik , teknik peredaman gen (termasuk interferensi RNA), RNA), dan teknik mutasi terarah (seperti Tilling). Tilling). Sejalan dengan penemuan-penemuan penting itu, perkembangan di bidang biostatistika biostatistika,, bioinformatika dan robotika/auto robotika/automasi masi memainkan peranan penting dalam kemajuan kemajuan dan efisiensi kerja bidang ini. Sekarang ini penggunaan metode molekuler telah sangat luas untuk analisis sel dan penentuan penentuan urutan urutan nukleotida nukleotida dari keseluruhan keseluruhan genom. Pengetahuan Pengetahuan mengenai aktivitas aktivitas DNA polymerase polymerase,, enzim restriksi restriksi dan DNA ligase melahirkan melahirkan teknik-teknik teknik-teknik kloning kloning DNA dan PCR (polymerase chain reaction) yang memungkinkan diisolasinya segmen DNA. Para ilmuwan ilmuwan juga telah mengembangkan mengembangkan alat dan metode untuk memurnikan memurnikan protein dan meneliti fungsinya. Makalah ini membahas tentang DNA Rekombinan.
B. Tujuan Tujuan Untuk mengetahui Teknologi DNA Rekombinan.
2
BAB II PEMBAHASAN
A. Enzim Restriksi Restriksi
1.Penemuan Enzim Restriksi
Pada Pada tahun tahun 1960an, 1960an, telah telah ditemu ditemukan kan sekelo sekelompo mpok k enzim enzim terten tertentu tu yang yang dapat dapat mendegradasi DNA dan menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari bakteriofage penginfeksi bakteri. Kelompok enzim ini, yang kemudian dikenal sebagai enzim restriksi (Restriction Enzyme), terbukti berperan sangat penting dalam penerapan teknologi DNA rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA. Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA (baca: double stranded DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences). Enzim yang berbeda dapat mengenali situs yang berbeda. Enzim yang dihasilkan oleh berbagai jenis bakteri dan secara alami berfungsi untuk melindungi bakteri dari inkorporasi DNA asing.
2. Penamaan Enzim Restriksi
Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan inangnya, misalnya EcoRI berasal dari bakteri E. coli. Dalam biologi molekuler, enzim restriksi biasanya digunakan untuk untuk analis analisis is kekerab kekerabatan atan,, rekaya rekayasa sa geneti genetika ka dan identi identifik fikasi asi suatu suatu molekul molekul DNA. DNA. Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses memproses DNA menjadi potongan-potongan potongan-potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi tertentu. Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks organisasi DNAnya dapat dipotong-dipoto dipotong-dipotong ng menjadi menjadi populasi populasi potongan potongan DNA dengan berbagai berbagai ukuran. ukuran. Sampai Sampai dengan dengan tahun tahun 1988an, 1988an, telah telah diketa diketahui hui hampir hampir 475 macam macam enzim enzim restri restriksi. ksi.
3
Situs pengenalan enzim restriksi kebanyakan terdiri dari empat basa atau enam basa, tetapi ada juga yang selain itu. Pada umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda, namun ada beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda memiliki situs pengenalan yang sama.
Enzim-enzim seperti ini disebut isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI MboI dan Sau3AI. Sau3AI. Walaupun situs pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin beda. Sekuen pengenalan biasanya sama urutan basanya pada kedua utas DNA bila dibaca dengan dengan arah arah yang yang sama. sama. Sekuen Sekuen ini disebut disebut palind palindrom romik. ik. Berdas Berdasark arkan an ujung ujung hasil hasil pemotongannya,
enzim
restriksi
dapat
memotong
dengan
ujung
lengket/lancip
(sticky/cohesive end) dan ujung tumpul (blunt end).
Enzim yang memotong pada edua utas tidak berhadapan langsung, tetapi selisih 2-4 basa menghasilkan potongan dengan ujung lengket sedangkan enzim yang memotong pada tempat yang berhadapan menghasilkan ujung tumpul contohnya adalah enzim SmaI. Hingga saat ini, paling tidak sudah terdapat ribuan enzim yang diperoleh dari berbagai jenis mikroorganisme. Beberapa di antaranya yang terkenal dan sering digunakan adalah enzim EcoRV, EcoRV, Hind III, III, SacI, SacI, TaqI, TaqI, BamHI, BamHI, MspI MspI dan lain-lain. Semua enzim tersebut dapat dibeli pada perusahaan-perusahaan bioteknologi dengan harga yang sangat bervariasi seperti Fermentas, Eppendorf, Sigma, Promega, Novagen dan Biogen.
3.Fungsi Enzim Restriksi Enzim Enzim Restri Restriksi ksi terbuk terbukti ti berper berperan an sangat sangat penting penting dalam dalam penerap penerapan an teknol teknologi ogi DNA rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA. Enzim Restriksi memiliki fungsi sebagai berikut: -
Digunak Digunakan an untuk untuk memoto memotong/ ng/men mendegr degradas adasii dsDNA dsDNA (baca: double double strande stranded d DNA) pada situs spesifik. Situs yang dipotong oleh enzim restriksi disebut situs pengenalan enzim (Recognition sequences).
-
Menghambat Menghambat (restri (restrict) ct) proses proses terjadiny terjadinyaa infeksi infeksi dari bakteri bakteriofage ofage penginfeks penginfeksii bakteri.
-
untuk melindungi melindungi bakteri bakteri dari dari inkorporasi inkorporasi DNA asing. asing.
4
4.Tipe Enzim Restriksi
Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya Selanjutnya,enzim ,enzim ini dimasukkan dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I. Banyak Banyak enzim serupa yang ditemukan ditemukan kemudian pada berbagai berbagai
spesies bakteri lainnya. Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim enzim terseb tersebut ut dari dari bakteri bakteri Haemophilus Haemophilus influenzae influenzae stra strain in Rd, dan dan seja sejak k saat saat itu itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut: 1. Mengena Mengenali li urutan urutan mengena mengenali li urutan urutan terten tertentu tu sepanj sepanjang ang empat empat hingga hingga tujuh tujuh pasang
basa di dalam molekul DNA
2. Mengenali Mengenali urutan tertentu tertentu sepanjang sepanjang empat hingga hingga tujuh pasang basa basa di dalam molekul DNA 3. memoto memotong ng kedua kedua untai molekul molekul DNA di tempat tempat tertent tertentu u pada atau di dekat dekat tempat pengenalannya 4. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi.
5
B. Enzim Ligase Ligase Enzim Enzim DNA ligas ligasee diguna digunakan kan untuk untuk menyam menyambung bung DNA.Pemotongan Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan potongan yang kompatibel. kompatibel. Artinya, Artinya, fragmen-fr fragmen-fragmen agmen DNA genomik genomik nantinya nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier. Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. vitro. Pertam Pertama, a, ligas ligasii menggun menggunaka akan n enzim enzim DNA ligase ligase dari dari bakteri bakteri.. Kedua, Kedua, ligasi ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau atau lazi lazim m dise disebu butt seba sebagai gai enzim enzim T4 liga ligase se.. Jika Jika cara cara yang yang pert pertam amaa hany hanyaa dapat dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan dipero diperoleh leh ujung ujung lengket lengket buatan, buatan, yang yang selanj selanjutn utnya ya dapat dapat diliga diligasi si menggu menggunaka nakan n DNA ligase. Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam). Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi.
6
Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang yang telah telah terpot terpotong, ong, serta serta pember pemberian ian moleku molekull linker linker,, moleku molekull adapto adaptor, r, atau atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.
C. Vektor 1. Karakteristik Vektor DNA Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu: a.
Mengand Mengandung ung asal asal replika replikasi si (origi (origin n of replica replicatio tion) n) yang memun memungki gkinka nkan n DNA
bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang. b.
Mengan Mengandung dung mark marker er selek selekti tiff yang yang menyeb menyebabk abkab ab sel sel yang yang memba membawa wa vector vector
(termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi c.
Memiliki Memiliki situs situs yang unik/khas unik/khas untuk satu atau lebih enzim restriksi. restriksi. Hal ini
menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
7
2. Macam-macam Vektor a. Plas Plasmi mid d Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan
fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri.Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular disebut plasmid. Molekul ini biasanya biasanya ditemu ditemukan kan pada pada banyak banyak bakteri. bakteri. Pada Pada banyak banyak kasus, kasus, DNA plasmi plasmid d membaw membawaa gen resistensi terhadap antibiotik. -
Bakt Bakter erio iofa fag g
-
Kosmid
-
Vekt Vektor or YACs YACs
-
Vekt Vektor or Yeps Yeps
-
Vekt Vektor or BAC BAC
D. Teknologi DNA Rekombinan 1. Pengertian Teknologi DNA Rekombinan Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui melalui isolas isolasii dan manipu manipulas lasii terhada terhadap p gen yang yang bertan bertanggun ggung g jawab jawab atas atas ekspre ekspresi si protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di lebih populer populer rekayasa genetika
dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA
rekombinan. rekombinan. Salah satu di antaranya, antaranya, yang mungkin paling paling representat representatif, if, menyebutkan menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan rekombinan adalah pembentukan pembentukan kombinasi kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
8
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen terten tertentu tu dalam dalam waktu waktu lebih lebih cepat cepat dan jumlah jumlah lebih lebih besar besar daripa daripada da produks produksii secara secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu (Gambar 9.1). Tahapan-tahap Tahapan-tahapan an tersebut tersebut adalah isolasi DNA genomik/krom genomik/kromosom osom yang akan diklon, diklon, pemotongan molekul DNA menja di sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekomb rekombina inan, n, transf transform ormasi asi sel inang inang menggun menggunakan akan molekul molekul DNA rekomb rekombina inan, n, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. 2. Teknik DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk: mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam
9
sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi: -
Teknik Teknik untuk untuk mengis mengisola olasi si DNA
-
Teknik Teknik untuk untuk memoto memotong ng DNA
-
Teknik Teknik untuk menggabung menggabung atu menyambung menyambung DNA
-
Teknuk untuk memasukkan memasukkan DNA ke dalam sel hidup
Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkatperangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah: enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.
1. Vektor,berupa plasmid plasmid bakteri atau viral ADN virus.
Gbr. Pembuatan plasmid dan mekanisme penyisipan gen
10
2. Bakteri, berperan berperan dalam perbanyakan plasmid plasmid melalui perbanyakan bakteri. bakteri.
Gbr. Pemisahan DNA oleh enzim restriksi
3. Enzim, Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI RESTRIKSI (pemotong (pemotong plasmid/ADN plasmid/ADN)) dan enzim Ligase (penyambung ptongan-potongan ADN)
11
Gbr. Proses produksi insulin manusia dengan rekayasa genetika E.Isolasi DNA DNA adalah molekul yang terdapat pada semua mahluk hidup. Molekul ini sangat kecil sehingga tidak dapat dilihat dengan mata. Tetapi DNA dapat diekstrak diekstrak dari ribuan sel sehingga DNA dapat terlihat karena jumlahnya yang sangat banyak. Tahapan dalam ekstraksi DNA adalah pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus dan pengendapan/presipitasi DNA. Ekstraksi DNA memiliki banyak aplikasi praktis, diantaranya adalah untuk tujuan pemuliaan, evolusi, sitematik, konservasi, dll. Dalam ekstraksi DNA tumbuhan, metode ekstraksi yang sering digunakan adalah berdasarkan Doyle dan Doyle 91989). Metode ini menggunakan buffer ekstraksi yang terdiri dari: 1. Elektroforesis DNA
Pemisahan Pemisahan DNA dilakukan dengan menggunakan menggunakan elektroforesis elektroforesis gel. Molekul Molekul DNA terpisah berdasarkan ukuran ketika dilewatkan pada matriks gel dengan aliran listri listrik. k. DNA memiliki memiliki muatan muatan negatif negatif,, dan saat saat berada berada dalam dalam aliran aliran listr listrik, ik, akan
12
bermigrasi melalui gel menuju kutub positif positif (Gambar 1). Molekul yang berukuran besar, memiliki memiliki kesulitan melewati pori-pori pori-pori gel sehingga bermigrasi bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. Setelah elektroforesis selesai, molekul DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent seperti ethidium yang berikatan dengan DNA dan berada di antara basa-basa DNA.
Gambar 1. Elektroforesis DNA dengan gel agarosa Dua alternatif alternatif macam gel adalah poliakrilamida poliakrilamida dan agarosa. Poliakril Poliakrilamida amida memiliki kapasitas resolusi yang lebih tinggi, tetapi gel poliakrilamida dapat memisahkan DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit. Jadi gel poliakrilamida dapat memisa memisahka hkan n DNA satu satu sama sama lainny lainnyaa yang yang berbeda berbeda ukuranny ukurannyaa hanya hanya beberap beberapaa atau atau bahkan satu pasang basa saja tetapi pada molekul yang berukuran beberapa ratus pasang basa saja (dibawah 1000 pasang basa). Gel agarosa memiliki resolusi resolusi yang lebih rendah tetapi dapat memisahkan DNA yang berukuran sampai puluhan kilo pasang basa. DNA yang berukuran sangat panjang tidak dapat melewati pori gel bahkan pori gel agarosa. agarosa. DNA yang sangat besar melewati melewati matriks dengan satu ujung bergerak bergerak lebih dulu sedang ujung lainnya mengikuti. Akibatnya DNA diatas ukuran tertentu (30 -50 -50 kb) bermigrasi bermigrasi dengan jarak yang sama sehingga sehingga tidak dapat diamati pemisahannya pemisahannya.. DNA 13
yang sangat panjang ini dapat dipisahkan satu sama lainnya dengan jika daerah listrik diaplikasika diaplikasikan n dalam ‘pulses’ ‘pulses’ yang berasal secara orthogonal satu sama lainnya. lainnya. Teknik ini disebut pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (Gambar 2).
Pulsed field gel electrophoresis Gambar 2. Pulsed field gel electrophoresis Elektrofor Elektroforesis esis juga digunakan untuk memisahkan memisahkan RNA. Seperti Seperti juga DNA, RNA memiliki muatan negative, tetapi molekul RNA merupakan molekul utas tunggal dan memiliki struktur sekunder atau tersier. Untuk mengatasinya, RNA diberi perlakuan dengan glyoxal yang bereaksi dengan RNA sehingga menghalangi pembentukan pasangan basa. RNA yang ter-glyoxylasi ter-glyoxylasi tidak dapat membentuk membentuk struktur sekunder atau tersier sehingga dapat bermigrasi dengan mobilitas yang proporsional terhadap ukurannya. ukurannya. Elektrofor Elektroforesis esis juga digunakan untuk memisahkan memisahkan protein dengan prinsip yang sama.
14
2. . Pemotongan DNA dengan Enzim Restriksi Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi molekuler umumnya mengenali urut urutan an basa basa yang yang pend pendek ek (4-8 (4-8 bp) dan dan memo memoto tong ng pada pada posis posisii tert tertent entu u yang yang tela telah h ditentukan ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. tersebut. Contohnya Contohnya adalah enzim EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama (I) ditemukan pada spesies ini. ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′. 5′-GAATTC-3′.
Gambar 1. Situs pengenalan enzim restriksi Jika molekul DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misaln misalnya ya oleh oleh HindII HindIIII yang yang mengena mengenali li urutan urutan 6pb (5′-AA (5′-AAGCT GCTT-3 T-3′), ′), atau atau dipoto dipotong ng dengan EcoRI, maka molekul DNA dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda (Gambar 4).
Jadi sebuah molekul akan
menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.
15
Gambar 2. Pemotongan DNA dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran yang bervariasi Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus Staphylococcus aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu satu kali kali dalam dalam 250bp. 250bp. Di sisi sisi lain lain terdapa terdapatt enzim enzim retrik retriksi si yang yang mengena mengenali li sekuen sekuenss oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Enzim restriksi tidk hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur hasil hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket (Gambar 3).
16
Gambar 3. Ujung lengket lengket dan ujung tumpul yang merupakan hasil hasil pemotongan pemotongan DNA dengan enzim restriksi 3. Hibridisasi DNA untuk mengidentifikasi molekul DNA yang spesifik DNA yang yang telah telah terden terdenatu aturas rasii memili memiliki ki kapasi kapasitas tas untuk untuk bergab bergabung ung kembal kembalii (untuk membentuk membentuk kembali pasngan basa di antara utas komplementer) komplementer).. Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan molekul hybrid saat homolog, DNA yang terdenaturasi dari dua sumber yang berbeda bercampur satu sama lain dalam kondisi kon disi yang sesuai kekuatan kekuatan ion dan temperatur temperaturnya. nya. Proses Proses perpasangan basa antara polinukleot polinukleotida ida utas tunggal yang komplementer disebut hibridisasi. Banyak teknik yang tergantung pada ke-khas-an hibridisasi antara dua molekul DNA dari sekuens yang komplementer. komplementer.
Sebagai contoh, hibridisasi hibridisasi merupakan dasar untuk
mendeteksi mendeteksi sekuens spesifik spesifik dalam campuran asam nukleat yang kompleks. kompleks. Dalam hal ini, ini, satu satu molekul molekul adalah adalah ‘probe’ ‘probe’ dari sekuen sekuenss terten tertentu tu (dapat (dapat berupa berupa sekuens sekuens yang yang dimurnikan dimurnikan atau molekul DNA yang disintesis disintesis secara kimia. Probe digunakan digunakan untuk mencari molekul yang memiliki sekuens komplementer dalam campuran DNA.
17
DNA probe harus dilabel, sehingga dapat dengan mudah diketahui lokasinya saat telah menemuk menemukan an sekuens targetnya. targetnya.
Campuran Campuran yang telah telah ter=probe ter=probe dipisa dipisahkan hkan
berdasarkan ukuran pada gel atau didistribusikan sebagai perpustakaan klon (library of clones) Gambar 6. Misaln Misalnya ya genom genom yeast yeast dipoto dipotong ng dengan dengan enzim enzim EcoRI EcoRI dan peneli peneliti ti ingin ingin menget mengetahu ahuii ukuran fragmen fragmen DNA yang mengandung gen yang diinginkan. diinginkan. Saat diwarnai diwarnai dengan etidium bromida, ribuan fragmen DNA yang dihasilkan dari pemotongan genom yeast dengan enzim restriksi berjumlah terlalu banyak sehingga tidak dapat dipisahkan menjadi ‘band’ DNA yang terpisah. terpisah. Mereka tampak ‘smear’. Teknik yang dianamakan Southern blot hybridization akan mengidentifikasi ukuran dari fragmen tertentu di antara smear DNA. Gel edirendam dalam larutan alkamli untuk mendenaturasikan double heliks. Fragmen ini kemudian ditransfer dari gel ke membrane yang bermuatan positif tempat DNA akan terikat. Setelah DNA tertransfer tertransfer pada membran, membran diinkubasi dengan probe yang mengandung sekuens DNA komplementer dengan sekuens yang diinginkan. ‘Probing’ ‘Probing’ dilakukan dalam kondisi kondisi konsentrasi konsentrasi garam dan temperatur temperaturee dekat dengan kondisi kondisi denaturasi denaturasi dan reanturasi reanturasi asam nukleat. nukleat. Dalam kondisi kondisi ini DNA probe akan berhibridisasi dengan kuat hanya dengan komplementer yang tepat. Media film atau media yang sensitif terhadap cahaya atau elektron yang dikeluarkan oleh DNA yang dilabel dapat mendeteksi lokasi probe berhibridisasi. Saat X-ray film diekspos ke filter filter dan di-develop, di-develop, maka akan menghasilkan menghasilkan autoradiogram autoradiogram dengan pola terekspos terekspos sama dengan lokasi hybrid (Gambar 1).
18
Gambar 1. Hasil probing DNA DNA
4. Kloning DNA
Kemampuan Kemampuan molekul DNA membentuk membentuk rekombinan dan menjaganya menjaganya dalam sel disebut disebut kloning DNA. Proses Proses ini melibatkan melibatkan vektor yang menjadi sarana sarana DNA untuk memperbanyak klon DNA dalam sel dan ‘insert DNA’ yang disisipkan di dalam vector. Kunci Kunci untuk untuk menghas menghasilk ilkan an moleku molekull DNa rekomb rekombina inan n adalah adalah enzim enzim restri restriksi ksi yang yang memotong DNA pada tempat spesifik dan enzim lain yang yang menyambung DNA yang terpotong terpotong dengan DNA lain. Dengan menghasilk menghasilkan an molekul DNA rekombinan yang dapat diperbanyak pada organisme inang, fragmen DNA tertentu dapat dimurnikan dan diamplifikasi untuk menghasilkan produk dalam jumlah besar.
19
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun maupun DNA vektor vektor,, khusus khususnya nya plasmi plasmid. d. Untuk Untuk memil memilih ih di antara antara kedua kedua macam macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan ikatan kedua kedua untain untainya ya dan mempuny mempunyai ai nisbah nisbah aksial aksial yang yang sangat sangat tinggi tinggi.. Perbed Perbedaan aan terseb tersebut ut menyeb menyebabka abkan n DNA plasmi plasmid d jauh jauh lebih lebih tahan tahan terhada terhadap p denatur denaturasi asi apabil apabilaa dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidiu etidium m bromid bromid akan akan menjad menjadika ikan n kerapa kerapatan tan DNA kromos kromosom om lebih lebih tinggi tinggi daripa daripada da kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan. a. Kloning DNA dalam plasmid vektor
DNa dipotong dengan enzim restriksi, kemudian dimasukkan ke dalam vektor untuk diperbanyak diperbanyak.. Inang (host) (host) yang umum digunakan untuk memperbanyak memperbanyak DNA adalah bakteri E. coli. coli. Vektor DNA memiliki tiga karakteristik yaitu: 1. Mengand Mengandung ung asal asal replik replikasi asi (origi (origin n of replic replicati ation) on) yang yang memungk memungkink inkan an DNA bereplikasi secara independen/bebas dari kromosom inang. 2. Mengandung Men gandung marker selektif yang menyebabkan sel yang membawa vektor (termasuk DNA yang dibawa) dapat diidentifikasi. 3. Memili Memiliki ki situs yang unik/kh unik/khas as untuk satu atau lebih lebih enzim enzim restriks restriksi. i. Hal ini menyebabkan fragmen DNA dapat disisipkan pada tempat tertentu dalam vector sehingga penyisipan tidak mengganggu kedua fungsi lainnya.
20
Vektor yang paling umum berukuran kecil (kira-kira 3 kb) merupakan molekul DNA sirkular sirkular disebut disebut plasmid. plasmid. Molekul Molekul ini biasanya biasanya ditemukan ditemukan pada banyak bakteri. bakteri. Pada banyak kasus, DNA plasmid membawa gen resistensi terhadap antibiotika. Memasukkan fragmen DNA ke dalam vector pada dasarnya merupakan proses yang mudah.
Misalnya plasmid plasmid memiliki situs pengenalan untuk EcoRI, maka vector
disiap disiapkan kan dengan dengan memoto memotongny ngnyaa dengan dengan Eco RI. Potonga Potongan n DNA yang akan diklon diklon kemudian disambungkan dengan bantuan DNA ligase (Gambar 1).
Gambar 1. Kloning DNA dalam plasmid vektor b. Vektor dapat dimasukkan ke organism inang melalui transformasi
Transformasi merupakan proses dimana organisme inang mengambil DNA dari lingkungan. Beberapa bakteri, bakteri, tetapi tetapi bukan E. coli dapat mengambil DNA secara alami dan dikatakan memiliki kompetensi genetik. E. coli dapat bersifat kompeten mengambil mengambil DNA melalui melalui perlakuan dengan ion kalsium. Antibiotika kemudian kemudian ditambahkan dalam medium untuk menyeleksi pertumbuhan sel yang mengambil DNA plasmid - sell ini disebut transforman. Sel yang membawa plasmid akan dapat tumbuh pada medium, sedang yang tidak membawa plasmid, tidak dapat tumbuh (Gambar 7).
21
c. Perpustakaan molekul DNA (DNA library) dapat dihasilkan melalui cloning
Perpustaka Perpustakaan an DNA merupakan merupakan populasi populasi vector identik yang masing-masing masing-masing berisi berisi insert yang berbeda. Untuk membuat perpustakaan perpustakaan DNA, DNA target dipotong dengan dengan enzim enzim restri restriksi ksi yang yang member memberika ikan n ukuran ukuran rata-r rata-rata ata insert insert yang yang diingi diinginkan nkan.. Ukuran insert dapat berkisar kurang dari 100 bp sampai lebih lebih dari satu megabase. DNA yang telah terpotong selanjutnya dicampurkan dengan vector yang sesuai (yang dipotong dengan enzim restriksi restriksi yang sama) dan ditambah ditambah ligase. Hal ini menghasilkan menghasilkan koleksi vector dengan insert DNA yang berbeda (Gambar 2).
Gambar 2. Pembentukan DNA library
Berbagai perpustakaan DNA dapat dihasilkan dengan menggunakan insert dari berbaga berbagaii sumber sumber.. Perpus Perpustak takaan aan DNA yang yang paling paling sederh sederhana ana dihasi dihasilka lkan n dari dari DNA genomik total yang disebut dengan ‘genomic libraries’.‘cDNA library’ dikembangkan untuk memperkaya memperkaya ‘coding sequences’ sequences’ dalam library. library. cDNA library library dibuat dengan menggunakan mRNA yang dikonversi menjadi DNA. Proses ini disebut reverse transcript transcription ion yang dilakukan dilakukan oleh enzim reverse reverse transcript transcriptase ase (Gambar 9). Saat diberi perlak perlakuan uan dengan dengan revers reversee transc transcrip riptas tase, e, mRNA mRNA dikonv dikonvers ersii menjad menjadii kopi DNA utas utas ganda yang disebut cDNA (copy DNA).
22
Selanjutnya, proses pembentukan library sama dengan pembentukan library pada DNA genomic. cDNA dan vector diberi perlakuan dengan enzim restriksi restriksi yang sama dan fragmen-fragmen hasilnya disambungkan ke dalam vektor.
Gambar 2. Pembentukan Cdna d. Hibridisasi digunakan untuk mengidentifikasi klon spesifik dari sebuah library
Identifikasi fragmen dari sebuah gen di antara klon-kon dapat dilakukan dengan menggunakan DNA probe yang urutan DNAnya sesuai dengan sebagian dari urutan DNA gen yang yang diingi diinginka nkan. n. Prose Prosess penggun penggunaan aan probe dengan DNA yang yang dilabel dilabel digunakan digunakan untuk melakukan screening screening terhadap terhadap library library disebut disebut colony hybridizatio hybridization. n. cDNA library akan memiliki ribuan insert yang berbeda dan masing-masing terdapat dalam vektot umum. Setelah Setelah transformasi transformasi ke dalam bakteri bakteri khusus yang cocok sebagai sebagai inang, sel ditumbuhkan ditumbuhkan dalam cawan petri dalam dalam media agar. Tiap sel akan tumbuh menjadi koloni dan tiap sel dalam koloni mengandung vector yang sama dan insert dari library, membrane filter dengan positive charge digunakan untuk probing.
23
Membran ditekan di atas koloni dan cetakan koloni aakan berada pada membrane. Selanjutnya dilakukan probing terhadap filter. filter. Filter yang mengandung sel diberi perlakuan yang memecah sel dan mengeluarkan DNA yang kemudian terikat pada filter pada lokasi yang sama sama dengan sel. Filter selajutnya selajutnya diinkubasi dengan probe. e. PCR (polymerase chain reaction)
PCR adalah sebuah teknik biologi molekuler untuk mereplikasikan DNA dengan menggunakan menggunakan enzim Taq polimerase. polimerase. PCR digunakan digunakan untuk mengamplifi mengamplifikasi kasi bagian DNA yang pendek (sampai (sampai 10 kb). Sejak ditemukan ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1983, teknik teknik ini telah telah melahi melahirka rkan n teknik teknik PCR-ba PCR-based sed marker marker teknik teknik lainny lainnyaa yang yang sangat sangat bervariasi. Protokol dasar PCR adalah: 1. DNA utas ganda didenatur didenaturasi asi pada suhu 95C sehingga sehingga membentuj membentuj DNA utas yang berfungsi sebagai cetakan. 2. DNA utas tunggal yang pendek (disebut primer) berikatan berikatan dengan DNA cetakan pada temperature temperature rendah. Ikatan Ikatan preimer terjadi pada utas yang komplemente komplementerr dengan cetakan pada daerah ujung batas sekuen DNA target. 3. Suhu ditingkat ditingkatkan kan menjadi menjadi 72C sehingga sehingga enzim enzim DNA polymer polymerase ase dapat melakuka melakukan n sintesis DNA membentuk utas ganda DNA baru. 4. Utas Utas ganda ganda DNA yang baru baru disint disintesi esis, s, didenat didenatura urasi si pada suhu tinggi dan siklus siklus berulang.
24
Gambar 10 menunjukkan menunjukkan proses PCR. Produk PCR diamati diamati dengan gel elektroforesi elektroforesiss dengan menggunakan gel agarose ataupun gel poliakrilamida dan diamati dengan uvtransiluminator.
Gambar 1. Proses PCR
25
BAB III PENUTUP
A. Kesimpulan Kesimpulan Berdasarkan hasil pembahasan, dapat disimpulkan bahwa: Teknik dari Teknologi DNA Rekombinan terdiri dari: - Teknik untuk mengisolasi DNA - Teknik untuk memotong DNA - Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
B. Saran Saran Dengan mempelajari Biologi Molekuler diharapkan kita bisa menerapkan berbagai teknologi untuk hal-hal yang lebih berguna.
26
DAFTAR PUSTAKA
Sambrook, Sambrook, J., Fritsch, Fritsch, E.F., Maniatis, Maniatis, T. 1989. Molecular Molecular cloning. cloning. A laboratory laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab Press, USA. Watson Watson,, J.D., J.D., T.A. T.A. Baker, Baker, S.P. S.P. Bell, Bell, A. Gann, Gann, M. Levine, Levine, R. Losick Losick.. 2008. 2008. Molecu Molecular lar Biology of The Gene. Pearson Education, Inc, San Francisco
27