Reacciones multisustrato
Hay muchas enzimas de este tipo en la célula (1S * 2P; 2S * 1P; 2S * 2P; 3S). Hay que tener en cuenta que los coenzimas se contailizan como sustratos! as" #eremos an$lisis de reacciones con %&'! por eemplo. Reacciones bisustrato
'entro de todas estas! nosotros analizaremos de orma cinética las reacciones isustrato. Principalmente trataremos de los mecanismos de reaccin con la terminolo+"a de ,leland. -l estudio cinético de estos modelos es sencillo si las enzimas se austan a una cinética micaeliana. Podemos determinar este comportamiento mediante un estudio de #elocidad an$lo+o a los realizados anteriormente! sal#o que ahora! al tener #arios sustratos! hacemos que #ar"e uno de ellos! deando el resto constante y saturante. a #elocidad entonces se hace independiente de la concentracin de los dem$s sustratos! d$ndonos si es el caso! un cinética hiperlica. Hay #arios modelos! pero estudiaremos estos dos! los mayoritarios.
Mecanismo ping"pong, o de desplazamiento doble. Consiste en la formación
de dos complejos binarios, presentando la característica de no requerir que primero entren los sustratos y luego los productos. Se trata, por tanto, de la entrada de uno de los sustratos, quedándose la enzima con alguna parte del sustrato, saliendo el resto como un primer producto. Una vez tengamos !, se une el segundo sustrato, que recibe esa parte que tomó la enzima, resultando un segundo producto. "ay que tener en cuenta que ese #algo$ que se lleva la enzima para luego pasárselo al segundo sustrato puede ser desde un grupo funcional relativamente grande, %asta un electrón, como ya veremos.
Mecanismo secuencial, o de desplazamiento simple. Se caracteriza por la
formación de un complejo ternario y dos binarios, además, de por la entrada de los dos sustratos primero y la salida a continuación de los dos productos. &sí como en el modelo anterior no es difícil encontrar un orden, ya que aquel sustrato que posea el grupo a transferir deberá ser el primero, en este caso se complica bastante. 'e %ec%o, e(isten dos tipos. l modelo secuencial ordenado, en el que siempre los sustratos y los productos presentarán un mismo orden de entrada y salida y uno al azar, en el cual podrán entrar y salir los sustratos y productos de forma aleatoria, pudiendo la enzima escoger el camino deseado para escoger sustrato independientemente de la salida que tendrán los productos, que tambi)n será aleatoria. n de*nitiva, podrá elegir el mecanismo de acción. -stos tres modelos son los mayoritarios y los que estudiaremos. Cinética de las reacciones bisustrato
&ntes de presentar la ecuacin de de &lerty! &lerty! que cumplen todos todos los modelos! hay que hacer hincapié en la cinética micaeliana de estas reacciones. ,omo ya hemos dicho! si hacemos un
sustrato #ariale manteniendo el otro constante y saturante! otendremos una hipérola rectan+ular correspondiente al modelo /0/ (siempre que tratemos con una enzima micaeliana! si es alostérica e#identemente no nos dar$ esta representacin). -n esa cur#a o mediante linearizaciones podremos determinar las constantes ma y m! pero estas ser$n aparentes si la concentracin del sustrato constante no es saturante. -sto es l+ico! ya que entonces la #elocidad m$ima no podr$ alcanzarse al no estar ocupada toda la enzima con el sustrato (compleo que considerar"amos -a). 4eniendo esto claro! #eamos ahora la ecuacin +eneral de &lerty.
Como dato, decir que el termino entra par)ntesis del denominador, no aparece en el mecanismo +ing+ong. sto nos permitirá en el futuro discriminar un tipo del otro. n esta ecuación aparecen t)rminos, que aunque se entiende de forma conceptual, es conveniente que los describamos•
KmA- Se trata de la constante de ic%aelis para el sustrato & cuando mantenemos
constante y saturante /01. •
KmB- Se trata de la constante de ic%aelis para el sustrato 0 cuando mantenemos
constante y saturante /&1. •
KsA- Se trate de la constante de disociación del primer complejo binario &, el cual
obtenemos en el modelo secuencial ordenado2. •
KsB- Se trata de la constante de disociación del complejo primario 0, el cual
obtenemos en el modelo secuencial al azar. n el modelo ordenado no tiene ning3n sentido describirlo, sólo nos servirá como medio para determinar el orden, aunque %abrá otros. Como nota, %ay que apuntar que en el mecanismo secuencial al azar se cumple la siguiente relación- KsA · KmB = =KsB · KmA. +or tanto, podríamos sustituir un producto por el otro en la ecuación general de &lberty, evidentemente, sólo en los casos correspondientes a un modelo secuencial al azar. •
Vmax- Será igual determinada con & o con 0 variable, siempre y cuando, el otro
est) en condiciones constantes y saturantes. +ara asegurar esta representación %iperbólica a /01 constante, realizamos la transformación de la ecuación general de &lberty, al igual que lo %abíamos %ec%o en otras ocasiones. l resultado nos muestra claramente la dependencia de 4!ma( de la concentración de sustrato al igual que 5!m&. stas constantes corresponderían a las obtenidas cuando el sustrato constante no llega a la saturación. Si %acemos /01 constante y saturante
5m0 del denominador 6para 4!ma(2 se %ace despreciable frente a /01, de modo,
que podemos eliminarla. l resultado, .
l producto 5s& 7 5m0 6para 5!m&2 y 5m& del numerador y 5!m& del denominador se %acen despreciables frente a /01, pudiendo eliminar esta
concentración. l resultado, . Discriminación entre Ping"Pong y secuencial. Determinación de los parámetros cinticos
Como ya %emos visto en la in%ibición, mejor que en la representación %iperbólica, utilizamos las linearizaciones para estos menesteres. &l igual que durante toda la asignatura, utilizaremos la representación de "anes8oolf. Ping"Pong
9ecordemos que en este modelo, no aparece en el divisor el producto 65s& 7 5m02 con lo que la linearización sería la siguiente para el ejercicio : de la %oja ;, donde /<&'"1 = /&1 y /<>?1 = /01.
Se observa como la ordenada en el origen no es dependiente de !B# y por eso las rectas tomadas a di$erentes %alore constantes de &'(" se cortan en el e)e Y . Se asemeja, por tanto, al patrón de in%ibición acompetitiva, pero no tiene a*solutamente nada +ue %er , ya que en este caso, y como marcan las
@ec%as, la pendiente decrece al aumentar la /01. Sobre esta grá*ca, si que es preceptivo el determinar las constantes cin)ticas, algo que no podremos %acer directamente al carecer de datos. Si nos *jamos en la pendiente y en la ordenada en el origen, ambas dependen de 4ma(, dato que no tenemos y que %abrá que calcular mediante las representaciones secundarias.
n este caso, ya que no nos interesa el corte en X , representaremos la otra variación que observamos, la de la pendiente, y la representamos frente a la inversa del sustrato que la %ace variar, /01. Siguiendo con el ejercicio :, el resultado sería el siguiente. Aracias a la ecuación de la recta podemos determinar
4ma(- +or la ordenada en el origen, B4ma(.
5m0- +or el corte en X , B 5m0.
Dodo esto, sobre todo 4ma(, nos permitirá calcular el valor de 5m& por la ordenada en el origen de la representación primaria, 5m&4ma(. E con esto, ya tendríamos todas las constantes. Dambi)n se e(plica este procedimiento en el propio ejercicio : de la %oja ;. &demás de la enzima del ejercicio, tambi)n presenta este modelo cin)tico la cetoacilCo&transferasa, que pasa Co& del succinilCo& al acetato, dando como productos ácido succínico y acetoacetilCo&. videntemente, como ya dijimos, este modelo no deja muc%as dudas acerca del orden, ya que la mol)cula que porta el grupo a transferir debe ser la primera en entrar dejándoselo a la enzima, que pasará a ser ! al soltar el primer producto. 'espu)s ! pasará a recoger el segundo sustrato, aquel que tiene recibir en grupo. ,ecuencial
Si para distinguir el modelo +ing+ong, decíamos que linearizábamos la ecuación general de &lberty, es evidente que debemos %acer lo mismo en este caso. Fa gran diferencia que podemos visualizar mediante la representación, es la ordenada en el origen, que varía al ser dependiente de la concentración de cosustrato constante. sto es debido a la aparición del producto 65s& 7 5m02 en la ecuación general. +ara poner un ejemplo, escogemos el ejercicio G de la %oja ;, donde /alato1 = /&1 y /<&'H1 = /01.
l t)rmino entre par)ntesis será entonces la pendiente de la recta, mientras la ordenada en el origen incluye los dos 3ltimos sumandos, que incorporan, como ya %emos dic%o /01. Fa representación será, al igual que en el caso anterior, /&14 4s /&1. &l depender la ordenada en el origen de /01 su valor se modi*cará en cada recta, como se observa en la grá*ca. -sto será# por tanto# lo +ue utiliaremos para di$erenciar el modelo secuencial# el /ec/o de modi0carse las pendiente y las ordenadas en el origen en $unción de la concentración de cosustrato.
&l igual que sucedía en el modelo +ing+ong, la complejidad de la pendiente y de la ordenada en el origen, %ace que no podamos calcular ninguna constante en esta representación, si e(ceptuamos 5s&. sta constante se determina mediante el valor de x en el punto de corte de las rectas. +ara conseguir estos valores debemos recurrir, por tanto, a la representación secundaria. n este caso tenemos dos parámetros que varían con respecto a /01, la pendiente y la ordenada en el origen, siendo necesaria la representación de ambas rectas pera determinar todos los parámetros. sto es así ya que no obtenemos un valor limpio para 4ma( %asta la representación de las pendientes. Fa determinación de las constantes, para el mecanismo secuencial, se resume en la siguiente tabla. n la representación secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01. +or el corte de la
Vma recta con el eje Y . >tras muc%as formas, pero en este caso es un cálculo directo, necesario para calcular las demás constantes. x
Km A
n la representación secundaria ordenada 6Bria2 4s B/01. +or el corte de la recta con el eje Y . ediante el valor de la y del punto de corte de las rectas a distintas concentraciones de 0 en la representación primaria
n la representación primaria /&1 4 4s /&1. 4alor de la x del punto de corte de las rectas a distintas concentraciones de 0. +or la pendiente de la KsA representación secundaria ordenada 6Bria2 4s B/01. Km B
+endiente de la representación Bria, de la secundaria ordenada 6Bria2 4s B /01 y secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01, además de corte con el eje X de la representación secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01.
Discriminación entre ordenado y al aar
Ea sabemos entonces que la representación /sustrato variable14 4s /sustrato variable1 nos sirve para distinguir entre el modelo +ing+ong y secuencial, pero dentro de este 3ltimo %ay dos posibles forma de organización, el modelo secuencial ordenado y al azar.
Una forma de discriminar ente uno y otro es la in%ibición, es decir, el tipo de in%ibición reversible que produce un producto de la reacción, manteniendo un sustrato variable y el otro constante. stas variaciones son dependientes del orden. sto nos permite formar un patrón de in%ibición, el cual se representa en la tabla de las %ojas. Fa más característica es, sin duda la del secuencial al azar, que presenta todas las variantes como competitiva. sto es fácil de e(plicar, ya que si los dos sustratos y los dos productos no tienen una disposición de entrada y salida *ja, querrá decir que + y I podrán salir y unirse a la enzima aleatoriamente, o lo que es lo mismo, que ambos serán complementarios del C.&. sto mismo sucederá con los sustratos. &&, 6independientemente de a quien llamemos &, 0, + o I2 nos dio la siguiente grá*ca. "ay que recordar que los diferentes tipos de n%ibición reversible se diferenciaban de forma visible en las linearizaciones, como esta de "8, en la cual se in%ibe a diferentes concentraciones. Fas diferencias en la pendiente, la ordenada en el origen o ambas nos mostrarán el tipo de in%ibición. n el ejemplo %emos in%ibido con >&& manteniendo constante el cosustrato <&'H. s importante no adjudicar a nadie las letras, ya que imagin)monos que llamamos al malato & y al >&& I, entonces no nos encajaría en patrón mi(to en ning3n modelo, y aunque en este
caso, nos diría de forma evidente que el malato no entra primero, o que el >&& no es el 3ltimo en salir, tambi)n podría llevarnos a un error muy grave. s, por tanto, importante el mantener el orden a un lado, y %acer 3nicamente referencia a los nombres reales de los sustratos. 4olviendo al ejemplo, el patrón mi(to, sabiendo por el apartado anterior que es secuencial nos muestra de forma inequívoca, independientemente del orden, que se trata de un proceso ordenado, al no presentar el modelo al azar in%ibición mi(ta. 'rden de entrada y salida1 2ntercam*io isotópico en el e+uili*rio
Una vez sabido si es +ing+ong o secuencial ordenado 6es una estupidez intentar determinar el orden del modelo al azar Kno cre)isL2, %ay que intentar encontrar el orden. Ea dijimos que en el modelo +ing+ong era más fácil pero, a3n así, %ay veces en los que es necesario un estudio más. +ar determinar el orden cuando no es tan sencillo 6en ambos modelos2 nación la prueba llamadaintercam*io isotópico en el e+uili*rio. sta prueba consiste en dejar que la reacción llegue al equilibrio. Una vez en ese estado, donde la velocidad neta es M, se aJade una marca radiactiva y un par, 6productosustrato2 a unas concentraciones que no alteren el equilibrio, es decir, que si la razón en el equilibrio entre dos especies es B-BM, %abrá que aJadir el par en esa razón. n cuanto al sustrato caliente, debe encontrarse en una concentración tan ín*ma que no altere de forma susceptible el equilibrio. 'e esa forma. Fa velocidad neta seguirá siendo M, pero %abrá algo que podemos medir, la velocidad de intercambio isotópico 6ej. &IN velocidad de intercambio isotópico= 2. Ea que se %a aJadido sólo una especie marcada 6siempre uno de los sustratos2, esa mol)cula se transformará a su producto correspondiente a una velocidad que dependerá de las concentraciones. sta dependencia de las concentraciones deriva de las propias ecuaciones cin)ticas 6 2. 'e forma conceptual, es fácil de entender que /I1 aumentaría ya que"ay velocidad de formación de I, con lo que parte de la marca en & se transformaría.
"ay velocidad de desintegración de I, pero estas que se desintegrarían a t=M 6momento en el que se aJade la marca y el par2 no estarían marcadas, por lo tanto, la velocidad irá aumentando.
l aumento en la velocidad no es muy rápido, por el secuestro de la enzima 6in%ibición competitiva con este par, tanto en ordenado como en el azar2.
Se llega a la saturación, ya que %abrá un momento en el que la marca llegue a su equilibrio 6no químico, pero sí probabilístico2 con lo que la concentración y la velocidad de formación se detendrán, como se observa en las %ojas.
Si aJadimos más concentración del par, el equilibrio se mantendrá, pero las concentraciones de ese par aumentarán. sta es la razón del aumento de
pendiente que se observa en la grá*ca /I1 4s t, o lo que es lo mismo, la velocidad neta será M, pero %emos dic%o que las velocidades de formación y desintegración son directamente proporcionales a las concentraciones, de modo, que un aumento de las mismas %ará aumentar tambi)n a las velocidades, lo que se traducirá en una velocidad de intercambio tambi)n mayor. sto se observa mejor en la grá*ca de velocidad de aparición del producto radiactivo con respecto del par. Dambi)n se ve que el aumento llega a un estacionario, debido a la limitación en la cantidad de enzima, que estará completamente saturada no pudi)ndose aumentar la velocidad. "ay varios ensayos, todos coinciden en el marcaje de un sustrato, no de los productos, con un patrón de par, o el suyo, o el contrario. Dodos ellos darán un patrón saturante como el de la grá*ca, e(ceptuando uno. sta diferencia se dará en el modelo secuencial ordenado, cuando ensayemos frente al par 0+. n este caso, se observará un aumento en la velocidad de formación del producto radiactivo al aumentar el par, pero a diferencia de los demás ensayos, llegará un punto en la que la velocidad descenderá, no se mantendrá. Fa grá*ca será, por tanto, como la que se e(pone en el ejercicio G de la página ;. sto nos indicaría de forma clara que el par con el que estamos trabajando 6el contrario del que tiene la marca2 es el central, y por eso, un e(ceso en su concentración %aría que la enzima quedará secuestrada en los pasos centrales. &l disminuir los equilibrios que nos dan la enzima libre, el poco primer sustrato marcado que pueda unirse a ella, quedará atrapado en esos pasos centrales, disminuy)ndose la velocidad de intercambio. l par &I en este caso actuarían como limitantes, y %abría que aumentar tambi)n su concentración si queremos que aumente la velocidad de intercambio. l modelo de Cleland, siguiendo con el ejercicio G será el siguiente-n de0niti%a# esta prue*a nos permite o*tener el orden de sustratos y productos# en el caso de o*tener un e$ecto de descenso de la %elocidad de intercam*io al tra*a)ar con el par contrario de la marca a3adida.
+uede que no %aya quedado claro que la determinación del par no es aleatoria, sino que responde a cuestiones químicas. +ara una mejor compresión debemos *jarnos en los ejercicios : y G de la %oja ;, en los cuales los pares son <&'"<&'HN <>?<>; y <&'H<&'"N succinato>&& respectivamente, ya que es evidente que el <&'" no dará como resultado >&& no el <&'H al <>; y viceversa. Mtodo de King 4 Alman
"e apartado esto del desarrollo del tema porque considero que no nos vale para nada, pero evidentemente no puede pasarlo por alto. Sirve para determinar las ecuaciones de velocidad en reacciones con varios complejos intermedios, como ya avanzamos en anteriores temas. Se trata de un
m)todo para resolver los sistemas de determinantes que se nos formarían. Fa diferencia con los m)todos utilizados por nosotros, es que a%ora se tienen en cuenta las constantes individuales. 'e este m)todo deriva la ecuación general de &lberty. n la %oja que dio la profesora, se dilucida la ecuación para el mecanismo +ing+ong, y se nos dice que la ejecución del m)todo sería muy similar a la que %abría que realizar para el modelo secuencial. Dodo comienza dibujando el ciclo de la reacción en forma de *gura geom)trica 6en este caso nos dará un cuadrado2 teniendo muc%o cuidado de marcar todas las constantes individuales. n segundo lugar se representan las posibles *guras con un lado menos, y llevando esas *guras sobre la del ciclo vamos determinando cuales serían posibles. sta posibilidad no es otra de la de alcanzar , es decir, si mediante la *gura con un lado menos podríamos conseguir libre a partir de las otras especies. +ara ello debemos seguir las @ec%as, teniendo muy en cuenta la irreversibilidad 6consideramos, al igual que en el modelo O que las etapas de formación de producto sin irreversibles al tiempo de medida2, que será la que nos permita eliminar algunas. n nuestro caso, las dos primeras no serían posibles, ya que no %ay continuidad en las @ec%as, al ser el lado k ; irreversible y %acia abajo. Se determina entonces /1 6especie que buscábamos2 mediante las dos *guras restantes posibles. 'e cada uno de esos cuadros se multiplican todas las constantes y las concentraciones de las especies entrantes 6para el sentido que nos interesa, así & no entra en la reacción k B del tercer cuadrado2, y se suman a la de las demás *guras posibles 6en nuestro caso y como se ve en la %oja se multiplican todas las constantes de los tres lados y por /01 que entra en k ? y se suman a la multiplicación de las constantes de los tres lados y la /01 de la cuarta *gura. 'e este modo se calcula /1, y de la misma forma se calculan /&1, /!1 y /!01, desec%ando las *guras que no permitan llegar a esa especie, en cada caso y sumando los productos de las constantes y de las especies entrantes de cada una de las *guras posibles. stas e(presiones no nos dan las concentraciones reales, sólo serán un paso %acia lo que queremos llegar. Cuando ya tenemos todas las especies en las que se divide /1D, %acemos lo de siempre, despejar la especie que se encuentra en la ecuación gen)rica de velocidad, que en este caso es v = k P 7 /!01 por el %ec%o de ser la 3ltima etapa reversible. "emos dic%o que las concentraciones %alladas no son reales, ya que lo que %ay de de*nir es la razón con la enzima total, y por eso dividimos /!01 por el sumatorio de todas las especies anteriores 6/1D2. Una vez formada la razón, agrupamos las cosas comunes y sacamos una fracción, la cual multiplicada por /1D, nos dará /!01 pasa sustituir en la ecuación de velocidad. 'espu)s de una serie de transformaciones obtenemos la ecuación para el mecanismo +ing+ong, donde se pueden observar los valores de las constantes cin)ticas•
K cat- Constantes implicadas en transformación. s la fracción del numerador. sa
fracción multiplicada por /1D nos da 4ma(.
•
5m&- +rimera fracción de constantes, multiplica a /01 en el denominador.
•
5m0- Segunda fracción de constantes, multiplica a /&1 en el denominador. Se observa que no aparece el producto 5s& 7 5m0, que sí lo %ará en el modelo secuencial. n de*nitiva, saber de donde sale la ecuación general de &lberty, nada más. Cuidado, en el mecanismo pingpong %ay mi(ta. "ablamos de %acerlo sabiendo que es secuencial. 9evisar el tema de in%ibición reversible. +ondremos en ejemplo de las %ojas, pero como veremos más adelante %ay varias posibilidades Si no es así desmentidmelo, pero creo que la enzima no diferencia isótopos, pero la probabilidad nos dice que la marca se distribuirá al :MQ. F>AT& 9eacciones multisustrato
red <&'H o(<&'" o(al red<&'" red <&'" >&& alato <&'H