Rad u Bioloskoj Laboratoriji

SADRŽAJ

1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI LABORATORIJI.............................................. .............................................. 1.1. OPŠTA PRAVILA RADA U LABORATORIJI..................... ....................................................... .................................. 1.2. LABORATORIJSKA OPREMA....................... .............................................. ........................................................ ................................. 1.3. LABORATORIJSK LABORATORIJSKO O SUĐE....... .............. .............. .............. .............. ............... ............... .............. .............. ......... 1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH LABORATORIJSKOH SUĐA.......................... ..................................... ...................... ............. 1.5. PRANJE PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA..................... ............................................ .......................

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA MIKROSKOPIR ANJA.......... ..................... ................... ............. ......... 2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA.................... ............................................ ............................................... ........................................... .................... 2.1.1. Mehanički dijelovi..................................................................... dijelovi..................................................................... 2.1.2. Optički dijelovi dijelovi......................................................................... ......................................................................... 2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA...................... ............................................. ........................................................ ..................................... 2.3. ČUVANJE MIKROSKOPA MIKROSKOPA............................... ........................................................ ................................... .......... 2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA....................... .............................................. .......................................... ............................. .......... 2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA....................... .............................................. ................................................ ................................. ........

3. PRIPRE PRIPREMA MA PRIVREME PRIVREMENIH NIH MIKROSKO MIKROSKOPSKIH PSKIH PREPARATA........ ............ .... 3.1. METODE I TEHNIKE...................... ............................................. ............................................................... ................................................. ......... 3.2. SKVOŠ PREPARAT PREPARAT..................... ............................................ .............................................. .......................................... ............................. .......... 3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš preparata....................... .............................................. ................................... ............ 3.3. PRIPREMA PREPARATA SA MATERIJALOM MATERIJALOM IZ USTA................... ................................ ................ ... 3.4. PREPARAT VISEĆA VISEĆA KAP................................. ................................................. ........................... ................. ......

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA................ ...................... ...... 4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE.................... ........................................... .............................................. ............................................. ...................... 4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju........... ...................... .................... ........... 4.1.2. Fizička fiksacija ................................ .................................................................... ........................................ .... 4.2. ISPIRANJE MATERIJALA MATERIJALA....................... .............................................. .............................................................. ....................................... 4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA MATERIJALA.................................. ..................................... ... 4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA....................... ............................................................... ............................................. ..... 4.5. INKLUZIJA U KANADA BALZAM.................... ........................................... ................................................... ............................ 4.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA..................... ............................................ ................................................... ................................ ....

5. BOJENJE PREPARATA............. .......................... ......................... ................................................ ....................................... ... 5.1. BOJE I RASTVORI BOJA....................... .............................................. .............................................. .................................... ................. 5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA....................... ..................................................................... ..................................................... ....... 5.3. METODE BOJENJA BOJENJA..................... ............................................ .............................................. .......................................... ............................. .......... 5.3.1. Hematoksilinska metoda....................... .............................................. .............................................................. ....................................... Delafildov hematoksilin......................... ................................................ .............................................. ......................................................... .................................. 5.3.2. Dvojno bojenje bojenje preparata..................... ............................................ .............................................................. ....................................... 5.3.3. Ostale metode....................... .............................................. .............................................. ........................................................ ................................. 5.4. REAGENSI ZA PROSVJETLJAVAN PROSVJETLJAVANJE JE I NAČIN UPOTREBE....... ........... ........ ........ ....

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATA PREPARAT A............ ....................... ...................... ....................... ....................... ...................... ....................... .................... ............. .......... ......... 6.1. 6.2. 6.3. 6.4.

INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN.................... ........................................... ....................................... .................... .... KALUPLJENJE.................... ........................................... .............................................. .............................................................. ....................................... PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA....................... ......................................................... .................................. PRIPREMANJE PRIPREMA NJE PREDMETN PREDMETNIH IH I POKROVNIH STAKALA....... ................ ................. .............. .......... 1

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA PRESJEKA MIKROTOMOM....................... .............................................. .................................. ........... 6.6. UPOTREBA MIKROTOMA...................... ............................................. .............................................. ........................................ ................. 6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU SJEČENJU MIKROTOMOM.................................... ......................................... ..... 6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO....................................... 6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog Majerovog ljepila........................................................... ljepila........................................................... 6.9. RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA ....... ............... ............... ........... ........ ........ ........ ....... ... 6.10. DEPARAFINISANJE.................... ........................................... .............................................. ................................................... ............................

7. TEHNIKA SMRZAVANJ SMRZAVANJA A TKIVA........... ...................... ...................... .................. ............ .......... .......... ......... .... 8. SPECIF SPECIFIČNE IČNE METODE PRIPREM PRIPREME E CITOL CITOLOŠKIH OŠKIH PREPARATA...

8.1. FRAKCIONISA FRAKCIONISANJE NJE I CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE ĆELIJE..................... ................................ ............. 8.2. MACERACIJA..................... ............................................ .............................................. ............................................................ ........................................ ... 8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT....................... .............................................. ....................................... .................... ....

9. PRAKTIČN PRAKTIČNA A UPOTREBA ELEKTRO ELEKTROFOREZE FOREZE..... ........... ............ ........... ......... ...... .. 9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK..................... ............................................ ..................................................... .................................... ...... 9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK....................... .............................................. ....................................... ............................. .................. ..... 9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA...................... .............................................................. ............................................. .....

2

1. RAD U BIOLOŠKOJ LABORATORIJI Prilik Prilikom om rada rada u biološ biološkoj koj labor laborato atorij rijii čes često to se korist koriste e različ različite ite hemikalije od kojih su neke dosta agresivne i nagrizaju materijale sa kojima dođu u kontakt, izazivaju burne reakcije, ili su njihova isparenja štet štetna na po zdra zdravl vlje je jer jer nagr nagriz izaj aju u sluz sluzok okož ožu u usta usta,, grla grla i nosa nosa,, mogu mogu izazvati oštećenje očiju itd. Neke hemikalije, kao što su npr. formalin, ksilol i druge imaju kancerogeno i teratogeno dejstvo, pa pri rukovanju sa njima treba biti posebno oprezan. Zbog svega ovoga se pri radu u biološkoj laboratoriji mora pridržavati određenih pravila.

1.1. OPŠTA PRAVILA PRAVILA RADA U LABORATORIJI LABORATORIJI 1. Nošenje Nošenje radnog radnog mantila mantila smanjuje smanjuje rizik kontamin kontaminacije acije odijela odijela i raznošenj raznošenje e Time ujed ujedno no spre spreča čava vamo mo prlj prljan anje je i materijala materijala izvan laboratorij laboratorije e. Time uništavanje odijela. 2. Pran Pranje je ruku ruku se vrši vrši u toku toku rada rada prem prema a potr potreb ebi,i, a na kraju kraju rada rada je obavezno. 3. Ne prepo eporučuj učuje e se rad sa ogreb grebo otin tinama, ama, a nar aro očito čito ne sa otvorenim ranama na rukama. 4. U toku toku rada ne treba treba dodiriva dodirivati ti oči, oči, nos i usta. usta. 5. Pri radu u laborat laboratoriji oriji nije nije dozvoljen dozvoljeno o uzimati uzimati hranu, hranu, piti ni pušiti. pušiti. 6. Dugačka Dugačka kosa treba treba biti biti svezana svezana u rep da se ne ne bi spalila spalila radom kraj plamenika ili špiritusne lampe. 7. Radno Radno mjesto se dezinfik dezinfikuje uje odgovaraj odgovarajućim ućim sredstvo sredstvom m kao što je 70% etanol ili 5% asepsol prije početka i na kraju rada. 8. Nije po poželjno pipetirati hemikalije ustima. Preporučuje se upotreba propipete. 9. Sa opas opasni nim m hemi hemika kalilija jama ma se radi radi u dige digest stor oru. u. Ako Ako labo labora rato tori rija ja ne posjeduje digestor, onda se obavezno radi kraj otvorenog prozora. 10. Upotrebljene pipete, epruvete i drugo suđe treba odložiti u posebne posude sa dezinfekcionim sredstvom. 11.Po završetku rada treba pospremiti i očistiti laboratoriju. 12.Oprema i hemikalije se ne smiju iznositi iz laboratorije. 1.2. LABORATORIJSKA OPREMA

Da bi se omogućio normalan eksperimentalni rad svaka biološka laboratorija treba posjedovati sledeću opštu opremu: 1. Tehnička i analitička vaga 1. Vodeno kupatilo – uređaj u kom se održava destilovana voda na tačno tačno određe određenoj noj temper temperatu aturi. ri. Omoguć Omogućuje uje izvođe izvođenje nje raliči raličitih tih

3

biohemijskih, hemijskih i bioloških reakcija. 2. Sušnica (minimum do 200°C) – uređaj za sterilizaciju različitog, uglavnom staklenog posuđa (petrijevke, pipete, čaše, menzure, erlenmajerice itd.). 3. Termostat  (minimum do 44°C) – Za gajenje različitih kultura (za klij klijan anje je sjem sjemen ena a bilj biljak aka, a, gajen ajenje je mikro ikroo organi ganizzama ama itd. itd.)) neophodno je obezbijediti određenu temperaturu što se postiže u termostatima. Oni su najčešće metalni sa dvostrukim zidovima koji su obloženi nekim materijalom koji je slab provodnik toplote, npr. vatom. Između zidova se nala alazi voda ili vazd azduh, a zagrijavanje se vrši grijačima. 4. Centrifuga (minimum do 5000 obrtaja u minuti) 5. Frižider – za čuvanje različitih hemikalija i materijala. 6. Mućkalica – uređaj za miješanje rastvora. 7. Mikrotom – za sječenje tkiva prilikom pravljenja preparata. 8. Termometri (0-100°C) 9. Eksikator  –  – za isušivanje u uslovima vakuuma. Vakuum pu pumpa mpa – za filt filtra raci ciju ju i obez obezbj bjeđ eđiv ivan anje je vaku vakuum uma a u 10. Vakuum eksikatoru. Vruća ploča ploča – uređaj uređaj koji koji omoguć omogućuje uje zagrij zagrijava avanje nje na tačno tačno 11. Vruća određenu temperaturu. 12. Magnetna mješalica 13. Spektrofotometar   pH-metar  – uređaj za određivanje koncentracije vodonikovih jona 14. pH-metar – u rastvoru. 15. Oksimetar  – uređaj za određ ivanje koncentracije kiseonika u rastvoru. 16. Bunzenov plamenik  - nastavak koji se instalira na plinsku bocu i služi za sterilizaciju plamenom. 17. Špiritusna lampa - takođe se koristi za sterilizaciju plamenom, u slučaju da laboratorija nema Bunzenov plamenik. 18. Set za bojenje – niz povezanih posuda u kojima se vrši bojenje preparata. 19. Destilator  – uređaj za proizvodnju destilovane vode. 20. Stalak za epruvete 21. Stalak za mikroskopske preparate 22. Propipeta  – gumeni nastavak koji se postavi na pipetu. Služi za uvla uvlače čenj nje e tečn tečnos osti ti u pipe pipetu tu u onim onim sluč slučaj ajev evim ima a kada kada se ne prep prepor oruč učuj uje e uvla uvlače čenj nje e usti ustima ma,, npr. npr. ako ako su u pita pitanj nju u opas opasne ne hemikalije sa štetnim isparenjima Naravno, pored ove, zavisno od specifičnosti rada u laboratoriji, potreban je i niz drugih aparata. Ovde su pobrojani samo neki koji imaju najširu upotrebu. 1.3. LABORATORIJSKO LABORATORIJSKO SUĐE U biološkim laboratorijama se upotrebljava različito stakleno suđe izrađeno od specijalnog stakla koje podnosi zagrijavanje na visoku temperaturu. 4

Epruvete su izrađene od staklenih cijevi sa zaobljenim dnom i ravnim ivicama. Postoji nekoliko vrsta epruveta, ali se naj češće koriste epruvete dužine 160-200 mm i pre čnika 16-20 mm. Petrijeve kutije se prave od stakla ili plastike. Imaju oblik spljoštenog valjka i sastoje se iz dva dijela, poklopca koji ima nešto ve ći prečnik, i dna sa nešto manjim prečnikom, nikom, tako da naliježu jedan u drugi. Najčešće se koriste petrijevke prečnika 60 do 100 mm. Pipete su dugačke, kalibrisane staklene cijevi koje su na donjem kraju izvučene u kapilarno suženje. Služe za odmjeravanje te čnosti. Najčešće se upotrebljav upotrebljavaju aju pipete od 1, 5 i 10 ml. Često se upotrebljavaju i tzv. Pasterove pipete koje nisu graduisane. Erlenmajerove boce su stakleni sudovi u obliku kupe sa kra ćim ili dužim grlićem različitog prečnika. nika. Njihova Njihova zapremina se kreće od 10 do 5000 5000 ml. Koriste se za pripremu i čuvanje različitih rastvora. Menzure su cilindrični stakleni sudovi sa ravnim dnom, a koriste se za odmjeravanje tečnosti. Graduisane su, a zapremina im se kreće od 10 do 2000 ml. cilind ndri ričn čnii stak stakle leni ni sudo sudovi vi čije čije ravn ravno o dno dno služ služii kao kao Čaše su cili postolje. Kraće su i šire od menzura. 1.4. PRANJE LABORATORIJSKOH LABORATORIJSKOH SUĐA Pravilno pranje laboratorijskog posu đa predstavlja jedan od preduslova za uspješno izvo đenje enje eksp eksper erim imen enat ata. a. Sudo Sudovi vi se peru peru topl toplom om vodo vodom m sa deterdžentom, t emeljno se ispiraju u mlazu tekuće vode i potapaju se u hromsumpornu kiselinu u trajanju od 24 sata. Nakon toga se sudovi ispiraju u tekućoj vodi, ostavljaju u destilovanoj vodi 2-3h, a zatim se  još jednom ispiraju u destilovanoj vodi.

1.5. PRANJE PREDMETNIH PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA STAKALA

Za prip pripre remu mu mikr mikros osko kops pski kih h prep prepar arat ata a neop neopho hodn dna a su čist čista a predmetna i pokrovna stakalca. Stakalca koja su ranije korištena treba drža držati ti 2 sa sata ta u rast rastvo voru ru prip pripre reml mlje jeno nom m od 100 100 dije dijelo lova va sump sumpor orne ne kiseline, 50 dijelova kalijum dihromata i 1000 dijelova vode. Nakon toga ispiraju se vodom, kuhaju 20 minuta u 1% rastvoru NaOH i ispiraju destilovanom vodom. Zatim se potope u razblaženu hlorovodoničnu kiselinu i ponovo se ispiraju destilovanom vodom. Ovako pripremljena stakalca se čuvaju u 96% etilalkoholu. Čak se i nova stakalca trebaju pripremiti prije prve upotrebe. Ona se kuhaju 10 minuta u 1% rastvoru NaOH, ispiraju se u destilovanoj vodi, potapaju u rablaženu hlorovodoničnu kiselinu i ponovo ispiraju u destilovanoj vodi. Njihova čistoća se može provjeriti tako što se na suho stakalce stavi kapljica vode. Ako je stakalce čisto kapljica će se 5

razliti, dok se na prljavom stakalcu formiraju kapljice.

2. MIKROSKOP I TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA Mikr Mikros osko kop p je opti optičk čkii inst instru rume ment nt koji koji daje daje uveć uvećan an lik lik mali malih h objeka objekata ta i njihov njihovih ih detalj detalja. a. Danas Danas se korist koristii više više vrsta vrsta mikros mikroskop kopa: a: svjetlosni, mikroskop sa tamnim poljem, faznokontrastni, fluorescentni, ultr ultral alju jubi biča čast stii i elek elektr tron onsk ski. i. Budu Budući ći da se u nast nastav avii najv najviš iše e kori korist stii svjetlosni mikroskop, ovde će biti detaljnije opisan.

2.1. DIJELOVI MIKROSKOPA

Postoj Post oje e razl različ ičit itii tipo tipovi vi svje svjetl tlos osno nog g mikr mikros osko kopa pa,, ali ali svi svi imaju imaju neko nekoli liko ko os osno novn vnih ih dije dijelo lova va koji koji se mogu mogu podi podije jelit litii na me meha hani ničk čke e i optičke dijelove.

2.1.1. Mehanički dijelovi U mehaničke dijelove mikroskopa spadaju: postolje, ručica, stočić sa mehanizmom za pomijeranje, tubus, kolijevka mikroskopa, zavrtanj kondenzora, makrometarski i mikrometarski zavrtanj. Stativ mikroskopa je napravljen od metala i u svom donjem dijelu   je proširen, obično u obliku potkovice, u postolje (Slika 1a) na kome stoji stoji mikro mikrosko skop. p. Pos Postol tolje je je od teškog teškog metala, metala, tako tako da mikros mikroskop kopu u obez obezbj bjeđ eđuj uje e stab stabil ilan an polo položa žaj. j. Ko Kod d novi noviji jih h mikr mikros osko kopa pa u njeg njega a je ugrađen sistem za osvjetljenje. Postolje je preko nagibnog zgloba (Slika 1c) povezano sa gornjim dijelom stativa koji se zove ručica. Ručica (Slika b1) služi za prihvatanje, nošenje i premiještanje mikroskopa i kao nosač drugih drugih dijelo dijelova. va. Preko Preko nagibn nagibnog og zgloba zgloba mikro mikrosko skop p se iz vertik vertikaln alnog og dovodi u kosi položaj, koji je često povoljniji za rad Iznad nagibnog zgloba za stativ je pričvršćen stočić mikroskopa (Slika 1e). Na sredini stočića se nalazi otvor preko koga se postavlja preparat. Kroz otvor stočića prolaze svjetlosni zraci kojima se objekat koji posmatramo prosvjetljava. Stočić može biti pokretan ili nepokretan. Ukoliko je pokretan pokreće se pomoću dva zavrtnja koji se nalaze na 6

ivici stočića, sa njegove lijeve i desne strane. Stočić se može pokretati u svim pravcima i na taj način je omogućeno posmatraču da u vidnom polj polju u mikr mikros osko kopa pa,, fini finim m pomi pomije jera ranj njim ima, a, pron pronađ ađe e odgo odgova vara raju jući ći dio dio prep prepar arat ata. a. Po Pokr kret etan an stoč stočić ić je naro naroči čito to kori korist stan an pri pri radu radu sa veći većim m uvećan uvećanjim jima a koja koja zahtij zahtijeva evaju ju neznat neznatna na pomije pomijeran ranja ja prepar preparat ata. a. Tako Tako mala pomijeranja gotovo je nemoguće izvesti slobodnom rukom. Na nepokretnom stočiću preparat se pokreće rukom sve dotle dok se lik objekta ne pojavi u vidnom polju mikroskopa. Na stočiću se nalaze dva metalna držača za preparat, koji su od velike koristi, čak i neophodni, ako se u toku rada mikroskop izvodi iz vertikalnog položaja. Tubus (Slika 1d) je metalna cijev koja na gornjem kraju nosi okular, a na donjem, kod savremenih mikroskopa, pokretan revolver  u kome se nalaze ležišta za objektive različitog uvećanja (Slika 1f). Okretanjem revolvera dovo dovodi dimo mo obje objekt ktiv iv želj željen enog og uveć uvećan anja ja u opti optičk čku u os osu u mikr mikros osko kopa pa.. Objektiv je doveden u optičku osu mikroskopa onda kada metalno perce, pričvršćeno na stativu, upadne u zarez na revolveru koji se nalazi iza tog objektiva.

Tubus Tubus može da bude bude post postav avlj ljen en vert vertik ikal alno no ili ili koso koso.. Ukol Ukolik iko o je post postav avlj ljen en koso koso izme između đu obje objekt ktiv iva a i okul okular ara a nala nalazi zi se priz prizma ma koja koja 7

prelama svjetlosne zrake i usmjerava ih u koso postavljen tubus. Tubus  je sa stativom pokretno spojen preko kolijevke mikroskopa. Kolijevka mikroskopa je sistem zupčanika koji se pokreće pomoću makrometa makrometarsko rskog g i mikrometar mikrometarskog skog zavrtnja. zavrtnja. Makrometa Makrometarski rski zavrtanj zavrtanj (Slika 1i) služi za gruba pomijeranja tubusa na fokusno rastojanje pri kome je lik većanjima. Pomoću Pomoću   jas jasno no vidlj idljiv iv i upot upotre rebl blja java va se pri pri radu radu sa manj manjim im uvećanjima. mikrometarskog zavrtnja tubus se dovodi tačno u 2. fokus. Mikrometarski Slika Objektiv zavrtanj (Slika 1j) se upotrebljava pri radu sa većim uvećanjima. Zavrta Zavrtanj nj konden kondenzor zora a služi služi za podiza podizanje nje i spušta spuštanje nje konden kondenzor zora, a, čime se reguliše osvjetljenost preparata. 2.1.2. Optički dijelovi U optičke dijelove mikroskopa spadaju okulari, objektivi i sistem za osvj os vjet etlj ljav avan anje je.. Po Pomo moću ću opti optičk čkih ih dije dijelo lova va vrši vrši se os osvj vjet etlj ljav avan anje je i uvećavanje lika objekta koji posmatramo. Sistem Sistem za osvjetlj osvjetljava avanje nje se nalazi nalazi ispod ispod stočića stočića mikrosk mikroskopa opa i sastoji se iz ogledala i kondenzora. Ogledalo zauzima niži položaj i smješteno je na pokretnoj osovini tako pričvršćeno u polukružni ram da se može pokretati u svim pravcima (Slika 1k). Pokretljivost ogledala je veoma važna osobina, jer se zahvaljujući tome svjetlosni zraci, koji dopiru iz različitih svjetlosnih izvora, mogu korisnije upotrijebiti u cilju osvjetljavanja preparata. Ogledalo je okruglo, na jednoj strani ravno, a na suprotnoj udubljeno. Pri korišćenju svjetlosti sa udaljenih svjetlosnih izvora (dnevna svjetlost) upotrebljava se ravna strana ogledala, a u slučaju da je svjetlosni izvor blizu (vještačka svjetlost) upotrebljava se udubljena strana ogledala. Kondenzor se Kondenzor se nalazi između mikroskopskog stočića i ogledala (Slika 1l). Sagrađen je iz više sočiva koja se nalaze u zajedničkom prstenu. Kondenzor funkcioniše kao sabirno sočivo. Pomoću njega se objekat osvjetljava širim svjetlosnim snopom nego što bi to bio inače slučaj kada bi svjetlost dolazila samo sa ogledala, što je od posebnog značaja kada se radi sa velikim uvećanjima. Drugim riječima, objekat će biti prosvijetljen intenzivnijom svjetlošću nego što bi bio u istim uslovima ako bi svjetlost dolazila samo sa ogledala. Kondenzor se može spuštati i podizati pomoću zavrtnja (Slika 1m). Podizanjem kondenzora svjetlost se poja pojača čava va,, a spuš spušta tanj njem em se sm sman anju juje je.. Ne Neki ki mikr mikros osko kopi pi imaj imaju u kondenzor tako montiran da se, osim u vertikalnom, može pomijerati i u horizontalnom pravcu. (Slika 1n). 1n). U donjem donjem dijelu dijelu konden kondenzo zora ra smješt smješten ena a je iris-dijafragma (Slika Pomoću nje se podešava količina svjetlosti kojom se osvjetljava objekat koji koji posm posmat atra ramo mo.. Iris Iris-d -dij ijaf afra ragm gma a je sa sagr građ ađen ena a od veće većeg g broj broja a polukružnih, čeličnih Ijuspica koje se, pomoću jedne poluge, skupljaju ili šire i na taj način stvaraju uži ili širi otvor za prolaz svjetlosti. Objektivi (Slika 1g) su manje ili više složeni sistemi centriranih sočiva koja se nalaze u kratkom cilindru (SI. 2). Na svom gornjem dijelu cilindar ima navoje pomoću kojih se uvrće u ležište na revolveru. Na 8

objektivu je urezana brojka koja označava koliko puta dati objektiv uvećava lik posmatranog objekta. Sočiva u objektivu su plankonveksna (ravnoispupčena). Ravnom stranom su okrenuta objektu, a ispupčenom prem prema a oku. oku. Od kval kvalit itet eta a obje objekt ktiv iva a ugla uglavn vnom om zavi zavisi si i kval kvalit itet et lika lika objekta koji posmatramo. Objekt jektiv iv daje aje stv stvar aran an,, uveća većan n i obr obrnut nut lik. lik. Svaki vaki objek bjekti tiv v karakteriše njegova moć razdvajanja, fokusno rastojanje i uvećanje. Slabiji objektivi imaju veće fokusno rastojanje: 50 do 60 mm, a jači 1 do 3 mm. Moć razdvajanja objektiva je njegova sposobnost da daje slike dve međusobno bliske tačke razdvojeno. U odnosu na način upotrebe o bjektivi mogu biti suvi i imerzioni. Suvi oni između između čijih čijih se fronta frontalni lnih h soč sočiva iva i prepa preparat rata a nalazi nalazi objektivi su oni vazduh. (SIika 3 lijevo). To su objektivi manjih uvećanja: 3,2x; 10x; 40x. Imerzioni objektivi su oni čije se frontalno sočivo mora potopiti u kap tečn tečnos osti ti (vod (voda a ili ili kedr kedrov ovo o ulje ulje)) koja koja se nala nalazi zi na prep prepar arat atu u izna iznad d objekta koji posmatramo (SIika 3 desno). Imerzioni objektivi su većih uvećanja (90x, 100x). .

imerzi zion onog og Slik Slika a 3. Šema Šema pres presje jeka ka suvo suvog g obje objekt ktiv iva a i prep prepar arat ata a (lij (lijev evo o ) i imer (des (desno no). ). A - fron fronta taln lno o so soči čivo vo obje objekt ktiv iva a B - pokr pokrov ovno no stak stakal alce ce C predmetno stakalce Kvalitet mikroskopske slike zavisi, između ostalog, i od količine svjetlosnih zraka koji ulaze u objektiv. Upotrebom imerzionih objektiva, u odnosu na suve, pri ostalim jednakim uslovima, postiže se ulazak većeg broja svjetlosnih zraka u objektiv. Naime, svjetlosni zraci pri upotrebi suvih objektiva prolaze kroz sistem: stakla (predmetna ploča) - vazduh vazduh - stakla stakla (frontaln (frontalno o sočivo sočivo objektiva) objektiva).. Usljed različitog različitog indeksa indeksa prelam prelamanj anja a pojedi pojedinih nih sre sredin dina a (stakla (stakla:: 1,53; 1,53; vazduh vazduh:: 1:0) 1:0) dolazi dolazi do znatnog rasipanja svjetlosnih zraka pa manja količina svjetlosti ulazi u objektiv (Slika 3 lijevo) Pri upotrebi imerzionog objektiva svjetlosni zraci prolaze kroz sistem: staklo (predmetna ploča) - tečnost (kedrovo ulje) - staklo (frontalno sočivo imer imerzi zion onog og obje objekt ktiv iva) a).. Po Pošt što o je inde indeks ks prela prelama manj nja a stak stakla la 1,53 1,53 a kedrovog ulja 1,51, svjetlosni zraci prolaze kroz sredine približno istih indeksa prelamanja, te je rasipanje znatno umanjeno. Zbog toga u objektiv ulazi mnogo više korisnih svjetlosnih zraka (Slika 3 desno) nego što je to slučaj kod suvih objektiva, a time se u znatnoj mjeri pobo poboljš ljšav ava a i kval kvalit itet et mikr mikros osko kops pske ke slik slike. e. Treb Treba a napo napome menu nuti ti da su imerzioni objektivi specijalno građeni pa se zato samo oni mogu utapati 9

u kap tečnosti na preparatu. Osim uljanih imerzionih objektiva postoje i takvi koji se utapaju u kapljicu vode. Nešto jednostavnije od objektiva sagrađeni su okulari. Njih možemo uporediti sa lupom. Okulari se nalaze na gornjem dijelu tubusa (Slika 1h) i na svakom je upisan broj (7x, 10x, 15x) koji označava njegovu moć moć uveća većanj nja. a. Mikr Mikro osko skopi koji koji imaj imaju u jed jedan okula kularr se naziv azivaj aju u monokularni, a oni koji imaju dva okulara binokularni. Postoje i mikroskopi sa dvostrukim okularima koji su namješteni u horizontalnoj cijevi tako da dvije osobe mogu istovremeno posmatrati preparat.

2.2. REZOLUCIJA MIKROSKOPA

Rezolucija ili moć razdvajanja mikroskopa može da se formuliše na sledeći način: to je veličina najmanjeg dijametra čestice koju jasno vidimo ili najmanje rastojanje između dve linije koje možemo odvojeno vidjeti u mikroskopu. Moć razdvajanja zavisi od numeričke aperture objektiva, talasne dužine svjetlosti i ugla pod kojim svjetlost pada. Ukoliko je numerička apertura veća, talasna dužina svjetlosti manja i osvjetljenje koso, moć razdvajanja je bolja. Nume Numeri ričk čka a aper apertu tura ra je mjer mjera a za moć moć razd razdva vaja janj nja a obje objekt ktiv iva a i označena je na samom objektivu. Njene vrijednosti se kreću od 0,11 do 1,3. Razdvojna moć objektiva se izračunava tako što se talasna dužina svje svjetl tlos osti ti pri pri kojo kojojj posm posmat atra ramo mo podi podije jeli li sa vrij vrijed edno nošć šću u nume numeri ričk čke e aperture. Npr. ako je talasna dužina svjetlosti 560 nm, a numerička apertura 1, razdvojna moć je 560 nm. To znači da taj objektiv razdvaja i čini vidljivim dva objekta koja su na međusobnoj udaljenosti od 560 nm. mikros osko kopa pa je njeg njegov ovo o opšt opšte e Jedn Jedna a od osno osnovn vnih ih kara karakt kter eris istik tika a mikr uvećanje. Opšte uvećanje mikroskopa (Um) određuje se kao proizvod uveća uvećanj nja a objek objekti tiva va (Uob (Uob)) i uveć uvećan anja ja okul okular ara a (Uok (Uok), ), a izra izraža žava va se formulom: Um= Uob x Uok

Ako objektiv uvećava lik posmatranog objekta 90x, a okular 15x , tada će opšte uvećanje mikroskopa iznositi 1350x. Upotrebom okulara većeg uvećanja (20x) neće se dobiti bolji kvalitet slike posmatranog objekt objekta, a, jer smo prešl prešlii granic granicu u tzv. tzv. korisnog korisnog uvećanja uvećanja mikroskopa mikroskopa.. Izračunato je da korisno uvećanje mikroskopa nije veće od 1300 do 1450 1450 puta puta.. Po Post stav avlj lja a se pita pitanj nje e kako kako izab izabra rati ti okul okular ar maks maksim imal alno nog g uvećan uvećanja ja u okviru okviru korisn korisnog og uvećan uvećanja ja mikro mikrosko skopa. pa. Pretpostav Pretpostavimo imo da radimo sa objektivom 40x čiji je aperturni ugao 0,65. Korisno uvećanje  je 1000 x 0,65 = 650x. Kada korisno uvećanje podijelimo uvećanjem objektiva koji koristimo (40x) dobićemo maksimalno korisno uvećanje okulara, u datom primjeru 16x. Korišćenje jačih okulara negativno bi uticalo na kvalitet lika, jer se javlja difrakcija svetlosti.

10

2.3. ČUVANJE MIKROSKOPA Pri Pri radu radu sa mikr mikros osko kopo pom m pose posebn bnu u pažn pažnju ju treb treba a obra obrati titi ti na prenošenje mikroskopa. Mikroskop se isključivo prenosi ili pomijera na taj način što se jednom rukom drži za ručicu, a drugom za postolje. Kao što je već ranije napomenuto od kvaliteta optičkih dijelova mikroskopa zavisi i kvalitet lika objekta koji dobijamo, pa prema tome okulare i objektive treba posebno čuvati i njegovati. Njihova sočiva treba da su uvijek čista. Na početku i na kraju rada, a po potrebi i u toku toku rada, ada, so soči čiva va treb treba a oč očis isti titi ti me meko kom, m, i za tu svrh svrhu u spec specij ijal alno no naprav napravljen ljenom om četkic četkicom om ili mekom mekom krpom krpom koja koja ne ostavl ostavlja ja tragov tragove. e. Ukoliko se prašina nalazi sa unutrašnje strane sočiva ono se odvrne i na isti način očisti, no ovu radnju bolje je prepust iti specijaliz specijalizovan ovanim im radionicama. Sočiva se nikad ne dodiruju prstima, niti se sa njih prašina otklanja duvanjem.

Pri mikroskopiranju se često na metalnim dijelovima mikroskopa kondenzuje vodena para (usljed disanja) koju treba ukloniti brisanjem. šenom mikroskopiranju makrometarskim zavrtnjem podići Po zavr šenom tubus mikroskopa i ukloniti preparat, pokretanjem revolvera u optičku osu os u dove dovest stii najm najman anji ji obje objekt ktiv iv,, a sve sve me meha hani ničk čke e i opti optičke čke dijel dijelov ove e obrisati i mikroskop vratiti u kutiju. Mikroskop treba čuvati i k ada ada se ne upotrebljava i to naročito od prašin prašine, e, toplot toplote, e, neposr neposredn ednog og djelov djelovanj anja a sunčev sunčeve e svjetl svjetlost osti, i, vlage vlage i isparenja raznih hemikalija.

2.4. TEHNIKA MIKROSKOPIRANJA

Opšte Opšte nap napome omene. ne. Pri mikros nju se mogu mogu kori korist stit itii dnev dnevna na mikroskop kopira iranju difuzna ili vještačka svjetlost. Iako je dnevna svjetlost veoma prijatna za rad, pri dužoj upotrebi mikroskopa prednost ima vještačka svjetlost. Visina stola i stolice treba da bude takva da posmatrač može duže vremena udobno i bez naprezanja da radi. Pred početak rada mikroskop se izvadi iz kutije, postavi na radno mjesto i mekom krpom pažljivo očisti od prašine. Poslije završenog mikroskopiranja preparat se skida sa stočića, u osu se postavlja najmanji objektiv, mikroskop se obriše i pažljivo, držeći ga jednom rukom za ručicu a drugom za postolje, stavlja u kutiju. Uzimanje i prenošenje mikroskopa vrši se isključivo držanjem za ručicu i postolje istovremeno. postav avlj lja a tako tako da ogle ogleda dalo lo bude bude uvij uvijek ek okre okrenu nuto to Mikros Mikroskop kop se post svjetlosnom izvoru, a ručica mikroskopa posmatraču. Dovo Dovođe đenj nje e obje objekt ktiv iva a u opti optičk čku u osu osu mikr mikros osko kopa pa.. - Kada 11

mikroskop stavimo na radno mjesto dovodimo objektiv najmanjeg uvećanja u optičku osu mikroskopa. Objektiv se dovodi u optičku osu mikroskopa okretanjem pokretnog dijela revolvera. Na revolveru se, prema svakom objekt objektivu ivu,, nalazi nalazi ispupč ispupčenj enje e sa zarezo zarezom. m. Kada, Kada, okreću okrećući ći revolv revolver, er, u zare zarezz na njem njemu u upad upadne ne perc perce e koje koje se nala nalazi zi na fiks fiksir iran anom om dije dijelu lu revolvera ispod tubusa, tubusa, čuje se karakterističan zvuk, zvuk, što je znak znak da se dati objektiv nalazi u optičkoj osi mikroskopa. Traženje Traženje vidnog vidnog polja mikroskop mikroskopaa. Kada smo objektiv najmanjeg uveća uvećanj nja a post postav avil ilii u opti optičk čku u os osu u mikr mikros osko kopa pa pris pristu tupa pamo mo traž tražen enju ju vidnog polja. Mikroskopira se uvijek lijevim okom, a desno je otvoreno. Ovo je naročito važno pri crtanju preparata. Ma koliko teškoća takav način rada u početku bude izazivao, vremenom se uvježba. Prema tome,  jedno od pravila pri mikroskopiranju je da su oba oka otvorena.  Takođe treba istaći da se se mikroskopi mikroskopira ra bez naočar naočara, a, osim osim ako ako je posmatrač posmatrač jako kratkovid.  Traženje vidnog polja vrši se na sledeći način: gledajući kroz okular okre okreće ćemo mo ogle ogleda dalo lo prem prema a svje svjetl tlos osno nom m izvo izvoru ru sve sve dotl dotle e dok dok ne ugle ugleda damo mo ravn ravnom omjer jerno no kruž kružno no vidn vidno o polj polje e mikroskopa. kroskopa. Pronalasko Pronalaskom m vidnog polja mikroskop je pripremljen za rad pa se vrši fokusiranje. Fokusiranje. Fokusiranje. Na stoč stočić ić mikr mikros osko kopa pa stav stavit itii prep prepar arat at i pris pristu tupi piti ti traženju jasnog lika objekta koji želimo da proučavamo. Preparat se stavlja na stočić tako da se objekat našeg ispitivanja nalazi preko otvora stočića i, od prilike, ispod sočiva objektiva. Gledajući kroz okular pažljivo pomijeramo preparat sve dok se u vidnom polju ne pojavi sijenka. Tada preparat više ne pomijeramo već pomoću makrometarskog  zavrtnja pažljivo podižemo tubus sve dotle dok ne ugledamo jasan lik objekta koji posmatramo. Pri ovome tzv. malom uvećanju (ono se kreće od 8x  do 10x) 10x) preg pregle leda damo mo prep prepar arat at,, uoči uočimo mo njeg njegov ove e os osno novn vne e karakt karakteri eristi stike, ke, nacrta nacrtamo mo šem šemu u i izaber izaberemo emo najpo najpogod godnij nije e mjesto mjesto za det detaljn aljnij ije e pro proučav učavan anje je gra rađ đe pri već eće em uveć većanju anju.. Zatim atim,, ne pomijerajući preparat, okretanjem revolvera dovodimo u optičku osu mikroskopa objektiv većeg uvećanja (40x, 45x). Pomoću mikrometarskog zavrtnja izoštrimo lik objekta koji posmatramo. a vila fokusiranja je da se tubus pri radu sa Jedno od osnovnih osnovnih pr avila malim uvećanjem prvo spusti na 0,5 cm od preparata, što se posmatra sa strane, a zatim gledajući kroz okular, tubus se podiže sve dok se ne  pojavi lik objekta u vidnom polju mikroskopa. Fokusira se uvijek odozdo na

gore. Pokretanje tubusa pri upotrebi objektiva manjih uvećanja vrši se uvijek uvijek makram makrameta etarsk rskim im zavrtn zavrtnjem jem,, a pri radu radu sa objekt objektivi ivima ma većih većih uvećanja isključivo se koristi mikrometarski zavrtanj za fokusiranje.

Pri upotrebi imerzionih objektiva postupak je sledeći:

1. pomoću pomoću objektiva objektiva manjeg manjeg uvećanj uvećanja a pronaći pronaći lik objekta objekta 2. podići podići tubus tubus toliko toliko da donja donja ivica objekt objektiva iva bude bude udaljena udaljena oko 2 cm od preparata 3. na preparat preparat stavit stavitii kap imerzio imerzionog nog ulja ulja (kedrovo (kedrovo ulje) ulje) mikroskopa a imerzioni imerzioni okretanje njem m revolv revolvera era dovest dovestii u optičku osu mikroskop 4. okreta 12

Slika 4. Okular mikrometar 5. 6. 7. 8.

Slika 5. Objektiv mikrometar

objektiv gledaj gledajući ući sa strane strane,, polako polako i veoma veoma pažliivo pažliivo spuštat spuštatii tubus tubus sve dok se sočivo imerzionog imerzionog objektiva objektiva ne utopi utopi u kedrovo kedrovo ulje spuštati objektiv sve dok ne dođe u neposrednu blizinu preparata, a zatim fokusirati gledajući kroz okular poslij poslije e rada rada imerzi imerzioni oni objekt objektiv iv odmah odmah očisti očistiti ti od ulja ulja mekom mekom lanenom krpom koju prethodno treba Iako natopiti ksilolom, ili još bolje, bolje, medici medicinsk nskim im benzin benzinom om budući budući da ksilol ksilol nagriz nagriza a soč sočiva iva objektiva.   Za čišćenje se nikada ne upotr ebljava ebljava alkohol!  alkohol!  Poslije čišćenja još jednom obrisati objektiv mekom i suvom krpom i ostaviti ga na mjesto.

2.5. MIKROSKOPSKA MJERENJA

Veli Veliči čina na će ćeli lije je,, odre određe đene ne će ćeli lijs jske ke komp kompon onen ente te ili ili čita čitavo vog g organ organizm izma a (ako (ako je riječ riječ o organ organizm izmima ima mikro mikrosko skopsk pskih ih razmje razmjera) ra) se može odrediti pomoću okular-mikrometra koji se postavlja na svjetlosni mikroskop. Okular-mikrometar (Slika 4) je obično okruglo staklo koje se može umet umetnu nuti ti u okul okular ar mikr mikros osko kopa pa.. Na njem njemu u se nalaz alazii skal skala a koja koja je najč najčeš ešće će duži dužine ne 5,0 5,0 mm i izdi izdije jelj ljen ena a je na 50 podi podiok oka. a. Vrije Vrijedn dnos ostt   jednog podioka na okular-mikrometru se određuje pomoću objektivmikrometra. Objektiv-m Objektiv-mikrome ikrometar tar (Slika 5) ima izgled predmetnog stakalca na kom je ugrađena skala dužine 1,0 mm, a podijeljena je na 100 dijelova. Prema tome, rastojanje između dva podioka iznosi 0,01 mm ili 10,0 mikrometara. Vrijednost podioka na okularnom mikrometru se određuje tako što se okularni mikrometar postavi u okular, a objektivni na stočić mikroskopa. Podešavanje objektivnog mikrometra se vrši tako što se prva lijeva crta na njemu (označena sa 0) poklopi sa prvom lijevom crtom na okular-mikrometru (takođe označena sa 0). Zatim se skale prat prate e udes udesno no dok dok se ne pron pronađ ađe e mjes mjesto to gdje gdje se pokl poklap apa a podi podiok ok objektiv sa podiokom okular-mikrometra. Izbroji se broj podioka i pošto se zna da vrijedno vrijednost st jednog jednog podioka podioka na objekt objektiviv-mik mikrom rometr etru u iznosi iznosi 0,01 mm, izračuna se vrijednost jednog podioka na okular-mikrometru. Na primjer, ako se poklopi četvrti podiok na objektiv-mikrometru i šesnae šes naesti sti podiok podiok na okular okular-mi -mikro kromet metru, ru, vrijed vrijednos nostt jedno jednog g podio podioka ka okular mikrometra iznosi: 0,01x4/16 = 0,0025 mm ili 2,5 mikrometara. Kada se dobije vrijednost jednog podioka na okular mikrometru na stočić stočić mikro mikrosko skopa pa se stavi stavi prepar preparat at i izmjer izmjerii veliči veličina na posmat posmatra ranog nog objekta. Vrijednost podioka se određuje za svaku kombinaciju objektiva i okulara.

13

3. PRIPREMA PRIVREMENIH MIKROSKOPSKIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA

Često Čest o se u biol biološ oški kim m labo labora rato tori rija jama ma prip pripre rema maju ju priv privre reme meni ni mikroskopski preparati koji se koriste kratak vremenski period, nakon čega dolazi do njihovog isušivanja i deformacije posmatranog materijala.

3.1. METODE I TEHNIKE Pod pojmom mikroskopske tehnike podrazumijeva se opis postupaka koji  je primijenjen, kako pri neposrednom posmatranju živog materijala, tako i metode pripremanja privremenih i trajnih preparata. Obradu materijala i pravljenje mikroskopskih preparata moguće je podijeliti u nekoliko radnih faza: ubijanje i fiksiranje, ispiranje, siječenje (slobodnom rukom ili mikrotomom), bojenje, inkluzija u materiju u kojoj može da se sačuva duže vremena. Sve one zajedno čine jedinstven postupak čiji je krajnji cilj dobijanje privremenog ili ili trajnog mikroskopskog preparata. Prij Prije e nego nego što što se pris pristu tupi pi prav pravljljen enju ju prep prepar arat ata a neop neopho hodn dno o je izvr izvrši šititi prethodna orijentaciona posmatranja na živom materijalu u cilju provjeravanja podobnosti materijala u vezi sa postavljenim zadatkom, određivanja najpogodnijeg fiksativa i ustanovljavanja karaktera tkiva od kojih je orga organ n sa sagr građ ađen en,, jer jer od sveg svega a toga toga zavi zavisi si prim primjen jena a odgo odgova vara raju jući ćih h mikrotehničkih postupaka. Osim toga, proučavanja na živom materijalu sama po sebi su veoma značajna, često i nezamjenjiva (na primjer: kret kretan anja ja cito citopl plaz azme me), ), i zato zato,, kad kad god god je to mogu moguće će,, treb treba a vrši vršiti ti para parale leln lno o prou prouča čava vanj nje e na živo živom m i fiks fiksir iran anom om mate materi rijal jalu. u. Ove Ove dve dve metode se uzajamno dopunjuju, a nikako jedna drugu ne isključuju.

3.2. SKVOŠ PREPARAT

U savrem savremeno enojj mikros mikroskop kopsko skojj tehnic tehnici, i, poseb posebno no pri prouč proučava avanju nju proc proces esa a će ćeli lijs jske ke diob diobe, e, odre određi điva vanj nju u broj broja a hrom hromoz ozom oma a i anal analiz izii kari kariot otip ipov ova, a, prim primje jenj njuj uje e se tehn tehnik ika a prav pravlj ljen enja ja skvo skvošš prep prepar arat ata a (engleski: squash - gnječiti, spljeskati). Skvoš preparati su po svome karakteru najčešće privremeni, ali i oni se mogu posebnim postupkom preves prevestiti u trajne trajne.. Osnovn Osnovna a karak karakter terist istika ika skv skvos os prepar preparata ata je da se materi materijal jal 14

poslije fiksiranja, ispiranja i bojenja macerira i na mikroskopu posmatra i analizira ustvari macerirano tkivo. S obzirom na široku primjenu ove metode posto ji niz specifičnih postupaka u svim navedenim fazama rada. 3.2.1. Opšti princip pripremanja skvoš skvoš preparata

Skvoš preparati se prave od mladih biljnih organa čije se ćelije nalaze u fazi intenzivne deobe (vrhovi korjena, mladi prašnici, mladi koleoptili i mladi listovi). Materijal se često prije fiksiranja mora još i specijalno obraditi, posebn posebno o ako se javlja javljaju ju teškoć teškoće e pri broja brojanju nju hromoz hromozoma oma.. Naj Najčeš češći ći rea eakt ktiv ivii koji koji se u tu svr svrhu upot upotre reb bljav ljavaj aju u su hloralhidrat, ralhidrat, kolhicin, kolhicin, paradihlorbenzol, 8-hidroksihinolin i u poslednje vrijeme enzimi (citaza). Pri radu sa ovim reaktivima nužno je zaštititi ruke gumenim rukavicama. . Hloralhidrat  sa koristi u vidu 0,3 do 1 % vodenog rastvora. U ovom reaktivu reaktivu materija materijal se drži 1 sat, a zatim se isto toliko dugo ispira u vodovodnoj vodi i još 2 do 4 sata ostavlja u vlažnoj komori, pa tek onda fiksira. Hloralhidrat se koristi u cilju postizanja skraćivanja hromozoma. . Prije fiksiranja materijal, na kome želimo da ispitu jemo broj, raspored i građu građu hromoz hromozoma oma,, obrađu obrađuje je se 0,01 0,01 - 0,05% 0,05% ras rastvo tvorom rom kolhicina u trajanju od 2 sata. Zasićen rastvor paradihlorbenzola rastvor  paradihlorbenzola se takođe koristi kao sredstvo u pret pretho hodn dnoj oj obra obradi di vrho vrhova va korj korjen enči čića ća.. Zasi Zasiććen rastvor dobija se rastvaranjem 5 do 10 grama kristala paradihlorbenzola u 500 ml destilovane vode. Ovaj rastvor se u zatvorenoj posudi ostavlja u termostatu 10 do 12 sati na temperaturi od 60°C. U ovako pripremljenom rastvoru materijal sa drži 2 do 3 sata prije fiksiranja i to na temperaturi izmedu 12 i 16°C. 8-hidroksihinolin se upotrebljava kao 0,002 M rastvor pri temperaturi od 10 do 14°C. Materijal u njemu provodi provodi 3 sata i poslije ispiranja u vodovodnoj vodovodnoj vodi se fiksira. Za skvoš preparate materijal se najčešće fiksira u glacijalnoj sirćet sir ćetnoj noj kiseli kiselini ni i apsolu apsolutno tnom m alkoho alkoholu lu u odnosu odnosu 3:1 3:1 ili u fiksat fiksativu ivu Karnoa. Vrijeme koje materijal provodi u fiksativu određeno je izborom fiks fiksat ativ iva a i kara karakt kter eris isti tikam kama a sa samo mog g mate materi rija jala la.. Ta Tako ko na prim primje jerr u fiksativu Karnoa materijal ostaje 2 do 12 sati. U zavisnosti od prirode materi materijal jala, a, u navede navedenim nim granic granicama ama,, određu određuje je se vrijem vrijeme e fiksir fiksiranj anja. a. Materijal na kome želimo da brojimo hromozome fiksira se na nižim temperaturama koje se kreću izmedu +2 i +3°C. Poslije fiksiranja objekti se ispiraju u 70% alkoholu. U ovom alkoholu materijal može ili da se konzervira iIi se iz njega odmah dalje sprovodi. Objekti se poslije ispiranja maceriraju. Maceriranje se obavlja na više načina: prokuhavanjem u boji, 45% glacijalnom kiselinom, 40-45% propionskom kiselinom, u 1 n sonoj kiselini. Sledeća faza u pravljenju skvoš preparata je bojenje. Za bojenje 15

se koristi više boja: acetokarmin, acetorsein, acetolakmoid i metilensko plavo. Pripremanje boja.  Acetokarmin. 1 do 2 gr karmina rastvoriti u 45 ml glacijalne sirćetne kiseline i 55 ml destilovane vode. Rastvor boje uparavati 30 do 60 minuta. Kada se ohladi tamno crveni rastvor karmina se profiltrira i ostavlja u dobro zatvorenoj posudi sve do upotrebe.  Acetorsein. 1 gr orseina ra stvoriti u 45 ml vrele sirćetne kiseline i ostaviti da se ohladi. Kada se rastvor ohladi dodati 55 ml destilovane vode, dobro izmiješati, profiltrirati i boja je spremna za upotrebu.  Acetolakmoid . 2 gr lakmoida rastvoriti u 100 ml 45% sirćetne kiseline i uparavati do suve.supstance (oko 2 sata). Kada se završi uparavanje, ponovo dodati sirćetnu kiselinu do nivoa zapremine na početku uparavanja. Prije upotrebe boja se filtrira. Metilensko plavo. 100 do 500 mg metilenskog plavog rastvoriti u 100 ml destilovane vode. Poslije filtriranja boja se može koristiti. Iz boje se materijal prenosi na predmetno stakalce u kap 45% sirćetne kiseline iIi u hloralhidrat (5 gr hloralhidrata rastvoriti u 2 ml dest destil ilov ovan ane e vode vode), ), prek prekri riva va se pokr pokrov ovni nim m stak stakal alce cem m i prit pritiš išće će.. Pritiskanje se vrši preko filter papira, najbolje običnom gumicom za bris brisan anje je.. Prit Pritis isak ak treb treba a da bude bude takv takve e jačin jačine e da se pod pod njeg njegov ovim im dejstvom tkiva razdvoje na pojedinačne ćelije, a da se pri tome ne razbije stakalce. Na ovaj način napravljen je privremeni skvoš preparat. U cilju cilju jas jasnij nijeg eg sagled sagledava avanja nja pravlj pravljenj enja a skvoš skvoš prepa preparat rata a navešćemo jednu od većeg broja šema koje se koriste u mikroskopskoj tehnici: •

•

•

•

•

glacijalna sirćetna kiselina - apsolutni alkohol (3:1) u trajanu od 2 sata 70% alko alkoho holu lu (sve sve dok dok se os osje jeća ća miri miriss sirć sirćet etne ne ispiranje: u 70% kiseline) u vodi maceracija: u 1n sonoj kiselini na 60°C nekoliko sekundi ili minuta, ili samo prokuhavanje u boji bojenje: bojenje u acetokarminu, acetorseinu i acetolakm oidu traje 3 do 5 minuta. Pri bojenju se materijal zagrijava. Kada se maceriranje vrši u boji onda ona treba više puta da proključa, a to se postiže primicanjem i odmicanjem epruvete plamenu špiritusne lampe. fiksiranje:

materijal se prenosi na predmetno staklo u kap 45% sir sirćet ćetne ne kiseli kiseline ne iIi hloral hloralhid hidrat rata, a, pokriv pokriva a se pokro pokrovni vnim m staklom, pritišće i spreman je za mikroskopsku analizu.

Skvoš preparat:

Od privremenih, moguće je posebnim postupkom dobiti trajan skvo skvošš prep prepar arat at.. Jeda Jedan n od nač ačin ina a za prav pravlj ljen enje je takv takvih ih prep prepar arat ata a pred predlo loži žili li ssu u K on že r i i Fer Fer č a j I d, a sast sastoj ojii se u sled sledeć ećem em:: 16

privremeni skvoš preparat postavlja se na površinu parčeta suvog leda 1 do 1,5 1,5 minu minuta ta.. Zati Zatim m se neki nekim m inst instru rume ment ntom om udal udalji ji pokr pokrov ovno no stak stakal alce ce,, a na pred predme metn tnom om os osta taje je zali zalije jepl plje jen n mate materi rija jal. l. Ovak Ovako o pripr pripremlj emljen en prepar preparat at dalje dalje se sprovo sprovodi di kroz kroz 96% alkoho alkohol, l, apsolu apsolutni tni alkohol, apsolutni alkohol-ksilol u odnosu 1: 1, ksilol i na kraju se preko mate materi rija jala la stav stavlj lja a kana kanada da balz balzam am i pokr pokriv iva a se čist čistim im pokr pokrov ovni nim m stakalcem. U svakom od navedenih agenasa preparati ostaju 2 do 5 minuta.

3.3. PRIPREMA PREPARATA PREPARATA SA MATERIJALOM MATERIJALOM IZ USTA USTA

Budu Budući ći da su u usti ustima ma stal stalno no pris prisut utne ne ras astv tvor oren ene e hran hranji jive ve mate materi rije je i sitn sitnii koma komadi dići ći hran hrane, e, kao kao i stab stabil ilni ni uslo uslovi vi vlaž vlažno nost stii i temperature, usna šupljina predstavlja veoma povoljno stanište za rast različitih vrsta mikrooorganizama. Tu se mogu naći brojne bakterije iz rodova Streptococ proto ozoe zoe kao što što je Streptococcus, cus, Micrococc Micrococcus, us, Staphyloc Staphylococcus occus, prot Entamoeba gingivalis, gljivice Candida, Aspergilus, Penicillium, Saccharomyces itd. Za pripremu preparata sa mikroorganizmima iz usta materijal se može uzeti struganjem plaka sa površine zuba, sa površine desni, sa sluzokože obraza itd. Budući da se na svakom od ovih mikrostaništa razl razlik ikuj uju u uslo uslovi vi živo života ta,, i mikr mikroo oorg rgan aniz izmi mi koji koji ih nast nastan anju juju ju će biti biti različiti.  Takođe, blagim struganjem čačkalicom sluzokože obraza može se dobiti materijal za posmatranje ćelija sluznice obraza. MATERIJAL predmetno stakalce, Bunzenov plamenik ili špiritusna lampa, vata, 70% alkohol, alkohol, sterilna sterilna čačkalica, čačkalica, bakteriolo bakteriološka ška eza, marker, marker, štipaljka štipaljka (nije obavezna)

POSTUPAK

1. Steril Sterilisa isati ti radnu radnu površi površinu nu 70% alkoho alkoholom lom,, uzeti uzeti čisto čisto stakalce stakalce i označiti ga markerom. 2. Flam Flambi bira rati ti ezu ezu na plamen plamenu u do usijan usijanja ja,, sa sače čeka kati ti da se ohla ohladi di i prenijeti petljom eze dvije kapljice vode na sredinu predmetnog stakalca. 3. Uzeti Uzeti steri sterilnu lnu čačkalic čačkalicu u i njom njom zahvat zahvatiti iti malu količinu količinu materija materijala la koji se nalazi između zuba. 4. Zahvaćeni materijal prenijeti u kap vode na stakalcu, dispergovati ga i napraviti razmaz. 5. Iskorišten Iskorištenu u čačkalicu čačkalicu baciti baciti u kantu za smeće. smeće. 17

6. Ostaviti Ostaviti preparat preparat da se osuši osuši,, a zatim ga fiksir fiksirati ati na plamenik plameniku. u. 7. Da bi se mikroo mikroorga rganiz nizmi mi iz usta usta mogli mogli lakše uočiti uočiti poželj poželjno no ih je oboj obojit itii ša šafr fran anin inom om ili ili kris krista tall viol violet et bojo bojom. m. Po Potr treb ebno no je prel prelit itii razmaz jednom od ovih boja i sačekati 30 sekundi da djeluje. 8. Zatim se boja boja izlije izlije i ispere ispere destilova destilovanom nom vodom. vodom. 9. Prepar Preparat at osušiti osušiti na vazduhu vazduhu ili ga prisloni prislonititi na filter papir. papir. Nikako Nikako se ne smije brisati filter papirom! 10.Ovako pripremljen preparat se posmatra pod imerzionim objektivom.

Imerzioni objektiv ima veću moć uvećanja od klasičnog objektiva. Na preparat se stavi kapljica kedrovog ulja u koju se zatim uranja objektiv. Izoštravanje slike se vrši mikrovijkom da se ne bi slomilo stakalce. Radi lakš lakšeg eg uoča uočava vanj nja a mikr mikroo oorg rgan aniz izam ama a potr potreb ebno no je da os osvj vjet etlj ljen enje je preparata bude maksimalno i kondenzor mikroskopa spušten. Ako Ako je prep prepar arat at dobr dobro o prip riprem emlj ljen en na njem njemu u se mogu mogu uoči uočiti ti mikroorganizmi različitih oblika.

3.4. PREPARAT VISEĆA KAP Za proučavanje živih ćelija fitoplanktona, zooplanktona i drugih mikr mikroo-or orga gani niza zama ma,, tj. tj. njih njihov ovog og razm razmno noža žava vanj nja, a, pokr pokret etlj ljiv ivos osti ti,, sporu sporulac lacije ije itd, itd, kao i za izolac izolaciju iju mikroo mikrooorg organi anizam zama, a, korist koristii se prepar preparat at viseća ća kap kap″  . Za prip pripre remu mu ovak ovakvi vih h prep prepar arat ata a potr potreb ebna na su spec specijijal alna na ″  vise predmetna stakalca koja imaju udubljenje u sredini. POSTUPAK 1. Oko udublje udubljenja nja predmetn predmetnog og stakalca stakalca namazat namazatii tanak tanak sloj vazelin vazelina a (Slika (Slika 6a). 2. Na centar pokrovnog stakalca nanijeti suspenziju mikroorganizama. Ako se mikroorganizmi nanose iz tečne kulture onda se samo sterilnom ezom uzme kap kulture i postavi na staka stakalce lce (Slika (Slika 6b). 6b). Ako se mikroo mikroorga rganiz nizmi mi uzimaj uzimaju u sa čvrste čvrste podloge onda se na pokrovno stakalce prvo stavi kap fiziološkog rast rastvo vora ra,, a zati zatim m se steril sterilno nom m ezom ezom zahvat zahvatii malo malo kultur kulture e i razmuti u nanesenoj kapljici. Budući da se neobojeni mikr mikroo oorg rgan aniz izmi mi obič obično no veom veoma a slab slabo o vide vide pod pod svje svjetl tlos osni nim m mikroskopom, često je neopho-dno neopho-dno na pokrovno stakalce stakalce dodati i kap metilenskog plavog. Boja mora biti razblažena 10 000 puta da ne bi ubila mikroorganizme. Metilensko plavo se priprema tako što se rastvori 0,3 g boje u 30,0 m l 96% etanola i doda se 100 ml destilovane vode. Ovako pripremljenu boju treba razblažiti 10 000 puta miješanjem 0,01 ml boje i 100 ml destilovane vode. Kap razblaženog metil metilen ensk sko o plav plavog og se izmi izmije ješa ša sa susp suspen enzi zijo jom m mikr mikroo oorg rgan aniz izam ama a na pokrovnom stakalcu. 3. Predmetno Predmetno stakalce stakalce okrenuti okrenuti i pritisn pritisnuti uti na pokrovno pokrovno stakalce stakalce tako tako da da kap kap

18

sa kulturom mikroorganizama ostane u centru udubljenja (Slika 6c). 4. Zati Zatim m pred predme metn tno o stak stakal alce ce pažl pažljiv jivo o okre okrenu nutiti tako tako da kap kap sa kultu kulturo rom m osta ostane ne visi visititi na pokr pokrov ovno nom m stak stakal alcu cu izna iznad d udub udubljljen enja ja pred predme metn tnog og stakalca. 5. Pritis Pritisnut nutii ivice ivice pokrov pokrovnog nog stakalc stakalca a da se dobro dobro zalijep zalijepe e za vazelin vazelin (Slika (Slika 6d). 6. Ovako pripremljen preparat posmatrati pod velikim uvećanjem mikroskopa ili u imerziji. Posmatra se ivica kapljice u zatamnjenom vidnom polju.

4. PRIPREMA TRAJNIH MIKROSKOPSKIH MIKROSKOPSKIH PREPARATA   Jednom pripremljen privremeni preparat se može koristiti samo kratak vremenski period, budući da veoma brzo dolazi do njegovog isuš isušiv ivan anja ja i defo deform rmis isanja anja posm posmat atra rano nog g mate materi rija jala la.. Da bi prep prepar arat at bio bio upotrebljiv duži vremenski period, pa i nekoliko godina, potrebno je primijeniti nimalo jednostavan niz postupaka za pripremu trajnih preparata.

4.1. UBIJANJE I FIKSIRANJE

Prva Prva i veom veoma a važn važna a faza faza u obra obradi di mate materi rija jala la jest jeste e ubij ubijan anje je i fiksiranje. Ubijanje i fiksiranje materijaia obično se vrši istim agensima. Cilj Cilj fiks fiksir iran anja ja je ne sa samo mo da se ubij ubije e obje objeka kat, t, već već da se brzi brzim m i ravnomjernim prodiranjem, i to u što kraćem vremenu, prekinu životni procesi, a da se pri tome gotovo ništa, ili što je moguće manje izmijeni objekat, tako da ovaj i kasnije pokazuje u najtananijim detaljima istu građu koju je imao dok je bio živ. Jedan Jedan od osnovn osnovnih ih predus preduslov lova a uspje uspješno šnog g fiksir fiksiranj anja a je stanje stanje samog samog materijala i zato ga uvijek treba fiksirati dok je još svjež. Najbolje je da se ova faza pripremanja preparata vrši odmah nakon što je uzet materijal (npr. ako je riječ o biljnom materijalu na samom mjestu gdje biljka raste). Uspjeh fiksiranja zavisi još i od brzine prodiranja fiksativa, a ona opet zavisi od prirode i veličine materijala koji se fiksira. Sitniji objekti fiksiraju se 19

cijeli, cijeli, a krupniji (u slučaju slučaju biljnog materijala materijala korijen, korijen, stablo, list itd.) se sije sijeku ku na manj manje e dije dijelo love ve veli veliči čine ne od 0,5 0,5 do 3,0 3,0 cm. cm. Pri Pri sije siječe čenj nju u krupnijih biljnih organa na manje dijelove vodi se računa o orijentaciji.  Tako na primjer cilindrični organi se sijeku poprečno, a list normalno na centralni nerv. Fiksiranje se vrši u odgovarajućim staklenim sudovima kao što su: epru epruve vete te,, tegl teglic ice, e, mjer mjerni ni sudo sudovi vi i slič slično no.. Po Pošt što o se sa sast stav av fiks fiksat ativ iva a tokom vremena mijenja potrebno je pri fiksiranju koristiti znatno veću količinu fiksativa u odnosu na zapreminu objekta koji preparujemo. Jednom upotrebljen fiksativ više se ne upotrebljava. Ako materijal duže vremena stoji u nekom fiksativu, fiksativ treba povremeno zamijeniti svježim. Mate Materi rija jall u koji koji fiks fiksat ativ iv prod prodir ire e prav pravil ilno no,, a to znač značii brzo i ravnomjerno, ubrzo pada na dno. Da bi sa donje strane objekta fiksativ i dalje ravnomjerno prodirao, na dno suda u kome se vrši fiksiranje stavlja se vata ili filter papir. Može se desiti da iako su sve pripremne radnje dobro sprovedene neki objekti ne potonu, već ostaju na površini. Jedan od uzroka ove pojave može da bude sama priroda materijala, odnosno da je bogat intercelularima koji su puni vazduha. Ukoliko ustanovimo da materijal ne tone zato što je ispunjen vazduhom, treba na posudu u kojoj se vrši fiksir fiksiranj anje e pripo pripojiti jiti vakuum vakuum pumpu pumpu koja koja će svojim svojim radom radom odstra odstranit nitii nepo nepože želj ljan an vazd vazduh uh i omog omoguć ućit itii prod prodir iran anje je fiks fiksat ativ iva a u sve sve dije dijelo love ve materijala. U sud sa fiksativom, pored materijala koji se obrađuje, stavlja se cedulja (etiketa) veličine 1-1,5 x 3 cm na kojoj su ispisani neophodni podaci o objektu: ime vrste, datum i mjesto uzimanja materijala, naziv organa koji se preparuje itd. Za etiketiranje se upotrebljava čvršći bijeli papi papir, r, a na njem njemu u se poda podaci ci ispi ispisu suju ju iskl isklju juči čivo vo obič obično nom m graf grafit itno nom m olovkom. 4.1.1. Fiksativi koji se najčešće upotrebljavaju 95% etil alkohol 95% etil alkohol upotrebljava se kao fiksativ samo za materijal koji će se u daljem postupku sijeći rukom pomoću žileta. Ovaj fiksativ se ne preporučuje za materijal koji će biti podvrgnut finijim analizama,   jer jer izaz izaziv iva a kont kontra rakc kcij iju u cita citapl plaz azme me.. Da bi se izbj izbjeg egla la kont kontra rakc kcij ija a citopl citoplazm azme, e, a iskori iskoristi stila la dobra dobra svojst svojstva va alkoho alkohola, la, upotr upotrebl ebljav javaju aju se fiksativi koji u sebi sadrže glacijalnu sirćetnu kiselinu. Fiksativ Karnoa (Carnoy) Priprema se po sledećoj recepturi: Apsolutni alkohol Hloroform

6 ml 3 ml

20

Glacijalna sirćetna kiselina

1 ml

Ovaj fiksativ brzo prodire. Materijal se u njemu fiksira 6 do 12 sati, a može i kraće. Vrijeme fiksiranja zavisi od veličine i prirode materijala. Tako na primjer za vrhove korjena crnog luka dovoljno je fiksiranje od 10 do 15 minuta. Poslije fiksiranja materijal se ispira u apsolutno apsolutnom m alkoholu alkoholu sve dok se osjeća miris sirćetne kiseline. Ukoliko se u daljem postupku ne primjenjuje parafinska metoda, materijal se može čuvati (konzervira se) u 80% etil alkaholu. Fiksativ Karnoa nalazi široku primjenu u citološkim i embriološkim istraživanjima. Farmerov fiksativ Priprema se po sledećoj recepturi: Apsolutni alkahol Glacijalna sirćetna kiselina

6 ml 1 ml

Farmerov fiksativ se upotrebljava na isti način i u iste svrhe kao i fiksativ Karnoa.

Alkohol-formalin Priprema se po sledećoj recepturi: 50% etil alkahol 35 ili 40% prodajni formalin

100 ml 5 ml

Alkohol-formalin je veoma pogodan za fiksiranje materijala na terenu, jer istovremeno vrši i konzervaciju, tako da u njemu objekti mogu mogu da os osta tanu nu do kona konačn čne e obra obrade de.. Ka Kao o fiks fiksat ativ iv kori korist stii se pri pri anatomskim istraživanjima, a može da se upotrebi i za fiksiranje nježnijeg materijala. Formalin Priprema se po sledećoj recepturi:

21

35 ili 40% prodajni formalin voda

2-4-6 ml 98-96-94 ml

2-4% formalin je dobar fiksativ za alge i gljive. Materijal se u fiksativu drži drži do obra obrade de.. Prij Prije e obra obrade de mate materi rija jall se ispi ispira ra vodo vodom, m, jer jer pare pare formalina, koje se iz neispranog materijala odvajaju, nadražuju oči i sluzne pokožice.

Fiksativ Navašina a) Jači Jači rast rastvo vor: r: 1 % hromna kiselina 40% (p (prodajni) formalin Glacijalna sirćetna kiselina

10 ml 4 ml 1 ml

1 % hromna kiselina Destilovana voda 40% (p (prodajni) formalin Glacijalna sirćetna kiselina

15 ml 17 ml 2 ml 1 ml

b) Slabiji rastvor:

1 % rastvor hromne kiseline može se napravi ti u većoj količini, a kompletan fiksativ neposredno prije upotrebe. Materijal se fiksira 24 sata, zatim se pažljivo i dugo ispira tekućom vodom (čak i do 24 sata). Zatim se vrši dehidratacija kroz seriju alkohola sve veće koncentracije. U 80% 80% alko alkoho holu lu mate materi rija jall može može da se konz konzer ervi vira ra ili ili se post postup upak ak nastavlja dalje parafinskom metodom, koja će detaljno biti opisana u daljem tekstu. Ovaj fiksativ pogodan je za finija anatomska i embriološka istraživanja.

Fiksativ Buena (Buin) 40% prodajni formalin ....................................................................... 25 ml Pikrinska kiselina (zasićen (zasićen rastvor u 70% etil alkoholu) alkoholu) . . . . . . . . . . 75 ml Glacijalna sirćetna kiselina .................................................................5 ml

Fiksiranje traje 24 sata. Ispiranje se vrši u 70% alkoholu sve dotle 22

dok dok iz mate materi rija jala la izla izlazi zi žuta žuta boja boja.. Dehi Dehidr drat atac acij iju u obav obavit itii kroz kroz se seri riju ju alkohola sve veće koncentracije. U 80% alkoholu materijal se može arafinske metode. metode. konz konzer ervi vira rati ti,, ili ili se dalje dalje spro sprovo vodi di po prin princi cipi pima ma parafinske Upotrebljava se u iste svrhe kao i fiksativ Navašina. Fiksativ FAA (formalin-acetoacid-etil alkohol) Priprema se na sledeći način: 70% etil alkohol 40% (p (prodajni) formalin Glacijalna sirćetna kiselina

90 ml 5 ml 5 ml

U ovom fiksativu materijal ostaje 24 sata, a zatim se ispira u 70% alkoholu alkoholu 1 sat. Dehidrataci Dehidratacija ja i konzervir konzerviranje anje vrše se na isti način kao i poslije upotrebe Navašinovog i Buenovog fiksativa. Vrlo je pogodan fiksativ za citološka istraživanja.

4.1.2. Fizička fiksacija Ako se pripr priprema emaju ju prepar preparati ati sa mikroo mikroorga rganiz nizmim mima a mnogo mnogo je   jedno jednosta stavni vnije je izvrši izvršiti ti fiksac fiksaciju iju fizičk fizičkim, im, umjest umjesto o hemijs hemijskim kim putem. putem. Fizički se preparati fiksiraju toplotom tako što se suvi razmaz brzo prenese iznad plamena 5 do 6 puta, vodeći računa da materijal na predmetnom stakalcu bude okrenut na gore. Treba napomenuti da se na ovaj način usmrćuju samo vegetativni oblici mikroorganizama, dok spor sporeg egen enii opst opstaj aju, u, pa treb treba a biti biti pose posebn bno o pažl pažlji jiv v pri pri ruko rukova vanj nju u sa patogenim materijalom.

4.2. ISPIRANJE MATERIJALA

U fiks fiksat ativ ivu u mate materi rija jall os osttaje aje krać kraće e ili ili duže duže vrij vrijem eme. e. Vrij Vrijem eme e fiks fiksir iran anja ja je uvij uvijek ek nazn naznač ačen eno o u me meto todi dici ci i razl različ ičit ito o je za poje pojedi dine ne fiks fiksat ativ ive. e. Da bi dalj daljii mikr mikrot oteh ehni ničk čkii post postup upci ci mogl moglii prav pravil ilno no da se odvijaju neophodno je poslije fiksiranja materijal dobro isprati. U čemu će se ispiranje obaviti zavisi od sastava fiksativa . Ako u njegov sastav ulazi alk alkohol ohol ond onda se ispi ispira ranj nje e vrš vrši alko lkoholo holom m one konc oncen tacije koja je upotre upotreblje bljena na i pri pravlj pravljenj enju u fiksat fiksativa iva.. Na primj primjer: er: ako je fiksir fiksiranj anje e vršeno u fiksativu Karnoa, u čiji sastav ulazi apsolutni etil alkohol, onda se ispira ispiranje nje vrši vrši apsolu apsolutni tnim m alkohol alkoholom, om, dok dok će materi materijal jal fiksir fiksiran an u

23

Buenovom fiksativu biti ispiran 70% alkoholom. Ako je za fiksiranje korišćen vodeni rastvor neke materije, ispiranje se obavlja tekućom vodom i to najmanje u vremenu od jednog do tri sata, a često i duže. Najjednostavniji, ali ne i najbolji, način ispiranja je česta promjena vode ili alkohola u staklenim posudama u kojima se materijal fiksira. Mnog Mnogo o je bolj bolje e pron pronać aćii mogu mogućn ćnos ostt stal stalno nog g prot protic ican anja ja vode vode prek preko o fiks fiksir iran anog og mate materi rija jala. la. Jeda Jedan n od dobr dobrih ih,, ali ali komp kompli liko kova vani nijih jih nači načina na ispiranja je upotreba aparata koji predstavlja bateriju cjevčica koje se uvode u posude u kojima se nalazi materijal koji se ispira. Cjevčice se uvode u posude kroz gazu, kojom su ove zatvorene, i dovode do dna. Puštanjem vode preko priključka na slavini u više posuda istovremeno, ravnomjerno i stalno protiče voda onoliko vremena koliko je predviđeno da ispiranje traje (od 1 do 24 sata). Materijal se može ispirati i na drugi način. Fiksirani objekti se zajedno sa etiketama prebace u vrećice od gaze. Naravno da se pri ovom postupku podrazumijeva da se materijali iz različitih posuda ne miješaju već da svaki ima svoju vrećicu. Svaku vrećicu pri vrhu dobro vezati koncem, tako da iz njih ništa ne može ispasti. Ovako pripremljene vrećice stavljaju se u jedan širi sud u koji se, kroz lijevak, pušta vodovodna voda. Materijal u vrećicama ispira se onoliko vremena koliko je za ovu fazu rada metodikom predviđeno.

4.3. DEHIDRATACIJA I KONZERVANCIJA KONZERVANCIJA MATERIJALA MATERIJALA

Apsolutni alkohol i 96% alkohol, kao i fiksativi u čiji sastav oni ulaze istovr istovreme emeno no i dehidr dehidrira iraju ju i konzer konzervir viraju aju materi materijal jal.. Međuti Međutim, m, ako je fiksiranje obavljeno u nekom od fiksativa u čiji sastav ulaze alkoholi niže niže konc koncen entr trac acij ije, e, onda onda se posl poslij ije e ispi ispira ranj nja a dehi dehidr drat atac acij ija a vrši vrši postepeno alkoholima jače koncentracije, a konzervacija se obavlja u 80% alkoholu. Ako konzerviran materijal po svojoj prirodi ne sadrži veće količine vode u sebi (dijelovi drvenastih biljaka, vegetativni organi kserofita i slično) konzervans se mijenja jedanput u dve do tri godine. Ali ako se konzerviraju objekti čija su tkiva bogata vodom potrebna je češća promjena konzervansa, posebno na početku ovog procesa.  Tvrd materijal, kao što je na primjer drvo, obično se čuva u nekom od sledećih konzervansa: • • •

 jedan dio 95% 95% etil alkohol alkohol i jedan dio vode tri dijela 95% etil alkohola, dva dijela vode i jedan j edan dio glicerina  jedan dio 95% etil alkohola i jedan dio glicerina

Kada se materijal fiksira u nekom o d vodenih fiksativa, ispiranje se vrši, kao što je već ranije rečeno, vodom, a do alkohola u kome će se čuva čuvati ti (80% (80%)) dovo dovodi di se post postep epen eno o kroz kroz se seri riju ju alkoh alkohol ola a sve sve veće veće koncen koncentr tracij acije e (proce (process dehidr dehidrata atacij cije). e). U princ principu ipu,, nježni nježniji ji objekt objektii se poslije ispiranja u vodi uvode u 10% alkohol i dalje se provode kroz 24

sledeću seriju alkohola: 20% - 30% - 40% - 50% - 65% - 75% - 85% 95%. Tvrđi materijal se uvodi u 20% alk alkohol, a dalje proces dehidratacije teče kroz sledeće alkohole: 40% - 65% - 85% - 95%. Ukoliko se ne poštuje princip postepenog dehidriranja doći će, usljed brzog brzog izvlač izvlačenj enja a vode, vode, do promje promjena na na materi materijal jalu, u, koje koje se obično obično manifestuju smežuravanjem ćelijskih zidova, ali i na druge načine. Pojedini autori određuju različito vrijeme stajanja u rastvorima alko alkoho hola la,, me među đuti tim, m, zado zadovo volj ljav avaj ajuć ućii rezu rezult ltat atii post postiž ižu u se drža držanj njem em materijala 20 do 30 minuta u svakom od ova 3-4 rastvora alkohola. U alkoholima veće koncentracije materijal ostaje od jednog do dvanaest sati. Vrijeme dehidratacije zavisi od prirode i veličine objekta koji se tretira, tako da, u okviru datih granica, za svaki objekat treba odrediti najpogodnije vrijeme. Promjena alkohola vrši se na više načina. Najčešće se alkohol, u kome je materijal materijal već stajao stajao određeno određeno vrijeme, pažljivo pažljivo odlije odlije i odmah se umjest umjesto o njega njega sipa sipa alkoh alkohol ol potreb potrebne ne koncen koncentra tracij cije. e. Za vrijem vrijeme e sprovođenja kroz alkohole posude su dobro zatvorene i otvaraju se samo radi zamjene alkohola. Pravljenje alkohola određene koncentracije (procenta)

hidrat atac acij ije e neop neopho hodn dno o je mate materi rija jall post postep epen eno o U procesu dehidr sprovoditi kroz seriju etil alkohola sve veće koncentracije (20-40-65-7585-95%). Od 95% ili 96% alkohola dobićemo svaki drugi alkohol niže koncentracije primjenjujući sledeću tabelu: Etil alkohol % % Alkohol u ml Voda u ml

96 10 86

96 15 81

96 20 76

96 30 66

96 40 56

96 50 46

96 60 36

96 70 26

96 80 16

Tabela 1. Pravljenje alkohola alkohola odre određene koncentracije

Na tablici su označene formule za alkohole različite koncentracije od 10 do 80%. Procenat alkohola za svaki pojedini slučaj označen je srednjim brojem u svakoj koloni. Na primjer: ako želimo da od 96% napravimo napravimo 40% alkohol postupićemo postupićemo na sledeći sledeći način 96-40= 96-40= 56, a to znači da treba uzeti 56 ml destilovane vode i 40 ml 96% alkohola. Tako dobijeni rastvor sadrzi 96 ml 40% alkohola. Drugim riječima, svaku želj željen enu u konc koncen entr trac acij iju u alko alkoho hola la dobić dobićem emo o ako ako u me menz nzur uru u sipa sipamo mo onoliko mililitara 96% alkohola koliki procenat želimo da napravimo i do 96 mililitara dolijemo destilovanu vodu. Na primjer: želimo da napravimo 23% alkohol. U menzuru treba sipati 23 ml 96% alkohola i izvršiti dopunu destilovanom vodom do 96-tog podioka (dodati 73 ml vode).

25

4.4. METODE PRAVLJENJA PRESJEKA

U okviru anatomskog praktikuma rijedak je materijal koji se može posmat posmatrat ratii pod mikros mikroskop kopom om bez pretho prethodno dnog g sje sječen čenja. ja. Materi Materijal jal se sije siječe če slob slobod odno nom m ruko rukom m pomo pomocu cu žile žileta ta ili ili brij brijač ača a i spec specij ijal alni nim m aparatom mikrotomom. Za sječenje na mikrotomu objekti se prethodno moraju moraju pripr pripremi emiti ti rel relati ativno vno slo složen ženim im postup postupkom kom.. Međuti Međutim, m, sje sječen čenje je mikrotomom neophodno je primjeniti pri citološkim, embriološkim, pa i mnogim mnogim histološki histološkim m istraživa istraživanjima njima ili pak kada je objekat objekat toliko sitan i njež nježan an da ga drug drugač ačij ije e nije nije mogu moguće će isje isjeći ći.. Dvij Dvije e najče najčešć šće e me meto tode de pravljenja presjeka za preparate jesu parafinska metoda i metoda sa smrznutim tkivom, koje će opširno biti opisane u poglavljima 6 i 7.

4.5. INKLUZIJA U KANADA KANADA BALZAM BALZAM

Da bi se preparat mogao očuvati duži period vrši se njegova inkluzija u kanada balzam. Inkluziranje u kanada balzam vrši se na taj način što se na predmetno staklo, izvađeno iz ksilola, preko preparata, nane nanese se kap kap kana kanada da balz balzam ama a i pres presje jek k pažl pažlji jivo vo prek prekri rije je pokr pokrov ovni nim m stakalcem. Presjeci koji nisu Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla u kap kanada balzama koja je prethodno nanijeta na čisto predmetno stakal stakalce. ce. Presje Presjeci ci stavl stavljen jenii u kanada kanada balzam balzam i prekri prekriven venii pokro pokrovni vnim m stak stakal alce cem m os osta tavl vlja jaju ju se se,, zašt zaštić ićen enii od praš prašin ine, e, najm najman anje je 24 sa sata ta u horizontalnom položaju. Za to vrijeme, zahvaljujući isparavanju ksilola u kome kome je kana kanada da balz balzam am rast rastvo vore ren, n, ploč pločic ica a prij prijan anja ja uz pokr pokrov ovno no stak stakal alce ce.. Ovim Ovim je prep prepar arat at goto gotov v i može može se stav stavit itii u kuti kutiju ju za prepar preparate ate.. Ipak Ipak treba treba napome napomenut nutii da prepar preparati ati još nisu nisu defini definitiv tivno no osušeni, pa zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica ne pomjeri.

4.6. OBILJEŽAVANJE PREPARATA Svako predmetno s takalce mora da bude obilježeno tj. numerisano. Numeracija se vrši specijalnim olovkama ili markerima čiji se trag na stak staklu lu ne briš briše e u vodi vodi,, alko alkoho holu lu i ksil ksilol olu. u. Ovakv Ovakve e olov olovke ke se mogu mogu nabaviti u trgovinama koje prodaju laboratorijski materijal. U slučaju da do takvih olovaka ne može da se dođe pripremamo tuš koji ima sve potrebne osobine (ne briše se). U tom cilju treba izmiješati jednake dijelove tuša, bjelanceta i glicerina i tome dodati kristalić timola ili fenola. Pri upotrebi ovako napravljenog tuša, poslije numerisanja (obilježavanja), predmetno stakalce treba lako zagrijati, ali 26

samo na mjestu gdje je ispisana oznaka. Ovako obilježena predmetna stak stakal alca ca neć eće e izgu izgubi biti ti nume numerrac acij iju u pri pri dalj daljoj oj obrad bradii prep prepar arat ata. a. Istovremeno sa obilježavanjem preparata vodi se i evidencija u posebnoj sves svesci ci.. Evid Eviden enci cija ja treb treba a da bude bude što što potp potpun unijija a kako kako bi se anal analiz iza a goto gotovi vih h preparata mogla lakše i preciznije izvršiti. Kad Ka da čit čitav post postu upak pak prav pravlj ljen enja ja prep prepar arat ata a bude bude zavr avrše šen n (depar (deparafi afinis nisanj anje, e, bojenj bojenje, e, inkluz inkluzija ija u kanada kanada balzam balzam)) na predme predmetna tna stakalca lijepi se etiketa na kojoj su zabilježeni svi potrebni podaci koji se odnose na preparat.

5. BOJENJE PREPARATA Pri proučavanju anatomske građe, bilo na privremenom ili trajnim preparatima, u najvećem broju slučajeva, vrši se bojenje. Za svaki obje objeka kat, t, u zavi zavisn snos osti ti od njeg njegov ove e stru strukt ktur ure e i cilj cilja a rada rada,, odab odabir ira a se odgo odgova vara raju jući ći fiks fiksat ativ iv i boja boja.. Pri Pri prav pravlj ljen enju ju anat anatom omsk skih ih prep prepar arat ata a najčešće se primjenjuje diferencijalno bojenje, odnosno bojenje sa više boja. Prema načinu rada bojenje može biti progresivno ili regresivno. Pri progresivnom bojenju presjeci se stavljaju u slab rastvor boje, tako da se vremenam obojenost preparata povećava. Na ovaj način se na primje primjerr boji boji hemato hematoksi ksilin linom. om. Češ Češće će se primje primjenju njuje je regres regresiva ivan n način način bojenja, pri čemu se preparati prvo preboje, a zatim se u tzv. procesu diferenciranja uklanja višak boje sve dotle dok se ne dobije željena nijansa. Diferenciranje je, prema tome, uklanjanje viška boje putem ispiranja. Diferenciranje se vrši u rastvaraču u kome je i boja, kojom se preparat boji, rastvorena, a intenzitet obojenosti preparata se stalno kontroliše mikroskopom. Boje se najčešće upotrebljavaju kao zasićeni vodeni ili alkoholni rastvori (najčešće odgovaraju 1-2% rastvoru boje), mada se neke vrlo lijepo rastvaraju u karanfilićevom ulju (na primjer oranž, svijetlo zeleno i druge). 5.1.

BOJE I RASTVORI BO BOJA

Prem Prema a pori porije jekl klu u boje boje za boje bojenj nje e prep prepar arat ata a mogu mogu biti biti prirodne i vještačke. Prirodne boje su ekstrakti dobijeni iz biljaka, životinja ili minerala, tačke boje boje se dobijaj dobijaju u npr. npr. karmin karmin,, šafran šafranin, in, lakmus lakmus,, orcein orcein i druge. druge. Vješ Vještačke sintetskim putem iz katrana kamenog uglja. Budući da je u početku razvoja industrije katranskih boja anilin služio kao ishodišni materijal, sintetske boje se još nazivaju i anilinskim bojama. Boje se kupuju u trgovinama i nalaze s e u čvrstom stanju, najčešće u obli obliku ku kris krista tala la ili ili u prah prahu. u. Ra Rast stvo vorr se može može prip pripre remi miti ti prem prema a tzv. tzv. direktnom načinu, kada se boja rastvara direktno u destilovanoj vodi, ili indirektnom načinu, kada se prvo pripremi zasićeni alkoholni rastvor

27

Slika 19.Benzolov prsten

boje. To je matični rastvor od kog se poslije pravi razblaženi rastvor boje boje u dest destilo ilova vano nojj vodi vodi.. Vode Vodeni ni rast rastvo vori ri su manj manje e post postoj ojan anii pa je preporučljivo pripremiti matični rastvor koji može duže stajati, a od njega se lako priprema pravi rastvor za bojenje. Matični rastvor se pravi u 96% alkoholu tako što se u određenu količinu alkohola postepeno dodaje boja dok se ne pojavi talog koji se dalje ne rastvara. Rastvor se ostavi 2-3 dana u termostatu na 30°C, a zatim se prema potrebi pravi rastvor za bojenje. Na 100 ml dest ilovane vode dodaje se matičnog rastvora: • • •

Fuksin 10 ml Gencian violet 15-20 ml Metilensko plavo 20-30 ml

5.2. HEMIJSKA OSNOVA BOJENJA

Boje za bojenje preparata su ciklična jedinjenja koja u osnovi sadr sa drže že benz benzol olov ov prst prsten en (Sli (Slika ka 19) 19) za koji koji su veza vezane ne hrom hromof ofor orna na i auskohromna grupa. Hromoforna grupa je odgovorna za obojenost, a auksohromna grupa omogućuje vezanje jedinjenja sa molekulima ćelije (npr pikrinska kiselina ima žutu boju jer sadrži hromofornu nitro grupu – NO2, dok dok je za njen njeno o vezi veziva vanj nje e sa će ćelij lijsk skim im mole moleku kuli lima ma odgo odgovo vorn rna a auksohromna hidroksilna grupa OH- ). ja pri pri elek elektr trol olit itič ičko kojj Boje Boje se u zav zavisn isnosti osti od njiho jihovo vog g pon ponaša ašan  ja disocijaciji dijele na kisele i bazne. Kisele boje imaju afinitet za bazne ćelijske komponente jer sadrže karboksilnu ili hidroksilnu grupu koje pri disoci disocijac jacija ijaciji ciji imaju imaju negati negativan van naboj. naboj. Ove boje boje imaju imaju veći veći afinit afinitet et prema citoplazmi pa se još nazivaju i citoplazmatske boje i uglavnom je boje u crveno ili ružičasto. Za razliku od njih, bazne boje sadrže amino grupu, koja pri disocijaciji ima pozitivan naboj, pa boje kisele ćelijske komponente, kao što je jedro, u plavo. Najčešće korištene kisele boje su eozin, kiseli fuksin, pikrinska kiselina i eritrozin, a od baznih boja se najčešće koriste metilensko plavo, kristal violet, bazni fuksin, gencian violet itd.

5.3. METODE BOJENJA

S obzirom na postojanje velikog broja boja koje se primjenjuju prilikom pravljenja preparata, opisaćemo pravljenje i upotrebu samo onih boja koje se najčešće upotrebljavaju.

28

5.3.1. Hematoksilinska metoda biljnog porijekla, porijekla, a dobija se iz drveta tropske biljke Hematoksilin je boja biljnog bojenj nje e se kori korist stii produ rodukt kt oksi oksid dacij acije e Haematoxy Haematoxylon lon campechia campechianum num. Za boje hematoksilina hematein. S obzi obziro rom m da post postoj ojii više više nači načina na za prip pripre rema manj nje e ove ove boje boje,, opisaćemo pripremu Delafildovog i Hajdenhajnovog hematoksilina.

Delafildov hematoksilin - Napraviti zasićen rastvor amonijum alauna u vodi (amonijum alaun = aluminijum amonijum sulfat = alumen ammonium; formula: AINH 4(SO4)2 + 12 H2O). - 1 gr hematoksilina rastvoriti u 6 ml apsolutnog alkohola. U 100 ml zasi zasićen ćenog og rast rastvo vora ra amon amonij ijum um alau alauna na u vodi vodi doda dodati ti kap kap po kap kap hematoksilina rastvorenog u alkoholu. Ovako pripremljena boja stoji na svjetlosti 7 dana u boci koja je zatvorena vatom. Poslije 7 dana rastvor se profiltrira i dodaje mu se 25 ml hemijski čistog glicerina i 25 ml metil alkohola. Kroz 4 sata (rastvor treba da potamni) ponovo se vrši filtriranje. Prof Profilt iltro rova vana na boja boja se sipa sipa u bocu bocu koju koju poto potom m treb treba a dobr dobro o zapu zapuši šititi i izlo izloži žititi djelovanju svjetlosti ne manje od 2 mjeseca. Tek tada je boja spremna za upotrebu. Mnogi praktičari preporučuju da se ovako napravljena boja prije upotrebe razblaži (na 100 ml destilovane vode dodati 30 ml pripr pripremlj emljene ene boje). boje). Ovako Ovako razbla razblažen ženim im ras rastvo tvorom rom boje boje prepar preparati ati se nešto duže boje, ali je moguće izvesti preciznije bojenje. Delafil Delafildov dov hemato hematoksi ksilin lin je vrlo vrlo postoj postojana ana boja. boja. Prema Prema podac podacima ima koje koje navodi Černberlen (Chamberlain, C., 1921) bila je upotrebljena i dala karakterističnu reakciju boja stara 20 godina. Duži Dužina na boje bojenj nja a (vri (vrije jeme me boje bojenj nja) a) ovom ovom bojo bojom m razl različ ičit ito o je za pojedine preparate, a varira od 3 do 30 minuta. Ako je materijal poslije fiksiranja dobro ispran sa bojenjem ne smije biti problema. Naročito dobro treba isprati materijal ako je fiksativ sadržao neku kiselinu. Iz boje preparati se prenose u tekuću vodu i dobro se isperu. Za para parafi fins nske ke pres presje jeke ke ispi ispira ranj nje e traj traje e 5 do 10 minu minuta ta,, a za debl deblje je prep prepar arat ate e (sje (sječe čene ne ruko rukom) m) 20 do 30 minu minuta ta.. Pri Pri ispi ispira ranj nju u voda voda se mijenja sve dok se u njoj pojavljuju i najmanji znakovi tragova boje. Iz vode se preparati prebacuju u alkohole sve jače koncentracije (vidi: dehidratacija) i na kraju se preko ksilola inkluziraju u kanada balzam. Pri prebacivanju iz vode u alkohol na preparatima se može obrazo obrazovat vatii talog talog.. Tal Talog og se odstra odstranju njuje je provođ provođenje enjem m prepar preparata ata kroz kroz zakiseljeni alkohol koji se priprema tako što se na 100 ml 70% alkohola doda 1 do 2 kapi sone kiseline (HCl). Iz ovog alkohola preparati se prenose u čist 70% alkohol u kome treba da promijene boju - od crvenkaste da postanu purpurni. Pošto se prenošenjem iz zakiseljenog alkohola u čist uvijek prenesu i male količine kiseline preporučuje se iIi višekratno ispiranje u čistom 70% alkoholu ili se u 70% alkohol doda kap kap amon amonij ijak aka a koji koji neut neutra rali liše še dejs dejstv tvo o kise kiseli line ne.. Jedn Jedna a od če češć šće e 29

upot upotre reblj bljav avan anih ih še šema ma za boje bojenj nje e Dela Delafi fild ldov ovim im hema hemato toks ksil ilin inom om je sledeća: • •

• • • • • • • • • •

Bojenje (iz vode, 35% ili 50% alkohola) .........................3 do 30 min. Ispiranje u tekućoj vodi: za parafinske presjeke ............5 do 10 min. o zapresjeke žiletom ................20 do 30 min. Dehidratacija: 35% alkohol.......5 minuta 50% alkohol...............................5 minuta 70% zakiseljeni alkohol.............u ovom alkoholu vrši se diferenciranje koje se prati pod mikroskopom. 70% alkohol (nezakiseljen)preparate isprati više puta 85% alkohol ............................................5 minuta 95% alkohol ............................................5 minuta 100% alkohol ..........................................5 minuta 100% alkohol i ksilol u odnosu 1:1 ..........5 minuta ksilol ........................................................5 minuta inkluzija u kanada balzam

Ako je poslije ispiranja u vodi preparat blijedo obojen treba ga ponovo vratiti u boju. - Ako u zaki seljenom alkoholu boja brzo blijedi (za 4 do 5 sekundi) treba smanjiti količinu kiseline. - Čim se boja u 70% alkoholu počne mijenjati od crvenkaste u purp purpur urnu nu,, dalj daljii tok tok rada rada kont kontro roli lisa sati ti pod pod mikr mikros osko kopo pom. m. Ako Ako se konstatuje da je preparat slabo obojen treb a ga ponovo vratiti u boju, a ako  je prebojen u zakiseljeni alkohol. Inkl Inkluz uzir iran anje je u kana kanada da balz balzam am vrši vrši se na taj taj nači način n što što se na predmetno staklo, izvađeno iz ksilola, preko preparata, nanese kap kana kanada da balz balzam ama a i pres presje jek k pažl pažlji jivo vo prek prekri rije je pokr pokrov ovni nim m stak stakal alce cem. m. Presjeci Presjeci koji nisu Iijepljeni Iijepljeni prenose se iz sahatnog stakla stakla u kap kanada balz balzam ama a koja koja je pret pretho hodn dno o nani nanije jeta ta na čist čisto o pred predme metn tno o stak stakal alce ce.. Presjeci stavljeni u kanada balzam i prekriveni pokrovnim stakalcem ostavljaju se, zaštićeni od prašine, najmanje 24 sata u horizontalnom položa položaju. ju. Za to vrijem vrijeme, e, zahval zahvaljuj jujući ući ispara isparavan vanju ju ksilol ksilola a u kome kome je kanada balzam rastvoren, pločica prijanja uz pokrovno stakalce. Ovim   je trajni trajni preparat preparat gotov gotov i može se staviti u kutiju kutiju za preparate. preparate. Ipak treba napomenuti da preparati još nisu definitivno osušeni, pa zato treba sa njima još izvijesno vrijeme postupati pažljivo da se pločica ne pomjeri.

Hajdenhajnov hematoksilin gvožđa . Ovu boju je 1892. godine u tehniku pravljenja preparata uveo Hajdenhajn (Haidenhain) i do danas je ostala jedna od osnovnih boja pri pravljenju preparata. Za bojenje po ovoj metodi pripremaju se dva rastvora koji se nikada ne miješaju. A - 2% - 4% vodeni rastvor feriamonium sulfata. B - 0,5% vodeni ili alkoholni rastvor hematoksilina.

30

Rastvor feriamonium sulfata ne boji preparate, već samo služi kao štavilo, tj. priprema preparate da bolje prime boju. Ovaj rastvor se može upotrebiti čim se kristali feriamonium sulfata rastvore, a održava se oko 2 mjeseca. Pripremanje hematoksilina. 1 gr hematoksilina rastvoriti u 10 mililitara 96% etil alkohola i dodati 90 ml destilovane vode. Sud zatvoriti vatom i ostaviti na svjetlosti 2 do 3 nedjelje da boja sazri. Prije upotrebe boja se razblaži destilovanom vodom (1:1), tako da se dobije 0,5% rastvor hematoksilina. Proc Proces es sa sazr zrij ijev evan anja ja može može da se ubrz ubrza a zagr zagrij ijav avan anjem jem.. U tom tom slučaju 1 gram hematoksilina stavlja se u 100 ml destilovane vode i zagrijava se sve do rastvaranja kristala boje. Ovaj rastvor više puta mora da se filtrira i kada se ohladi može da se upotrijebi za bojenje. Da bi se spriječilo razviće mikroorganizama u boju se dodaje kris krista tali lićć timo timola la.. Ha Hajd jden enha hajn jnov ov hema hemato toks ksil ilin in gvož gvožđa đa može može da se upotrijebi više puta za bojenje, ali se pri tome mora paziti da se u njega ne unese feriamonium sulfat. Zagađivanje boje feriamonium sulfatom uočava se lako, jer hematoksilin počinje da tamni. Boja može da se upotrebljava duže vremena (do 6 nedjelja, ali povremeno mora da se profiltrira i da se izvrši proba da Ii je još uvek upotrebljiva. Proba ispravnosti boje vrši se tako što se u stakleni sud stavi nekoliko kapi hematoksilina čiju upotrebljivost ispitujemo, i prelijemo ih vodovodnom vodo vodom. m. Ako Ako se voda voda oboj obojii Ijub Ijubič ičas asto to hema hemato toks ksil ilin in je još još uvij uvijek ek upotrebljiv, a ako boja vode bude žuta ili prljavo Ijubičasta treba praviti novu boju.

opšta šema bojenja Hajdenhajnovim hematokslilinom gvožđa: 1. Preparate Preparate staviti staviti u 4% 4% feriamonim feriamonim sulfat sulfat ............. ................6 ...6 do 12 sati sati 2. Dobro isprati tekućom vodom...........................10 minuta ili, ako se ispiranje ne vrši tekućom vodom, vodu mijenjati više puta (4 do 5 puta). 3. Prenijeti Prenijeti preparat preparate e u hematoksi hematoksilin lin .............. ...................... .......... .. 12 do 14 sati sati 4. Isprati Isprati preparate preparate tekućom tekućom vodom vodom 5. Dife Difere renc ncir iran anje je u 2% feri feriam amon oniu ium m sulf sulfat atu. u. Dife Difere renc ncir irat atii svak svakii preparat pojedinačno u petri kutiji i kontrolisati pod mikroskopom oduzimanje viška boje. Kada jedra budu jasno vidljiva preparate prenijeti u sud sa protočnom vodom ....... ......................................1/2 sata do 1 sat 6. Dehidratac Dehidratacija ija se vrši kroz kroz seriju postupn postupno o jačih alkohola alkohola počevši počevši od 35% zaključno sa apsolutnim. Zatim se preko alkohol-ksilola i čistog ksilola preparati inkluziraju u kanada balzam.

Kao što Kao što se vidi vidi opis opisan anii nači način n boje bojenj nja a zaht zahtij ijev eva a nešt nešto o više više vremena. Međutim, ako preparator iz nekih razloga treba brže da radi može se preporučiti sledeći postupak: Preparate koji se nalaze u 4% feriamonim sulfatu staviti 30 do 40 minuta u 31

termos termostat tat na temper temperatu aturu ru 45°C do 56°C. Zati Zatim m ih ispr isprat atii kao kao u pret pretho hodn dno o akođe u opis opisan anom om post postup upku ku i uves uvestiti ih u hema hemato toks ksililin in.. Boje Bojenj nje e vrši vršititi t ako term termos osta tatu tu pri pri isto istojj temp temper erat atur urii i isto isto vrij vrijem eme e kao kao i štav štavlj ljen enje je.. Diferenciranje se obavlja u 2% feriamonium sulfatu, a dehidratacija kao što je opisana u opštoj šemi. brzo i lije lijepo po boji boji celul celuloz ozne ne će ćeli lijs jske ke zido zidove ve,, sluz sluzi, i, Hematoksilin brzo citoplazmu i jedra Ijubičasto i javlja se kao jedna od široko prim primje jen njiva jivani nih h boja boja u anat anato omskim skim,, em embr brio iolo lošk škim im i cit citolo ološkim škim istraživanjima. Pri Pri dvoj dvojno nom m boje bojenj nju u daje daje lije lijepe pe komb kombin inac acijije e sa šafra šafranin ninom om (koj (kojii boji boji odrvenjene zidove kod biljnih preparata crveno). Hematein je osnovna supstanca hematoksilina od koje u stvari i potiče karakteristična boja. Pošto je hemijski sastav hemateina poznat, ona ona se indu indust stri rijs jski ki proi proizv zvod odii kao kao sint sintet etič ička ka boja boja i u potp potpun unos osti ti zamjenjuje hematoksilin, boju koja se dobija ekstrakcijom iz drveta biljke Haematoxylon campechianum. Hematein se priprema tako što se 0,5 ml hemateina rastvori u 25 ml 90%

alkohola, a zatim je potrebno uzeti 25 grama stipse (KAl (SO 4)2, x 12 H2O) i rastvoriti je u 500 ml vode. Spojiti rastvor stipse sa pripremljenom bojom i malo zagrijati da se stipsa rastvori. Kada se ovaj rastvor ohladi boja je spremna za upotrebu. Šafranin je boja koja daje dobre rezultate ako se kao fiksativ upotrebi alkohol ili neki od fiksativa koji sadrži hromnu kiselinu. Boja se upotrebljava kao 1% vodeni ili, češće, alkoholni rastvor, a priprema se po sledećem receptu: • • •

Šafranin..............................................1 gr  95% etil alkohol.................................50 ml voda.....................................................50 ml

Parafi Parafinsk nskii prepar preparati ati poslije poslije depara deparafin finisa isanja nja u boju boju se prenos prenose e iz 50% alkohola, a presjeci napravljeni od svježeg materijala prvo se stavljaju u 95% alkohol 1/2 sata, pa se zatim prenose u boju. Presjeci pravljeni slobodnom rukom od materijala fiksiranog u alkoholu direktno se prenose u boju. Ako je materijal bio fiksiran u alkohol-formalinu presjeci se prvo sprovedu kroz 50% alkohol (10 minuta), pa se tek poslije toga boje. Vrijeme bojenja varira od 5 minuta do 24 sata, a zavisi od karakteristika tkiva koje proučavamo. Ako se radi o biljnim preparatima može se reći da mate materi rija jall u kome kome je step stepen en odrv odrven enje jeno nost stii (lig (ligni nifi fika kaci cije je)) manj manje e izražen treba bojiti duže. Diferenciranje se vrši pod mikroskopom u 50% alkoholu. Ako su presjeci prebojeni, a to se zna na osnovu vremena potrebnog za diferenciranje (za 5 do 10 minuta ne dobije se željeni ton boje), treba u 100 ml alkohola, u kome se vrši dife difere renc ncir iran anje je doda dodatiti 1 do 2 kapi kapi sone sone kise kiseliline ne (HCl (HCl). ). Posl Poslijije e upot upotre rebe be pratii čist čistim im 50% 50% zaki zakise selje ljeno nog g alko alkoho hola la prep prepar arat ate, e, iIi iIi pres presjek jeke, e, dobr dobro o isprat alkoholom tako da se kiselina potpuno odstrani. Dehidratacija se vrši na već opisani način, kroz seriju alkohola sve  jačih koncentracija počev od 70% do 100%, a u svakom ostaju po 5 32

minuta. Prije inkluzije u kanada balzam preparati iIi presjeci prolaze kroz ksilol-alkohol (1: 1) i čist ksilol (po 5 minuta u svakom). Pri dvojnom bojenju šafranin daje lijepe kombinacije sa hematoksilinskim bojama, oranž, svijetlo zelenim, vodenim plavim itd. i td. Vodeno plavo (Wasserblau). Vodeno plavo upotrebljava se u vidu 1% vodenog rastvora, ali ljepše nijanse plave boje ova boja daje ako se pripremi na sledeći način: Napraviti zasićen rastvor pikrinske kiseline (C6H3N307) u 50% alkoholu. U ovaj rastvor postepeno se dodaju kristali boje vodeno plavog sve dotle dok se ne dobije željena nijansa plave boje. Boja može da se napravi i tako što se boja rastvori u 50% alkoholu i tek tada treba postepeno dodavati rastvor pikrinske kiseline sve dotle dok se ne dobije žeIjena nijansa plave baje. Ovom Ovom bojo bojom m se boje boje vrlo vrlo brzo brzo,, za 30 se seku kund ndii do 1 minu minuta ta,, celulozni biljni ćelijski zidovi. Diferenciranje i dehidratacija vrše se u 96% 96% alko alkoho holu lu.. Pri dvo dvojnom jnom bojen ojenju ju daje aje lije lijep pe komb kombin inac acij ije e sa šafraninom i hrizoidinom. Oranž G se upotrebljava kao 1% vo deni iIi alkoholni rastvor, a može da se pripremi i kao zasićen rastvor u karanfilićskom ulju (1 gr boje na 100 ml karanf karanfili ilićsk ćskog og ulja ulja pribl približn ižno o odgova odgovara ra zasićen zasićenom om ras rastvo tvoru) ru).. Alko Alkoho holn lnii ras astv tvor or ove ove boje boje prav pravii se u apso apsolu lutn tnom om alko alkoho holu lu.. Boji Boji celulozne biljne zidove u žuto. Preparati iz vode prenose se u vodeni rastvor boje, a iz apsolutnog alkohola u alkoholni rastvor iIi u zasićeni rastvor boje u kara karanf nfil ilić ićsk skom om ulju ulju.. Boje Bojenj nje e sa oran oranžž G je krat kratko ko,, oko oko 1 minu minuta ta.. Diferenciranje se vrši u onom agensu u kome je b oja rastvorena. Oranž G  je pogodna boja za rad pri dvojnom iIi trojnom bojenju i daje dobre kontraste sa šafraninom. Hrizoidin boji odrvenjene zidove žuto, a upotrebljava se kao 1-2% vodeni rastvor. Vrijeme bojenja kreće se od 5 do 20 minuta. Daje dobre kontraste sa svijetlo zelenim. Svijet Svijetlo lo zeleno zeleno.. Ova boja se rastvara u vodi, alkoholu i karanfilićskom ulju. Vrlo brzo boji celulozne zidove, za 1 minut, i daje lijepe kombinacije sa šafraninom. Najčešće se upotrebljava kao 0,5% ili 1% rast rastvo vorr u 50% 50% iIi iIi 70% 70% alko alkoho holu lu.. Na Najl jlje jepš pše e nija nijans nse e zele zelene ne boje boje dobijaju se kada se rastvori u karanfilićskom ulju. Preparati se u boju uvode ili iz vode, ili iz 50%, odnosno 70% alkoho alkohola. la. Ako je boja boja rastv rastvore orena na u karanf karanfili ilićsk ćskom om ulju, ulju, prepa preparat ratii ili presjeci se u boju prenose poslije apsolutnog alkohola. Bojenje traje 1 do 30 minuta, a diferenci-ranje se vrši u karanfilićskom ulju. Poslije provođenja kroz ksilol-apsolutni alkohol (1: 1) i čist ksilol inkluziraju se u kanada balzam.

5.3.2. Dvojno bojenje preparata

Preparati se mogu bojiti jednom od odabranih boja kojom se ističe

33

neki detalj u građi proučavanih organa, tkiva ili ćeiija. Međutim, češće se pri izradi anatomskih preparata primjenjuje metoda kombinovanja boja (diferencijalno bojenje), sa željom da se jasnije istaknu razlike u građi. Na primjer, ako želimo da upoznamo građu provodnih snopića izabraćemo dve boje od kojih će jedna bojiti ksilemski a druga floemski dio. Ako se odlučimo za kombinovano bojenje preparata moramo voditi računa da druga boja često utiče na prethodno upotrebljenu boju. Pri ovom načinu rada neophodan je strpljiv i pažljiv postupak pri kome treba svaki detalj kritički ocijeniti, kako bi se uočili svi uzroci koji bi, eventualno, doveli do nezadovoljavajućeg rezultata. Šafranin i svijetlo zeleno. Pripremiti šafranin i obojiti preparate kao što je već opisano. Zatim izvršiti dehidrataciju do onog alkohola u kome je rastvarena boja • aspolutno tnog g alkaho alkahola la svij svijet etlo lo zele zeleno no (70% (70% ili ili 100% 100% alko alkoho hol) l).. Do aspolu preparati se dovode i kada je boja svijetlo zeleno rastvorena u karanfilićskom ulju. Poslije diferenciranja preparati se prosvetljavaju u ksilolu i inkluziraju u • kanada balzam. Svije Svijetlo tlo zele zeleno no boji boji celu celulo lozn zne e zido zidove ve zele zeleno no,, a šafra šafrani nin n odrv odrven enje jene ne,, kutinizirane i oplutnjale crveno. •

Primjer jedne opšte šeme rada za parafinske preparate od deparafinisanja do uključivanja u kanada balzam izgledao bi ovako: 1. ksilo siloll 20 20 min min.. 2. ksilol ksilol-ap -apsol solutn utnii alkoho alkoholl 20 min. min. 3. apsolu apsolutni tni alkoho alkoholl 10 10 min. min. 4. 95% 95% alk alkoh ohol ol 5 min. min. 5. 85% 85% alk alkoh ohol ol 5 min. min. 6. 70%70%- alko alkoho holl 5 min. min. 7. 50% alkoh alkohol ol 5. 5. min. min. safran safranin in 8. 50% alkoh alkohol ol (dif (difere erenci nciran ranje) je) 9. 70% 70% alk alkoh ohol ol 5 min. min. 10.95% alkohol 5 min 11.apsolutni alkohol 5 min. 12. svijetlo zeleno u kara nfilićskom ulju 13.karanfilićsko ulje (diferenciranje) 14.ksilol-apsolutni alkohol 5 min. 15.ksilo 15. ksiloll 5 min. 16.kanada balzam

Na ovaj način mogu da se boje i preparati sječeni slobodnom rukom od svježeg ili fiksiranog materijala, samo je u tom slučaju proces nešto skraćen jer se isključuje prva faza rada (deparafinisanje) i počinje se ili od 95% alkohola ili od 50% alkohola.

34

Dela Delafi fild ldov ov he hema mato toks ksil ilin in i šafr šafran anin in.. Ako se odlučite za ovu kombinaciju boja onda se preparati, poslije deparafinisanja, prvo boje hematoksilinom (vidi Delafildov hematoksilin), a zatim se isperu vodom i pren prenos ose e u ša šafr fran anin in.. Dalj Daljii tok tok proc proces esa a teče teče na već već opis opisan an nači način n (dehidratacija, inkluzija u kanada balzam). Svi neodrvenjeni elementi hematoksilinom se boje Ijubičasto, a odrvenjeni šafraninom crveno. 5.3.3. Ostale metode

Azan Ova metoda se tradicionalno koristi za bojenje vezivnog tkiva. Kola Ko lage gena na vlak vlakna na,, baza bazaln lne e me memb mbra rane ne i muci mucin n se boje boje plav plavo, o, jedr jedra a crveno, a mišići i eritrociti narandžasto-crveno. Trihromne metode bojenja (Masson) Pos osttoji veli veliki ki broj trih trihrromnih mnih metod etoda a u koji kojim ma se kor koriste iste kombin kombinaci acije je tri različ različite ite boje boje radi radi specif specifičn ičnog og bojenj bojenja a i razlik razlikova ovanja nja vezi vezivn vnog og tkiv tkiva a od drug drugih ih tkiv tkiva a (miš (mišić ića) a).. Jedr Jedra a i drug druge e bazo bazofi filn lne e stru strukt ktur ure e se boje boje plav plavo, o, kolage kolagen n zele zeleno no ili ili plav plavo o (u zavi zavisn snos osti ti od varijante bojenja), a citoplazma ćelija, mišići i eritrociti jasno crveno. PAS metoda (perjodna kiselina-Schiff) Za prikazivanje ugljenih hidrata (glikogen, glikoproteini) u tkivu koristi se PAS histohemijska metoda. Bazira se na oksidativnom dejstvu perjodne kise kiseli line ne,, pri pri če čemu mu se stva stvara raju ju alde aldehi hidn dne e grup grupe, e, za koje koje se vezu vezuje je bezbojni Šifov reagens koji nakon toga postaje ružičaste boje. Ovom metodo metodom m se sel selekt ektivn ivno o boje boje bazaln bazalne e membra membrane, ne, glikog glikogen en i različ različiti iti ćelijski sekreti glikoproteinske prirode.

Bestov karmin Ova metoda se koristi za selektivno bojenje glikogena u tkivu. Posebna pažnja se obraća fiksaciji (hladni alkoholni fiksativi), pošto se glikogen rastvara u vodi i samim tim se u toku rutinske fiksacije ispira iz tkiva. Alcian plavo Alcian plavo se upotrebljava za prikazivanje glikozaminglikana i proteoglikana, a često se primjenjuje u kombinaciji sa drugim bojama. U kombinaciji sa tehnikom van Gieson na vedene supstance se boje zeleno. Van Gieson Ova tehnika spada u grupu grupu metoda metoda kojima se boji vezivno vezivno tkivo.

35

Njome se kolagen boji crveno, a mišićno tkivo i eritrociti žuto. I ova metoda se često koristi u kombinaciji sa drugim metodama. Orcein i rezorcin-fuksin Ove metode se koriste za selektivno bojenje elastičnih vlakana, a najčešće se koriste u kombinaciji sa drugim metodama.

May-Grΰnwald –Giemsa Koristi se za bojenje razmaza krvi i koštane srži. Sastoji se iz kombinacije plavo), pa se jedra boje tamno baznih i kiselih bo ja (eozin, azur, metilen plavo), plavo do ljubičasto, citoplazma svijetlo plavo, a eritrociti ružičasto.

Srebro Postoji Posto ji veliki veliki broj broj metoda metoda u kojima kojima se upotre upotreblj bljava avaju ju različ različita ita   jed jedin inje jenj nja a sreb srebra ra.. Na Najče jčešć šće e se kori korist ste e za prik prikaz aziv ivan anje je neur neuron ona a i neuroglijskih ćelija, ali i za bojenje nervnih vlakana i drugih struktura. U zavisnosti od primijenjene metode, vidljivi talog je crne, braon ili zlatne boje boje.. Ra Rast stvo vorr sreb srebra ra se kori korist stii i u komb kombin inac acij ijii sa heks heksam amet etil ilen en tetraminom (metenamin-srebro) za prikazivanje bazalnih lamina, ali i za bojenje polutankih isječaka. Osmijum tetroksid Pored toga što se koristi kao fiksativ u elektronskoj mikroskopiji, osmi os miju jum m tetr tetrok oksi sid d se se,, zahv zahval alju juju jući ći os osob obin inii da boji boji lipi lipide de,, če čest sto o upotre upotreblja bljava va za bojenj bojenje e mijeli mijelinsk nskog og omotač omotača, a, ili lipidn lipidnih ih kaplji kapljica ca u svjetlosnoj mikroskopiji. Toluidin i metilen plavo Ove bazne boje se najčešće koriste za bojenje polutankih epoksi isječaka, ali i za prikazivanje metahromazije (mastociti) na klasičnim parafinskim isječcima. Mogu se koristiti i u kombinaciji sa azurom. Bojenje preparata napravljenih žiletom ili na mikrotomu bez inkluzije u parafin Svaki presjek, bez obzira da Ii je napravljen žiletom, sječen na mikr mikrot otom omu u od svje svježe žeg g ili ili fiks fiksir iran anag ag mate materi rija jala la,, ili ili je napr naprav avlj ljen en iz parafinskog kalupa, moguće je obojiti i napraviti privremeni ili trajni preparat. Pres Presje jeci ci napr naprav avlj ljen enii slob slobod odno nom m ruko rukom m uz pomo pomoćć žile žileta ta ili ili na mikr mikrot otom omu u od svjež svježeg eg ili ili fiks fiksir iran anog og mate materi rija jala la spro sprovo vode de se kroz kroz alko alkoho hole le i boje boje iIi iIi na pred predme metn tnom om stak stakal alcu cu (ako (ako je u pita pitanj nju u 1-2 1-2

36

preparata) ili u sahatnim staklima (ako ih je više). Kako proces rada zahtijeva da presjeci prolaze kroz serije alkohola i boju to se nameće pitanje kako ih prenositi iz suda u sud, a da se pri tome ne oštet e ili ne osuše. Ovaj dio posla vrši se na više načina, a ovde će biti opisana dva najjednostavnija. 1. Presjeci se finom četkicom prebacuju iz jednog u drugo sahatno staklo. Za ovaj način rada treba pripremiti onoliko sahatnih stakala ili drugih odgovarajućih sudova kroz koliko različitih agenasa materijal prolazi do konačnog uvođenja u kanada balzam ili neku drugu materiju. 2. U toku rada presjeci mogu ostati u jednom sudu (ne prebacuju se), a odlivanjem ili pipetiranjem izvlači se reagens u kome su stajali. Poslije ispiranja (čistom porcijom reagensa u kome su bili) dodaje se nova, svježa porcija odgovarajućeg reagensa.  Jedna od čestih kombinacija boja koja se pri ovom načinu rada upotrebljava je šafranin - vodeno plavo i zato će na jednom primjeru upravo sa ovim bojama biti opisan način rada. Presjeci napravljeni od fiksiranog materijala odmah se stavljaju u šafranin u kome najčešće ostaju 10-30 minuta, a ponekad i 24 sata. Kada se izvade iz šafranina presjeci se diferenciraju u 50% alkoholu i prenose u boju vodeno plavo. U toj boji ostaju do 10 minuta, a zatim se prenose u 95% alkohol. Ako su presjeci prebojeni diferenciranje vršiti u zakiseljenom alkoholu (u 100 ml 95% alkohola dodati kap-dve sone kiseline) i kada se postigne dgovar araj ajuć ućii ton ton boje boje pres presje jek, k, prij prije e dalj daljeg eg spro sprovo vođe đenj nja, a, više više puta puta odgov isprati čistim (nezakiseljenim) 95% alkoholom. Diferenciranje se vrši sve dok se alkohol boji, odnosno dok se ne ukloni višak boje i ne ispolje  jasne razlike u obojenosti tkiva. Sva odrvenjena tkiva šafranin će obojiti crve crveno no,, a ce celu lulo lozn znii i drug drugii neod neodrv rven enje jeni ni zido zidovi vi biće biće plav plavii od boje boje vodeno plavo. Dehidratacija presjeka vrši se u apsolutnom alkoholu koji se pri tome više puta mijenja. Dehidratacija mora da bude potpuna, inače će se presjeci pri prenošenju u ksilol, što je dalji korak u ovom poslu, zamutiti. U ksilolu presjeci ostaju 5 do 10 minuta. Iz ksilola se prenose na pred predme metn tnu u ploč ploču u u kana kanada da balz balzam am,, prek prekri riva vaju ju se pokr pokrov ovni nim m stakalcem i poslije sušenja od nekoliko dana trajni preparat je gotov.

5.4. REAGENSI ZA ZA PROSVJETLJAVANJE PROSVJETLJAVANJE I NAČIN NAČIN UPOTREBE UPOTREBE Pri proučavanju pojedinih struktura nekih biljnih organa često je potrebno primijeniti neku od metoda za prosvjetljavanje. Na ovaj način mogu moguće će je posm posmat atra rati ti,, ne prav praveć ećii pres presje jeke ke,, epid epider ermi mis, s, stom stome e u epid epider erm misu, isu, dla dlake, ke, a isto istovr vrem emen eno o i odr odredit editii duži dužinu nu ner nervatu vature re (izračunava se na jedinici površine lista), zatim broj stoma i slično. Najčešće upotrebljavani reagensi za prosvjetljavanje su sledeći: Hloralhidrat

37

Hloralhidrat ..........................5 ml ( može može i 8 ml) Voda ..........................2 ml

Ovaj Ovaj rea reagen genss se korist koristii za prosvj prosvjetl etljav javanj anje e debeli debelih h presje presjeka. ka. Reag Re agen enss hlor hloral alhi hidr drat at se može može upot upotri rije jebi biti ti hlad hladan an,, ali ali i zagr zagrij ijan an do ključanja. Kada se upotrebljava zagrijjan brže prosvjetljava, ali i izaziva bubrenje ćelijskih zidova. Kalijum hidroksid Kalijum-hidroksid (K0H).......................5 gr  Voda ili 96% etil alkohol.....................100 ml

Djeluje isto kao i hloralhidrat. Preporučuje se za prosvj etljavanje herbarizovanog materijala.

Žavelova voda Rastvor A: Hlorni kreč ....... 20 gr Voda .............. 100 ml Rastvor B: K2CO3 . . . . .. 15 gr  Voda............ 100 ml

Hlorni kreč se razmuti u vodi i ostavi da odstoji dok pripremamo drugi rastvor (rastvor B). Zatim se oba rastvora izmiješaju i ostave da stoje nekoliko sati. Poslije tog vremena dobijeni rastvor se profiltrira i upotrebljava kao reagens za prosvjetljavanje. Žavelova voda može da se napravi u većoj količini. Čuva se u dobro zatvorenoj tamnoj boci i na zamračenam mjestu. Materijal koji se prosvjetljava prvo stoji u 96% alkoholu sve dotle dok ne pobijeli, odnosno izgubi zelenu boju. Zatim se prenosi u Žavelovu vodu u koj oj se proc proces es izbj izbjelj eljiv ivan anja ja dovr dovrša šava va.. Žave Žavelo lova va voda voda je doba dobarr reag reagen enss za prosvjetljavanje i naročito je efikasna kada djeluje na svjetlosti. Pod njenim dejstvom se razaraju citoplazma i hloloplasti i zato je pogodna za prosvjetljavanje biljnih objekata u kojima želimo dobro da vidimo ćelijske zidove. Iz Žalelove vode materijal se brzo prenosi u tekuću vodu i u njoj se nekoliko minuta ispira. Ovako pripremljen materijal posmatra se u vodi ili glicerinu. Ako želimo da materijal sačuvamo duže vremena postepeno se dovodi do 70% alkohola i u njemu se konzervira. Glicerin Glicerin . . . . . . . . . 1 dio Voda .. ................. 1 dio 38

Upotrebljava se kao medijum u kome se posmatraju presjeci. Može da se upotrijebi i čist glicerin. Prosvjetljavan  je krupnijih objekata se vrši u vatrostalnom sudu. Stav Stavlj ljaj aju u se u stak stakle leni ni sud sud (epr (epruv uvet eta) a) j pažl pažlji jivo vo se kuva kuvaju ju u 50% 50% alkoholu sve dok se iz njih izdvajaju mjehurići vazduha. Zatim se u epruvetu stavlja 0,25 gr KCl03. Kada se ova so rastvori dodati još neko liko kapi sone kiseline (HCl). Sve se zajedno promućka i ostavi na dnevnoj svjetlosti. Čak se preporučuje da se izloži djelovanju direktne sunčeve svje svjetl tlos osti ti.. Vrij Vrijem eme e eksp ekspoz ozic icij ije e se kreć kreće, e, u zavi zavisn snos osti ti od prir prirod ode e materijala, od 1 minuta do 2 dana.

39

6. PARAFINSKA METODA PRAVLJENJA MIKROSKOPSKIH PREPARATA Već je ranij anije e napo napom menut enuto o da se na prep prepar arat atim ima a sječ sječen enim im slobodnom rukom ne mogu vršiti mnoge analize, posebno analize finijih struktura ćelijske građe. Pri citološkim, embriološkim pa i anatomskim proučavanjima često je istraživač prinuđen da presjeke pravi posebnim aparatom mikrotomom. Isto tako, pri analizama građe sitnih objekata, ili kada je potrebno, u cilju rješavanja postavljenog problema, dobiti seriju preparata u nizu jedan za drugim, takođe se primjenjuje sječenje mirkotonom. Objekti koji se sijeku mikrotonom moraju se prethodno, posebnim nači načino nom, m, prip pripre remi miti ti.. Po Post stup upak ak prip pripre rema manj nja a obje objeka kata ta za sječ sječen enje je mikrotonom je dosta složen i, generalno rečeno, sastoji se u tome da se u fiksirane i dehidrirane objekte uvede određena materija, u kojoj će poslije biti i zaliveni. U ovu svrhu najčešće se upotrebljava parafin, a rjeđe celoidin. Po parafinu u koji se inkluziraju objekti ova metoda je dobila ime parafinska metoda. Čvrsti objekti mogu se i direktno, bez inkluziranja u parafin, sjeći mikrotomom. O tom postupku biće riječi kasnije.

6.1. INKLUZIJA MATERIJALA U PARAFIN PARAFIN

Da bi materijal koji se preparuje mogao biti uveden u parafin potrebno ga je prethodno fiksirati, isprati i vrlo pažljivo, provodeći ga kroz seriju alkohola, dehidrirati. Za uvođenje u parafin dehidratacija materijala mora da ide i dalje od one koja koja je opisa opisana na u poglav poglavlju lju "Dehid "Dehidrata ratacij cija a i konzer konzervac vacija ija materi materijala jala". ". Naime, Naime, materijal treba da ostane u 96% alkoholu ne manje od 1 do 2 sata, a zatim se prebacuje u apsolutni alkohol. U apsolutnom alkoholu I materijal stoji ne manje od jednog sata, a zatim se prebacuje u novi apsolutni alkohol (AAI II apsolutni alkohol II). Sitni objekti i u AAI II ostaju 1 sat, a krupniji mogu i da prenoće. Da bi se omogu ćilo natapanje materijala parafi nom potrebno je agens kojim se vršila dehidratacija (AAI) zamijeniti agensom koji ne sadrži vodu, a u kome se parafin rastvara. Takvih tečnosti ima više: kedrovo ulje, terpentin, benzol, toluol, hloroform, ali se najčešće upotrebljava ksilol (Xy). Iz apsolutnog alkohola materijal se postepeno prevodi u neki od navedenih agenasa, a pri tom procesu istovremeno dolazi i do prosvj prosvjetl etljav javanj anja a materi materijal jala. a. Prosvj Prosvjetl etljav javanj anje e je značaj značajan an proce proces, s, jer pokazuje da je alkohol zamjenjen agensom u kome se parafin rastvara i da se može početi sa inkluzijom (uvođenjem) parafina. Za prosvjetljavanje i zamjenu alkohola koriste se manje količine agen agensa sa,, toli toliko ko koli koliko ko je potr potreb ebno no da se prek prekri rije je mate materi rija jall koji koji se sprovodi. Postupak koji se pri tome primjenjuje najčešće je sledeći: 40

1 dio ksilola i 3 dijela apsolutnog alkohola......................................... 1 sat 1 dio ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ............................................1 sat 3 dijela ksilola i 1 dio apsolutnog alkohola ........................................1 sat čist ksilol I ..........................................................................................1 sat odnosno do prosvjetljavanja meterijala, a može i da prenoći čist ksilol ll ........................................................................................1 sat

Vrijeme držanja materijala u svakom od ovih rastvora zavisi od prirode i veličine objekta, ali nije manje od navedenog vremena.   jalom, koji je doveden do čistog ksilola, ubaciti U sudove sa materi jalom, malo nastruganog parafina. Preporučljivo je da se usitnjen (isjeckan ili nastrugan) parafin stavi u vrećice od gaze, a one potope u ksilol tako da ne dodiruju materijal. Na taj način sprečavaju se mehaničke povrede materijala do kojih bi moglo da dođe od direktno ubačenih komadića parafina. Posude sa materijalom prvo se stavljaju u vodeno kupatilo, da se para parafi fin n brže brže rast rastvo vori ri,, a zati zatim m se otvo otvore re i pren prenos ose e u term termos osta tat. t.   Temperatura u termostatu treba da bude za 2 do 3°C viša od tačke topljenja parafina. Ako je parafin potpuno rastvoren u ksilolu, ili kada do tog toga dođe, ođe, u sudo udove sa mater aterij ijal alo om tre reb ba dolit olitii jos jos čist čisto og, otopljenog parafina. U ksilol-parafinu materijal stoji u termostatu 24 sata sa ta.. Po Posl slij ije e ovog ovog vrem vremen ena a ksil ksilol ol-p -par araf afin in se zamj zamjen enju juje je čist čistim im rastopljenim parafinom. U zato posebno izdvojenu i obilježenu posudu treba odliti ksilol-parafin, a umjesto njega u sudove sa materijalom naliti čist otopljen parafin čija se tačka topljenja kreće od 52 do 57° 57 °C. U ovom parafinu materijal ostaje u otvorenim sudovima 72 sata, a nakon tog vremena izlijevaju se kalupi. U zavisnosti od tvrdoće materijala upotre upotreblja bljava va se parafi parafin n različ različite ite tačke tačke toplji topljivos vosti. ti. U najveć najvećem em broju broju slučajeva za anatomske analize zadovoljavajuće rezultate daće rad sa parafinom čija se tačka topljenja kreće od 48 do 52° 52 °C. Tvrđi objekti se inkluziraju u čvršći parafin tj. u parafin čija je tačka topljenja 52 do 57° 57°C. S obzi obziro rom m da je pozn poznav avan anje je tačk tačke e topl toplje jenj nja a važa važan n poda podata tak, k, opisaćemo jednostavan način njenog određivanja. U stakleni kapilar naliti rastopljen parafin. Kada se parafin stegne kapilar pričvrstiti za termometar i zajedno ih staviti u sud sa hladnom vodom. Voda se post postep epen eno o zagr zagrij ijav ava, a, a isto istovr vrem emen eno o se posm posmat atra ra pri pri kojo kojojj će se temperaturi parafin u kapilarnoj cjevčici rastopiti. Očitana temperatura  je tačka topljenja parafina. Ako se parafin pri sječenju na mikrotomu kruni i lomi treba mu dodati 5 do 10 procenata voska. 6.2. KALUPLJENJE

41

Materi  jal koji je uveden u parafin i koji je predviđeno vrijeme stajao u termostatu kalupi se u porcelanskim posudama (posude za žarenje), petri kutijama, sahatnim staklima ili drugim odgovarajućim posudama. Pri kalupljenju je važno da se upotrebi posuda u kojoj će se parafin brzo stezati. Ako se uzima neka vrsta staklenih sudova, prije izlivanja parafina sa materijalom u njih treba ih dobro oprati sapunicom i toplom vodom, a zatim ih namazati glicerinom. Kalupljenje se vrši pored termostata, a prije nego što se pristupi ovom posl poslu u treb treba a prip pripre remi miti, ti, osim osim posu posuda da za izli izlijev jevan anje je para parafifins nski kih h kalup kalupa, a, još još špiritusnu lampu, dve anatomske igle, pincetu i posudu sa hladnom vodom. Pošto se posude sa materijalom u rastopljenom parafinu nalaze u termostatu, izlijevanj anje e kalupa kalupa treba treba ras raspor poredi editi ti na radnoj radnoj sve sve što što je potr potreb ebn no za izlijev površini ispred termostata, tako da se u najkraćem vremenlu može izliti dobar kalup. Određena brzina pri radu potrebna je zato što se parafin brzo steže na sobnoj temperaturi. Pri kalupljenju radi se sledećim redoslijedom: 1. Pripremiti Pripremiti posude posude za izlijeva izlijevanje nje parafins parafinskih kih kalupa kalupa.. 2. Upaliti Upaliti špirit špiritusn usnu u lampu. lampu. 3. Izvaditi posudu sa materijalom iz termostata. Iz nje brzo izvući pincetom etiketu i staviti je uz kraj posude u koju se izlijeva kalup. 4. Ugrijanom Ugrijanom iglom iglom pažljivo pažljivo promiješat promiješatii rastopljeni rastopljeni parafin, parafin, tako tako da se objekti objekti 5. podignu podignu sa dna, dna, ali da se pri tome tome ne stvore stvore mjehurići mjehurići vazduha vazduha u parafinu. 6. Naglo izliti izliti parafin parafin sa materijalom materijalom u posudu posudu za kaluplje kalupljenje. nje. Svi prepar preparovani ovani obje objekt ktii treba treba da se nala nalaze ze u posu posudi di za kalu kalupl plje jenj nje. e. Ako Ako je neki neki dio dio mate materi rija jala la osta ostao o u sudu sudu koji koji je bio bio u term termos osta tatu tu ugri ugrija jano nom m iglo iglom m ga prijeneti u posudu za kalupljenje u kojoj se parafin još nije stegao. Ugrija jani nim m igla iglama ma razm razmje jest stititii obje objekt kte e u para parafifinu nu tako tako da budu 7. Ugri ravnomjerno raspoređeni po cijeloj površini posude, da se nalaze na dovo dovolj ljno nom m rast rastoj ojan anju ju jeda jedan n od drug drugog og,, i orij orijen enti tisa sati ti ih u najpovoljniji položaj za sječenje. Orijentacija objekata je važan dio procesa kalupljenja, jer kada se kalup stegne i kada u njemu možemo samo nazirati objekte koje želimo da siječemo, moramo tačno znati u kom se položaju oni nalaze. 8. Pažljivo prenosimo posudu sa izlivenim parafinom na površinu hladne vode. Posuda sa vodom je ranije pripremljena. Kada je parafin dovoljno očvrsnuo potapamo posudu sa kalupom u vodu. Brzo rashlađivanje parafina potrebno je da bi se kasnije parafin mogao dobro da siječe. Ako se dopusti da se parafin rashlađuje polako, dolazi do njegove kristalizacije, a takav parafin izaziva određene teškoće pri sječenju.

Ako je sve dobro urađeno, kada se parafin potpuno ohladi i očvrsne, kalup bi trebalo da sam ispliva iz posude za kalupljenje, ili bar da se odvoji na lak dodir skalpelom. Ako ga moramo vaditi skalpelom, iglom 42

ili nekim drugim predmetom, onda kalup zahvatimo na nekoliko mjesta sa strane i polako ga odvojimo od suda. Naravno, pri tom poslu ne smije da dođe do pucanja kalupa. Ako se iz bilo kog razloga kalup pokvari, jednostavno ga treba opet vratiti u termostat i ponoviti cijeli postupak kada se parafin rastopi. Kada se kalupi izvade, posude za kalupljenje se operu toplom vodom i sapunicom, a ako na njima ima djelića parafina, prije pranja ih treb treba a odst odstra rani niti ti vato vatom m nato natopl plje jeno nom m u ksil ksilol olu u ill ill neko nekom m drug drugom om rastvaraču parafina. Posude se zatim dobro obrišu vatom natopljenom u apsolutnom alkoholu i isuše suvom krpom. U parafinskim kalupima, koji imaju oblik suda u kome su izliveni, vide se ukalupljeni objekti . U parafinu objekti mogu da ostanu neograničeno dugo vri jeme,  jeme, ili se pak odmah sijeku. 6.3. PRIPREMANJE PARAFINSKIH BLOKOVA

Već je rečeno da parafinski kalup ima oblik suda u kojem je tečan parafin izliven. Za dalju obradu potrebno je iz parafinskog kalupa isjeći parafinske blokove u kojima će se nalaziti materijal koji je kalupljen. Napravljeni blokovi se lijepe za drvene nosače koji se pričvršćuju u određeni dio mikrotoma i pristupa se sječenju preparata. Ukoliko se materijal odmah ne siječe parafinski blokovi se čuvaju u kesicama na kojima se ispišu svi podaci neophodni za identifikovanje materijala i dalju obradu (vrsta, organ, fiksativ, datum i drugo). Neki autori preporučuju da se parafinski blokovi nekoliko dana (5 do 6) prije sječenja potope iIi u vodu ili u agens koji sadrži 20 ml zasićenog rastvora pikrinske kiseline i 1 ml glacijalne sirćetne kiseline. Pošto se objekti u parafinskom kalupu vide (makar kao siluete prema svjetlosnom izvoru) treba oko njih isjeći parafin tako da oko objekta ostane 1-2 mm parafina i na taj način će se dobiti parafinski blokovi sa objektima u njima. Parafinski blokovi se sijeku tako da je u njima materijal najpovoljnije orijentisan za sječenje. Naspramne strane blokova moraju biti međusobno paralelne.

Blokovi sa parafinom se lijepe za drvene nosače koji se obično prave prave od hrasto hrastovin vine, e, bukovi bukovine, ne, brezov brezovine ine ili nekog nekog drugog drugog čvrsto čvrstog g drveta drveta.. Veliči Veličina na drveni drvenih h nosača nosača  je različita, ali bi se kao prikladna mogl mogla a prepo eporuči ručiti ti sled ledeć eća a 2 x 2 x 2,5 cm. cm. Na manju anju povr ovršinu inu pripremljenog nosača špatulom se nanosi rastopljen parafin i u njega se, dok je još rastopljen (ili dok se  još  nije stegao) potapa parafinski blok. Blok se lijepi u onom položaju pri kome  je materijal orijentisan za sječenje. Pošto se parafin brzo steže blok će biti zalijepljen čim se parafin ohladi. Da bi bili sigurni da je blok dobro pričvršćen na nosaču, treba ga još sa svih strana zaliti rastopljenim parafinom. Poslije ove radnje drveni držač zaje zajedn dno o sa para parafi fins nski kim m blok blokom om pota potapa pa se u vodu vodu da para parafi fin n brže brže očvr čvrsne. sne. Ovako vako pripr iprem emlj ljen en kalup alup spr sprem eman an je za sječ sječen enje je na mikrotomu. 43

6.4. PRIPREMANJE PREDMETNIH PREDMETNIH I POKROVNIH STAKALA STAKALA

Prije nego što pristupimo pravljenju presjeka potrebno je , bilo da se radi o priv privre reme meni nim m iIi iIi traj trajni nim m prep prepar arat atim ima, a, da se prip pripre reme me pred predme metn tna a i pokr pokrov ovna na stak stakal alca ca.. Pred Predme metn tna a i pokr pokrov ovna na stak stakal alca ca mora moraju ju biti biti besprekorno čista. Ako su stakalca nova dovoljno ih je oprati toplom vodom i obrisati lanenom ili nekom drugom krpom koja ne ostavlja tragove (dlačice). Pri Pri pran pranju ju,, bris brisan anju ju,, i uopš uopšte te pri pri uzim uziman anju ju pred predme metn tnih ih i  pokrovnih stakalca mora se voditi računa da se uvijek drže sa strane između palca i kažiprsta. Ako su predmetna i pokrovna stakalca bila ranije

upotrebljavana, ili ih pripremamo za trajne preparate, moramo ih oprati toplom vodom i sapunicom. Nakon toga ih ispiramo tekućom vodom i potapamo u sonu kiselinu (HCI). U sonoj kiselini ostaju 24 sata. Umjesto sone kiseline mogu se upotrijebiti i drugi rastvarači. Jedan od njih je sledeći:

destilovana voda . . . . . . . . . . . 80 cc Kalijum bihromat. . . . . . . . . . . . . .10 gr 2-3 dana tehnička sumporna kiselina . . . . .10 cc U ovom rastvaraču predmetna i pokrovna stakla ostaju 2 do 3 dana. Poslij Pos lije e stajan stajanja ja u ras rastva tvarač raču u treba treba ih isprat ispratii prvo prvo tekućo tekućom, m, a zatim i destilovanom vodom i potopiti u 96% alkohol. U alkoholu ostaju sve do upotrebe. Prije upotrebe predmetna i pokrovna stakalca pincetom se vade iz alkohola i suše, iIi dobro ispranom krpom koja ne ostavlja tragove, iIi na plamenu špiritusne lampe. Umjesto u alkoholu predmetna i pokrovna stakalca se mogu čuvati i u destilovanoj vodi, ali prednost dajemo alkoholu.

6.5. PRAVLJENJE PRESJEKA MIKROTOMOM

Precizan laboratorijski aparat koji služi za dobijanje finih presjeka zove se mikrotom. I ako postoje različiti tipovi mikrotoma najčešće se upotrebljavaju klizeći i rotacioni . Osnovna razlika izmedu ova dva tipa mikrotoma je u sledećem. Kod rotacionog mikrotoma nož je nepokretan, a po vertikali se kreće mikrotomski stočić. Kod klizećeg mikrotoma je obrnuto: pri sječenju preparata stočić je nepokretan, a nož se pokreće. Bilo Bilo o kom kom mikr mikrot otom omu u da je rije riječč stoč stočić ić mikr mikrot otom oma a je uvij uvijek ek pove poveza zan n sa mikr mikrom omet etar arsk skim im zavr zavrtn tnjem jem i pri pri svak svakom om pokr pokret etu u noža noža automatski se podiže za određenu željenu visinu. Na taj način dobijaju 44

se presjeci uvijek određene debljine. Debljina presjeka se inače može podešavati, a zavisi od materijala koji se siječe i cilja rada. Pripremljen drveni nosač sa parafinskim blokom u kome je materijal, pričvršćuje se između dve metalne ploče u stočić klizećeg mikrotoma. Mikr Mikrot otom omsk skii stoč stočić ić je inač inače e kons konstr trui uisa san n tako tako da pomo pomoću ću razl različi ičiti tih h zavrt zavrtanj anja a može može da mijenj mijenja a položa položajj čime čime se omoguć omogućava ava neopho neophodno dno dotjerivanje orijentacije objekta koji sa siječe. Kada se objekt orijentiše, a prije nego što se počne sa sječenjem, svi zavrtnji moraju biti stegnuti, a samim tim i stočit postaje potpuno nepokretan. Mikr Mikrot otom omsk skii nož nož ima ima svoj svoje e leži ležišt šte e na mikr mikrot otom omu u u koje koje se stav stavljlja i pričvršćuje pomoću dva zavrtnja. Sam nož je, prema tome nepokretno pričvršćen, a kod klizećih mikrotoma, koji su inače češće u upotrebi, nosač noža noža slobodno slobodno klizi klizi po žlijebu na tijelu mikrotom mikrotoma. a. Žlijeb mora, mora, kao u ostalom i svi drugi dijelovi mikrotoma, da bude čist i dobro podmazan kako bi se nosač noža po njemu lako i ravnomjerno kretao. Pri pravljenju presjeka od materijala koji je kalupljen u parafinu nož se postavlja tako da njegova oštrica bude paralelna ivici parafinskog bloka. Na mikrotomu nož može da se postavi i koso prema bloku koji se siječe, ali takav polažaj noža se preporučuje ako su objekti kalupljeni u celoidin, ili ako se siječe materijal koji uopšte nije kalupljen (čvršća tkiva koja možemo direktno pričvrstiti u stočić mikrotoma). Na ovaj način se, i bez pretho prethodno dnog g uvođen uvođenja ja u parafi parafin, n, od svježe svježeg g ili fiksir fiksirano anog g materi materijal jala a mogu dobiti presjeci na mikrotomu. Pri ovakvom pravljenju presjeka ne smije se izgubiti izgubiti iz vida da presjeci presjeci ne smiju da se osuše i zato, ako se radi sa svježim materijalom, i nož i površinu presjeka treba stalno kvasiti vodom, a ako se upotrebljava materijal iz fiksativa vlaži se 70% alkoholom. Dobijeni presjeci se prenose u vodu ili alkohol koji se nalaze u sa saha hatn tnom om stak staklu lu.. Debl Deblji jina na pres presje jeka ka koji koji se na ovaj ovaj nači način n dobi dobije je obično se kreće između 20 i 25 mikrona, a mogu da budu i deblji. Mikrotomski noževi su veoma važan dio mikrotoma. Od njihovog kvaliteta i oštrine zavisiće i kvalitet presjeka. Mikrotomski noževi se po obliku razlikuju. Ima noževa koji su sa jedne strane ravni a sa druge ugnuti, iIi mogu biti sa obe strane ugnuti. Ravno-ugnuti upotrebljavaju se za sječenje objekata inkluziranih u parafin, a dvostrano ugnut za sječ sječen enje je obje objeka kata ta koji koji se tešk teško o sije sijeku ku,, ili ili za one one koji koji se sijek sijeku u na mikrotomu sa uređajem za smrzavanje (poseban tip mikrotoma). S obzirom na značaj mikrotomskih noževa pri radu neophodno je da se oni oni pažl pažlji jivo vo čuva čuvaju ju i održ održav avaj ajiu iu.. Ovo Ovo se pose posebn bno o odno odnosi si na njihovo sječivo koje je vrlo osjetljivo na najmanji udar o neki čvršći predmet. Poslije upotrebe nož se očisti vatom namočenom u ksilol. Na taj način se otklanjaju i poslednji ostaci parafina koji su se, eventualno na njemu zadržali. Zatim se nož obriše suvom krpom i stavlja u kutiju za noževe. Ako se nož duže vremena neće upotrebijavati treba ga konzervirati tankim slojem ulja ili specijalne masti, čime je zaštićen od korozije. Sječivo noža se mora povremeno naoštriti. Oštrenje noža se vrši ili ručnim oštračem mikrotomskih noževa ili automatskim oštračem, a kontrola kvaliteta sječiva se vrši lupom ili na mikroskopu pri uvećanju od 100 puta. Nož je dobro naoštren i spreman za rad kada na njegovom 45

sječivu nema zubaca. Za dobi dobija janj nje e dobr dobrog og pres presje jeka ka potr potreb ebno no je, je, os osim im već već nave navede deni nih h post postup upak aka, a, još još i nož nož prav pravil ilno no namj namjes esti titi ti na mikr mikrot otom omu, u, odno odnosn sno o podesi podesiti ti odgova odgovaraj rajući ući ugao ugao noža noža prema prema površi površini ni parafi parafinsk nskog og bloka. bloka. Mnogi autori smatraju da je nož dobro postavljen kada je njegova donja faseta paralelna površini rezanja.

6.6. UPOTREBA MIKROTOMA

nego što se pristu pristupi pi pravlj pravljenj enju u presje presjeka ka mikrot mikrotom om treba treba Prije nego pažljivo očistiti od prašine i ostataka parafina. lsto tako, svi pokretni dijelovi na mikrotomu uvijek moraju biti podmazani. Kao mazivo se koristi specijalno ulje za mikrotome, ili ako njega nema dobro je i ulje za šivaće mašine. Na očišćen i podmazan mikrotom stavlja se nož, podešava se njeg njegov ov ugao ugao prem prema a obje objekt ktu u (fas (faset eta a para parale leln lna a povr površi šini ni obje objekt kta, a, a upravna na pravac kretanja noža). Za vrijeme rada i poslije završenog posla nož se čisti od ostataka parafina krpom namočenom u neki od rastvarača parafina (ksilol, benzin i dr.) i dobro isuši čistom suvom krpom. Kada Ka da je nož nož post postav avlj ljen en,, u stoč stočić ić mikr mikrot otom oma a se stav stavlj lja a drve drveni ni nosač parafinskog bloka i čvrsto zavrtnjem pritegne. Pri tome se vodi računa o pravilnoj orijentaciji materijala. Kada je sve na opisan način pripremljeno polako se nož privlači parafinskom bloku, a istovremeno kada se nož nalazi uz sam blok, pomoću zavrtnja se podešava visina bloka prema nožu. Pošto je blok uvijek tako sječen da se iznad objekta nalazi jos 1-2 mm parafina, laganim podizanjem stočića i istovremeno odsi odsije jeca canj njem em (mik (mikro roto toms mski kim m nože nožem) m) višk viška a para parafi fina na,, dola dolazi zimo mo do objekta. Ponovo fiksiramo stočić i na mikrometarskoj skali odredimo debl deblji jinu nu pres presje jeka ka.. Debl Deblji jina na pres presje jeka ka se odre određu đuje je jedn jednos osta tavn vnim im postup postupkom kom pomije pomijeran ranja ja klizeć klizećeg eg dijela dijela na mikro mikromet metars arskoj koj skali skali do želj željen enog og mjes mjesta ta.. Mikr Mikrom omet etar arsk ska a skal skala a je podi podije jelj ljen ena a na podi podiok oke e označene brojevima od 0 do 30. Postavljanjem klizećeg dijela na jedan od podioka, odnosno brojeva, i pritezanjem na tom mjestu, odredili smo i debl deblji jinu nu pres presje jeka ka koje koje će ćemo mo sjeć sjeći. i. Drug Drugim im rije riječi čima ma,, ako ako ozna oznaku ku postavimo i učvrstimo na br. 20 svakim pokretom noža, koji mora da dođe do mikrometarske skale i da je gurne do kraja, stočić se podigne zajedno sa objektom za 20 mikrona, a pri povlačenju noža prema sebi dobija se presjek upravo te debljine. Radnja se ponavlja i tako se dobija željeni broj presjeka određene debljine. Određivanje debljine presjeka zavisiće od samog objekta kao i od cilja istraživanja. Za anatomska ispitivanja ispitivanja biljnog biljnog materijala materijala zadovoljav zadovoljavajuće ajuće rezultate rezultate daju presjeci presjeci debljine 15 do 20 mikrona, a za animalni i humani materijal presjeci su znatno tanji, i do 5 mikrona. Ako su suprotne strane parafinskog bloka u kome je objekat koji siječemo paralelne, pri odgovarajućoj sobnoj temperaturi i nagibu noža, 46

na nožu ostaju presjeci u obliku trake. Presjeci se sa noža skidaju mekom i nakvašenom četkicom i stavljaju na posebno pripremljeno predmetno staklo. Pri stavljanju presjeka na predmetno staklo mora se voditi računa o orijentaciji parafinskih traka ili pojedinačnih presjeka, ako se oni kao takvi prave. To nije teško jer se gornja i donja strana parafinskih presjeka razlikuju. Donja strana je glatka i svijetla, a gornja   je je mat. mat. Pres Presje jeci ci se uvij uvijek ek donj donjom om,, glat glatko kom m stra strano nom m stav stavlja ljaju ju na predmetno staklo. Ako se postave suprotno, u daljem postupku će se odljepljivati.

6.7. TEŠKOĆE PRI SJEČENJU MIKROTOMOM Pri pravljenju presjeka često se javljaju mnoge teškoće od kojih ćemo nabrojati najčešće, ukazati na uzroke koji do njih dovode, kao i na način kako da ih otklanimo. Presjeci se lijepe za nož . Do ovoga obično dolazi ako je u radnoj prostoriji visoka temperatura koja prouzrokuje omekšavanje parafina ili   je je kalu kalupl plje jenj nje e izvr izvrše šeno no u neod neodgo gova vara raju juće ćem m para parafi finu nu,, odno odnosn sno o u para parafi finu nu nisk niske e tačk tačke e topl toplje jenj nja. a. Ova Ova tešk teškoć oća a u radu radu se otkl otklan anja ja snižav snižavanj anjem em sobne sobne temper temperatu ature, re, ras rashla hlađiv đivanj anjem em (pomoć (pomoću u kockic kockica a leda) parafinskog bloka i noža, a ako je u pitanju parafin, kalupe treba pretopiti, a objekte ponovo ukalupiti u parafin više tačke topljenja (tvrđi parafin). Presje Presjeci ci se krune krune. Do pojave krunjenja presjeka dolazi ili usljed niske niske sobne sobne temper temperatu ature re ili usljed usljed kalupl kalupljen jenja ja u neodgo neodgovar varaju ajueće ećem m (tvrdom) parafinu. Uzrok može da bude i lagano hlađenje pri izlijevanju kalupa. Pojav java a ovakvi ovakvih h Rascij Rascijepl epljen jena a traka, traka, uzduž uzdužne ne brazd brazde e na presje presjecim cima a. Po presjeka znači da nož više nije dobar, da se na njemu nalaze zubci, ili da je prljav. Ako je nož tup treba ga opet naoštriti, ili ga bar pomjeriti za širinu oštećenog (zupčastog) dijela, a ako je prljav treba ga očistiti. Do pojava brazda i raskidanja dovode i drugi uzroci, kao npr. nečist para parafi fin n ili ili prir prirod oda a sa samo mog g objek objekta ta.. Ako Ako je para parafi fin n neči nečist st treb treba a ga profiltrirati, a ako se kao uzrok ovoj pojavi ustanovi prisustvo kristala silicijumdioksida, treba izvrštiti desilifikaciju prije uvođenja u parafin. Iskrivljena traka. Strane bloka nisu paralelne, ivica bloka nije paralelna sa ivicom noža. Žiletom pravilno oblikovati blok. Pri sječenju mikrotom "preskače" i dobijaju se presjeci nejednake debljine. Nož je postavljen pod suviše kosim uglom. Podesiti ugao pod

kojim nož stoji u odnosu naparafinski blok. Neki šarafi u zglobovima mikrotomskog stočića ili držača noža nisu dovoljno zategnuti. Treba prekontrolisati sve zavrtnje i pritegnuti one koji su labavi. Mikrotom nije podmazan. Treba ga očistiti i podmazati. Presjeci zbijeni, naborani i slijepljeni . Uzroci mogu biti različiti: nož suviše tup, soba pretopla, parafin mekan, mali nagib noža, prljav nož. Pored 47

oštren oštrenja ja noža, noža, podeša podešavan vanja ja so sobne bne temper temperatu ature, re, hlađen hlađenja ja parafi parafina, na, podešavanja nagiba noža i njegove čistoće, pri pojavi ovakvih presjeka preporučljivo je prije sječenja potopiti blok sat, dva ili preko noći u vodu ili 10% glicerin u 60% alkoholu. Materijal al nije nije dovolj dovoljno no Ukalup Ukaluplje ljeni ni materi materijal jal se lomi lomi i ispada ispada iz bloka bloka. Materij dehi dehidr drov ovan an iIi nije nije potp potpun uno o pros prosvi vije jetltljen jen,, alko alkoho holl nije nije potp potpun uno o zami zamije jenj njen en reag reagen enso som m za pros prosvvetlj etljav ava anje, nje, mate materi rija jall je post posta ao krt u rea reagens gensu u za prosvjetljavanje, tkivo suviše tvrdo za k alupljenje u parafinu. Ako je uzrok navede navedenoj noj pojavi pojavi nedovo nedovoljn ljno o anhidr anhidrova ovan n i nepotp nepotpuno uno prosvi prosvijet jetljen ljen materijal, pomoći nema, mora se ponovo početi od fiksiranja. Ako se kao kao reag reagen enss za pros prosvj vjet etlj ljav avan anje je kori korist stii ksil ksilol ol i mate materi rija jall u njem njemu u postane previše krt, tako da se ne može sjeći, umjesto ksilola treba upotri upotrijeb jebiti iti toluol toluol ili mješav mješavinu inu toluol toluola a i kedro kedrovog vog ulja. ulja. Ako je tkivo tkivo suviše tvrdo za kalupljenje u parafinu, umjesto u parafin uvodi se u neku drugu odgovarajuću materiju. Presjeci se podižu . Veliki nagib noža; tup nož, soba pretopla ili parafin mekan. Presjeci talasasti . Materijal nije dobro zaliven u parafin. Pretopiti kalupe. Presjeci lete i lijepe se za dijelove mikrotoma zato što se pri sječenju stvara statički elektricitet . Ovo obično nastaje kada je vazduh

izuzetno suh. Vlažnost vazduha se u radnoj prostoriji može povećati postavljanjem suda sa vodom.

6.8. LIJEPLJENJE PRESJEKA NA PREDMETNO STAKLO STAKLO

jseka ka kor korist iste se apso apsolu luttno čist čista a Za lije lijepl plje jenj nje e para parafifins nski kih h pre pre  jse pred predme metn tna a stak stakal alca ca.. Da Ii su pred predme metn tna a stak stakal alca ca dobr dobro o opra oprana na provjerava se tako što se na čisto predmetno stakalce stavi nekoliko kapi vode. Ako se voda po njemu lako razlijeva staklo je dobro oprano, a ako se skuplja znači da na ploči ima masnoće. Sa nečiste ploče preparati se odljepljuju i zato ovoj fazi rada treba pristupiti ozbiljno. Ma koliko nam se stakalca činila čistim treba provesti kompletan praces pranja da ne bismo doživjeli neprijatno iznenađenje, tj. da se poslije fiks fiksir iran anja ja,, dehi dehidr drir iran anja ja,, kalu kalupl plje jenj nja a i sječ sječen enja ja,, prep prepar arat ati, i, zbog zbog nemarnosti, odlijepe i da se mora čitav proces započinjati od početka. Prema nekim autorima autorima presjeci presjeci se mogu lijepiti direktno na čista pred predme metn tna a stak stakal alca ca,, ali ali ako ako nism nismo o sigu sigurn rnii da će se bez bez upotre upotrebe be Majerovog ili nekog drugog ljepila preparati održati, poslije pranja i sušenja na predmetna stakalca treba nanijeti ljepilo. 6.8.1. Pripremanje i upotreba Majerovog Majerovog ljepila. ljepila. Iz svježeg jajeta razdvojiti bjelance od žumanceta. Bjelance sipati u menzuru i na njega dodati istu količinu glicerina. Bjelance i glicerin dobro izmješati, toj smjesi dodati kristalić fenola ili timola (konzervans)

48

i filtrirati. Pošto filtracija teče sporo (nekoliko dana) lijevak treba pokriti. U sud sa filtratom treba ubaciti kristalić fenola ili timola. Predmetna stakalca na koja se nanosi Majerovo ili neko drugo ljepilo moraju biti apsolutno čista, jer će se u protivnom preparati u dalj daljem em post postup upku ku odlj odljep eplj ljiv ivat ati. i. Na čist čisto o i suho suho pred predme metn tno o stak stakal alce ce kapaljkom se nanosi kap Majerovog ljepila. Nanijetu kap ravnomjerno i u tankom sloju rastrljati po površini stakla. Utrljavati sve dotle dok kažiprst ne počne da zapinje o površinu stakla. Predmetno stakalce se pri ovom postupku drži lijevom rukom sa strane između kažiprsta i palca. Na pripremljenu površinu predmetnog stakalca stavi se nekoliko kapi kapi desti destilov lovane ane vode vode i na njenu njenu površi površinu nu postav postavlja ljaju ju se parafi parafinsk nskii presjeci. Oni se sa mikrotomskog noža prenose vlažnom četkicom ili neki nekim m inst instru rume ment ntom om,, a pri pri tome tome se vodi vodi raču računa na da donj donja a stra strana na presjeka (glatka strana) leži na površini vode. Pri pravljenju serijskih preparata takođe se mora voditi računa o redoslijedu postavljanja. Broj presjeka koji se stavljaju na jedno pred metno staklo zavisiće od namjene pravljenja preparata, ali isto tako i od veličine pokrovnog stakal stakalca ca kojim kojim se presj presjeci eci kasnij kasnije e prekri prekrivaj vaju. u. Ako se upotre upotreblj bljava avaju ju pokrovna stakalca različitih dimenzija (20x20 mm, 22x22 mm, 32x32 mm) prepor preporuču učujem jemo o da se kontur konture e svake svake od navede navedenih nih dimenz dimenzija ija pločica nacrtaju na neku tvrdu, tamniju podlogu i tako dobije marker za raspoređivanje presjeka. Presjeci se raspoređuju samo unutar kontura markera. Kada se presjeci pravilno rasporede i orijentišu pristupa se razvlačenju ili ispravljanju parafinskih presjeka. Za lije lijepl plje jenje nje pres presje jeka ka kori korist ste e se i drug druge e mate materi rije je i drug drugač ačij ijii post postup upci ci,, međut eđutim im ovaj ovaj opisa pisani ni nač ačin in je najr ajras aspr pro ostr stranje anjen niji iji i najdostupniji, a daje dobre rezultate.

6.9. RAZVLAČENJE RAZVLAČENJE PARAFINSKIH PRESJEKA Poslij Posl ije e sječ sječen enja ja para parafi fins nski ki pres presje jeci ci se razv razvla lače če ili ili ispr isprav avlj ljaju aju.. Postupak ispravljanja parafinskih presjeka obavlja se na više načina. 1. Ka Kada da se pres presje jeci ci posl poslij ije e sječ sječen enja ja pren prenes esu u na pred predme metn tno o stakalce i rasporede mogu se razvlačiti ili na plamenu špiritusne lampe ili na specijalno specijalno konstruis konstruisanom anom stočiću stočiću (Slika (Slika 7). Pri Pri razvla razvlačen čenju ju na plam plamen enu u pred predme metn tno o stak stakal alce ce se brzi brzim m pokr pokret etim ima a pren prenos osii prek preko o plamena sve dok se presjeci ne isprave. Pri ovom postupku osoba koja pravi preparat mora biti izuzetno pažljiva da ne pregrije presjeke i da ne dozvoli da se parafin otopi. Znači, presjeci se ispravljaju ispod tačke topljenja parafina. Ako se razvlačenje parafinskih presjeka vrši na specijalnom termo stočiću onda se temperatura grejne ploče reguliše pomoću preklopnog dugmeta tako da uvijek bude nešto niža od temperature na kojoj se upotrebljen parafin topi. Opisani postupci primjenjuju se za ispravljanje kako serijskih tako i pojedinačnih presjeka. Pri razvlačenju mora se stalno voditi računa da 49

voda na predmetnom stakalcu u kojoj se nalaze presjeci ne ispari. Po potr potreb ebii pipe pipeto tom m se može može voda voda i nakn naknad adno no doda dodava vati ti.. Te Tek k kada kada su presjeci ispravljeni višak vode se odstranjuje filter papirom.

Slika 7. Stočić za razvlačenje parafinskih parafinskih presjeka presjeka 2. Mnogi praktičari primjenjuju postupak razvlačenja parafinskih presje presjeka ka na toplo toplojj vodi. vodi. Temper Temperatu atura ra vode vode mora mora da se održav održava a za neko nekoli liko ko step stepen enii niže niže od tačk tačke e topl topljen jenja ja para parafi fina na (tem (tempe pera ratu tura ra se stal stalno no kont kontro roli liše še term termom omet etro rom) m).. Pres Presje jeci ci se sa noža noža pren prenos ose e na površinu vode. I u ovom slučaju mora da se vodi računa o orijentaciji presjeka. Donja, glatka strana presjeka leži na vodi. Kada se isprave presjeci se prenose na predmetno stakalce tako što se ispod presjeka u vodu koso zamače predmetno stakalce i laganim pokretom izvlači. Pri tome tome pres presje jek k os osta taje je zali zalije jepl plje jen n na stak staklu lu.. Ovaj Ovaj nači način n ispr isprav avlj ljan anja ja pogo pogodn dnij ijii je za poje pojedi dina načn čne e pres presje jeke ke,, ali je za se seri rijs jske ke povo povoljn ljnij ije e razvlačenje na plamenu ili na termostočiću. Poslij Pos lije e razvla razvlačen čenja ja predm predmetn etna a staka stakalca lca prenos prenose e se na marker marker (tamna površina na kojoj su označene konture pokrovnih stakalaca) i vrši se raspoređivanje presjeka na već opisan način. Razv Ra zvuč učen enii i rasp raspor oređ eđen enii pres presje jeci ci treb treba a da se os osuš uše. e. Suše Sušenj nje e presjeka se obično vrši na sobnoj temperaturi i to na taj način što se predme predmetna tna staka stakalca lca sa presje presjecim cima a os ostav tavlja ljaju ju (zašti (zaštićen ćene e od prašin prašine) e) neko nekoli liko ko dana dana izlo izlože žena na djel djelov ovan anju ju so sobn bne e temp temper erat atur ure. e. Zati Zatim m se obilježavaju i stavljaju u kutije. Neki preparati zahtijevaju sušenje u termostatu, 1-2 dana, na temperaturi Prema a lite litera ratu turn rnim im poda podacim cima a na ovaj ovaj nači način n se od pribli približno žno 35-40 35-40°C. Prem isključuje mogućnost odljepljivanja presjeka pri daljem radu.

6.10. DEPARAFINISANJE

Bojenju preparata prethodi proces deparafinisanja - oslobađanja presjeka od parafina. Deparafinisanje se vrši u posebnim staklenim posudama – kivetama. Po obliku i veličini kivete mogu biti različite. Predme Predmetna tna stakal stakalca ca se stavljaj stavljaju, u, jedna po jedna jedna ili u parovim parovima, a, u odgovarajuće žljebove u kivetama. Ako se deparafinišu, a kasnije i boje u parovima, stakalca se stavljaju "Ieđa u leđa", tj. parafinski presjeci su okrenuti spolja. 50

 jine Depa Depara rafifini nisa sanj nje e se vrši vrši ksil ksilol olom om,, a traj traje, e, u zavi zavisn snos ostiti od debl debl jine presjeka, 5 do 15 minuta. Količina ksilola koja ispunjava jednu kivetu dovoljna je za deparafinisanje do sto predmetnih stakalaca na kojima se nalaze parafinski presjeci. Pri deparafinisanju svi presjeci moraju biti potpuno potopljeni u ksilol, kao uostalom i u sve rastvore kroz koje preparat prolazi. Iz ksilola predmetna stakla se pincetom prenose u sledeću kivetu u kojo kojojj se uvij uvijek ek nala nalazi zi apso apsolu lutn tnii etil etil alko alkoho holl i ksil ksilol ol u jedn jednak akim im dije dijelo lovi vim ma. U ksilo siloll-al alko koho holu lu pre rep par arat atii ostaj staju u 5 do 10 minut inuta. a. Prenošenje preparata iz jedne kivete u drugu obavlja se brzo kako bi se izbjeglo sušenje presjeka. Postoji još jedan način promjene reagenasa: odlivanje upotrebljenog, pri čemu se preparati pridržavaju pincetom, i brzo nalivanje sledećeg reagensa. Bilo da se primjenjuje jedan ili drugi način,cilj rada je da se vrši sprovođenje preparata kroz seriju alkohola sve sve niže niže konc koncen entr trac acij ije, e, ako ako je potr potreb ebno no sve sve do vode vode.. U svak svakom om alkoholu preparati ostaju po 5 minuta. Šematski taj proces se može predstaviti na sledeći način: Xy - Xy+AAI - AAI - 96%At - 90%AI - 80%A I - 70%AI - 50%AI - 30%AI -20%AI - voda.

Pošto se iz ove faze rada prelazi na bojenje, a boje se rastvaraju u alkoholu različite koncentracije (na primjer 50% ili 70% alkoholu) ili u vodi, to će upravo taj rastvarač i uticati u kom trenutku će preparat iz navedene serije alkohola biti prebačen u boju. Drugim riječima, ako se koristi vodeni rastvor boje onda preparate sprovodimo do vode (kroz cijelu seriju) pa ih tek tada bojimo. Ako se pak upotrebljava alkoholni rastvor boje, na primjer boja je rastvarena u 50% alkoholu, onda se preparati, pri sprovođenju kroz seriju alkohola, u boju uvode iz 50% alko alkoho hola la.. Ako Ako je boja boja rast rastvo vore rena na u apso apsolu lutn tnom om alko alkoho holu lu,, onda onda se preparati odmah iz njega prenose u boju itd.

7. TEHNIKA SMRZAVANJA TKIVA Da bi se spriječilo oštećenje određenih određenih ćelijskih komponenti koje može može nast nastat atii prim primje jeno nom m par parafin afinsk ske e tehni ehnike ke i da bism bismo o sa saču čuva vali li osje os jetl tlji jive ve mole moleku kule le u uzor uzorku ku,, tkiv tkivo o može možemo mo podv podvrg rgnu nuti ti brzo brzom m zamrzavanju, najčešće u tečnom azotu. Smrznuto tkivo tako postaje dovoljno tvrdo da se pomoću mikrotoma u hladnoj komori mogu dobiti tanki isječci (5 do 10 mikrometara), koji se zatim mogu direktno bojiti bez izlaga izlaganja nja organ organski skim m ras rastva tvarač račima ima ili alkoho alkoholu. lu. Ova metoda metoda se primjenjuje kod brojnih histohemijskih i imunohistohemijskih metoda za demonstraciju enzima ili osjetljivih molekula. Međutim, sa morfološke tačke gledišta tkivo je znatno slabije sačuvano. S obzirom da se isječak može posmatrati pod mikroskopom već poslije 5 do 10 minuta od dobijenog uzorka, ova tehnika se široko primjenjuje u toku operativnih zahv zahvat ata a (bio (biops psij ija a “e “ex x temp tempor ore” e”)) radi radi dobi dobija janj nja a brze brze dija dijagn gnoz oze e i 51

nastavka hirurške procedure. Danas se prave i specijalna rashladn a kupatila, koja se povežu sa mikrotomom i omogućavaju sječenje tkiva na niskim temperaturama, ali ne toliko toliko niskim niskim kao pri sječenju sječenju tkiva zamrznuto zamrznutog g u tečnom tečnom azotu. azotu. Rashladna kupatila obično omogućavaju snižavanje temperature tkiva na –20 do – 400C, čime tkivo tkivo postaj postaje e dovoljno dovoljno tvrdo tvrdo da bi se moglo sjeći mikrotomom. Ovaj proces je znatno brži od pravljenja parafinskih kalupa, ali su takođe ćelije morfološki slabije očuvane.

8. SPECIFIČNE METODE METODE PRIPREME PRIPREME CITOLOŠKIH CITOLOŠKIH PREPARATA PREPARATA Pored Pore d stan standa dard rdni nih h me meto toda da prav pravlj ljen enja ja priv privre reme meni nih h i traj trajni nih h prep prepar arat ata, a, če čest sto o se u labo labora rato tori riji ji prim primje jenj njuj uje e i jeda jedan n od sled sledeć ećih ih postupaka:

8.1. FRAKCIONISANJE FRAKCIONISANJE I CENTRIFUGIRANJE CENTRIFUGIRANJE ĆELIJE ĆELIJE U nekim slučajevima prilikom pravljenja preparata potrebno je izdvojiti pojedine ćelijske komponente. Jedan od načina na koji se to može može postić postićii jes jeste te centr centrifu ifugir giranj anje e pri pri veliko velikom m broju broju obrtaj obrtaja. a. Po Posto stoji ji veliki broj različitih modela centrifuga koji se međusobno razlikuju po broju obrtaja u minuti, a time i po veličini razvijene centrifugalne sile i vrsti pogona. Za najveći broj broj potreba dobro dobro može poslužiti poslužiti svaki model model električne centrifuge koji može postići brzinu od 3000 do 5000 obrtaja u minuti. Kod rada sa centrifugom ce ntrifugom mora se voditi računa o sledećem: •

•

•

Epruvete sa tečnošću koja se centrifugira ira moraju biti uravnotežene. Pokl Po klop opac ac ce cent ntri rifu fuge ge mora mora biti biti zatv zatvor oren en prij prije e poče početk tka a rada rada centrifuge, a otvara se tek kada “glava” centrifuge prestane da se okreće. Brzina obrtaja se mora postepeno povećavati, a isto tako, po isteku isteku određe određenog nog vremen vremena, a, postep postepeno eno smanji smanjivat vatii ukolik ukoliko o se centrifuga ne isključuje automatski. Nagla promjena brzine pored osta os talo log g dovo dovodi di do potr potres esan anja ja talo taloga ga,, a time time i do pono ponovn vnog og zamućenja. Tečnost iznad taloga se može odliti (dekatnirati) ili odvo odvoji jiti ti pipe pipeto tom, m, a os osta tata tak k tečn tečnos osti ti se ukla uklanj nja a izvr izvrta tanj njem em epruvete na filter papir ukoliko to dozvoljava vrsta taloga.

8.2. MACERACIJA

52

Mace Macerrac acij ija a predst edstav avlj lja a prir priro odno dno ili ili vje vještač štačko ko razla azlaga gan nje međućelijske supstance. Kao rezultat maceracije dolazi do razdvajanja ćelija. ćelija. Vještačka Vještačka maceracija maceracija se vrši u cilju dobijanja dobijanja pojedinačn pojedinačnih ih ćelija određenag tkiva. Na ovaj način moguća su detaljnija ispitivanja oblika i veličine ćelija kao i finija ispitivanja ćelijskog zida. Post Po stoj ojii više više nači načina na za macer macerir iran anje je tkiv tkiva, a, a koji koji od njih njih će ćemo mo primijeniti zavisi od samog tkiva koje se macerira. 1. Nježna tkiva tkiva se maceriraju kuvanjem u ključaloj vodi. 2. Maceracija nježinih tkiva vrši se i u različitim koncentracijama KOH (5-50%). Koncentracija KOH se određuje prema čvrstini mate materrijal ijala a koji koji se mac acer erir ira. a. Ukoli koliko ko je mater aterij ijal al tvr tvrđi, upotreblja upotrebljava va se jaca koncentra koncentracija. cija. Poslije Poslije maceracij maceracije, a prije posmatranja, materijal se ispira vodom. 3. Najp Najpog ogad adni nijiji meto metod d za mace macerir riran anje je tkiv tkiva a zelja zeljast stih ih bilj biljak aka a je meto metod d Manžea, a sastoji se u sledecem: Dijelovi biljke se stavljaju u zakiseljenu vodu ili zakiseljeni alkohol (na 3-5 dijelova 96% alkohola 1 dio sone kiseline HCI). U ovom rastvoru ostaju 24 sata. U daljoj fazi obrade materijal se prenosi u 10% rastvor amonijaka u kome ostaje 24 sata. Ukoliko želimo da proces ubrzamo, materijal treba kuhati u 10% amonijaku 1 sat. Kada se izvade iz amonijaka dijelovi biljke treba da se, na lak dodir pincetom, raspadn adnu na ćelije. Ukoliko je maceracija slaba treba povećati koncentraciju amonijaka do 30%, a ponekad se može upotrijebiti i nerazblaženi amonijak. Maceracija po metodu Manžea ima tu prednost što se u toku procesa ne razara sadržaj u ćelijama. 4. Drvo i veoma čvrsti dijelovi biljke, kao što je endokarp kad oraha (ljuska), vrlo dobro se maceriraju Šulceovom smješom. Prilikom ovog načina maceriranja obavezno je da se rad odvija u digestoru ili na otvorenom prostoru jer se izdvajaju pare azotne kise kiseli line ne koje koje su otro otrovn vne. e. Dije Dijelo lovi vi drve drveta ta se stav stave e na dno dno epruvete i preko njih se naspe bertoletova so (KCIO 3), tako da prekrije materijal koji se macerira. Preko soli se pažljivo sipa nekoliko kapi azotne kiseline (HNO 3). Pri lakom zagrijavanju, a nekad i bez zagrijavanja, dalazi do burne reakcije pri kojoj se u početku izdvajaju mrke pare azatnog oksida, a zatim bijela para hlora. Kada ključanje prestane i kada dijelovi drveta postanu bijeli, sadržaj epruvete se izlijeva u sud sa vodom i nekaliko puta se isp ispira. ira. Na Narravn avno, pri tome tome se pazi azi da sa vodo vodom m ne ode ode i macerirani materijal. Ovako pripremljeni materijal se čuva u alkoholu do upotrebe.

Maceririani materijal se može bojiti eozinom, šafraninom i Delafildovim hematoksilinom, a posmatra se u 2% sirćetnoj kiselini ili u glicerinu. Osim privremenih preparata moguće je napraviti i trajne, samo prethodno materijal treba da prođe kroz seriju alkohola da bi mu se oduzela voda (uobičajen mikrotehnički postupak).

53

8.3. GLICERIN - ŽELATINSKI PREPARAT Kad god postoji potreba da se brzo naprave trajni preparati od svježeg materijala, bez sprovođenja kroz alkohole, prave se glicerin-želatinski preparati. U glicerin-želatin obično se stavljaju neobojeni preparati, jer u njemu boje brzo izblijede, osim nekih koje su nešto postojanije (na primjer metilensko plavo). Pripremanje glicerin-želatina. U 6 ml destilovane vode, koja se sipa u vatrostalnu posudu, dodati 1 gram želatina. Želatin u destilovanoj vodi ostaje nekoliko sati i za to vrijeme on bubri. Poslije ovog vremena u posudu posudu se još dolijeva 7 ml hemijski hemijski čistog glicerina glicerina i ubacuje ubacuje kristalić antiseptika (timol, fenol). Zatim se posuda prenosi u vodeno kupatilo i zagrijava. Kroz izvijesno vrijeme sadržaj u vatrostalnoj posudi će se otopiti. Za vrijeme otapanja potrebno je više puta staklenim štapićem prom promij iješ ešat atii sa sadr drža žajj u posu posudi di.. Po Posl slij ije e otap otapan anja ja i homo homoge geni nizo zova vanj nja a glicerin - želatin obavezno treba profiltrirati kroz lijevak u kome se nalazi staklena vata. Na ovaj način se odstranjuju nepoželjne primjese kojih uvijek ima u želatinu. Filtriranje se vrši u termostatu, jer se na običnoj temperaturi glicerin-želatin steže. Ovako pripremljeno ljepilo se čuva u frižideru i veoma je postojano. Pri korišćenju glicerin-želatina potrebno je staklenu posudu, u kojoj se nalazi, postepeno zagrijavati u vodi sve dotle dok se on ne otopi. Staklen Staklenim im štapić štapićem em se kap glicer glicerinin-žel želati atina na preno prenosi si na predm predmetn etno o stak stakal alce ce i u nju nju se utap utapaj aju u napr naprav avlj ljen enii pres presje jeci ci.. Zati Zatim m se pres presje jeci ci prek prekri riva vaju ju pokr pokrov ovni nim m stak stakal alce cem m i kroz kroz izvi izvije jesn sno o vrij vrijem eme, e, kada kada se glicerin- želatin stegne, dobija se trajan preparat.

9. PRAKTIČNA UPOTREBA ELEKTROFOREZE Pod elek Pod elektr trof ofor orez ezom om se podr podraz azum umij ijev eva a kret kretan anje je če čest stic ica a sa električnim nabojem u električnom polju. Brzina kretanja ovih čestica je proporcionalna jačini električnog polja, a zavisi od električnog naboja, veličine i oblika oblika čestica. Postoje tri tri tipa elektroforeze: 1)

koja se vrši u naročitom staklenom sudu – ćeliji u obliku slova “U”, u koju se stavlja serum ili plaz plazma ma,, razb razbla laže ženi ni odre određe đeni nim m pufe pufers rski kim m rast rastvo voro rom, m, određenog pH i određene jonske jačine. Elektroforetska ćeli će lija ja je u kont kontak aktu tu sa sudo sudom m koji koji je ispu ispunj njen enis isti tim m puferskim rastvorom kao i ćelija, a u njega su zagnjurene elektrode koje su u vezi sa izvorom konstantne struje određenog napona i jačine. Slobodna elektroforeza

54

2) 3)

se vrši na čvrstoj podlozi kao što su filter-papir, acetatna celuloza, agar-gel i skrobni gel. koja služ služii za doka dokazi ziva vanj nje e mole moleku kula la Imunoelektroforeza koja bjelančevina na osnovu njihovih antigenih osobina.

Zonska elektroforeza

Danas se najčešće primjenjuje zonska elektroforeza.

9.1. ANALIZA IZOLOVANE DNK Analiza kvantiteta i kvaliteta izolovane genomske i plazmidne DNK se vrš i agaroznom gel elektroforezom bojenom etidijum bromidom. Agaroza je poli polisa saha hari rid d čiju čiju os osno novn vnu u jedi jedini nicu cu čini čini disa disaha hari rid d agro agrobi bioz oza. a. Na Nako kon n rastvaranja, kuvanja i laganog hlađenja, agaroza formira gustu mrežu sa porama koje variraju variraju od 100 do 300 nm, u zavisnos zavisnosti od koncentracije rastvora agaroze. U električnom polju, u blago alkalnom puferu, molekuli DNK će se kretati kroz ovaj matriks, od katode ka anodi (DNK molekul je inače negativno nabijen), pri čemu brzina kretanja DNK molekula zavisi od njihove veličine, od veličine pora u agaroznom matriksu, tj. od njegove gust gustin ine, e, zati zatim m od prim primij ijenj enjen ene e ele elekt ktri ričn čne e stru struje je (vol (volta taža ža)) i drug drugih ih parametara kao što su temperatura, puferski sistem (jonska jačina) i dr. Poređe Poređenje njem m brzin brzine e kretan kretanja ja moleku molekula la DNK koji koji ispitu ispitujem jemo o sa brzinom kretanja molekula DNK poznate veličine (tzv. DNK markeri), elektroforezom možemo procijeniti veličinu dobijenog DNK fragmenta. DNK molekuli se separišu na osnovu veličine tako što manji mogu da se kreću kroz pore gela brže od onih većih. Generalno, na gušćim gelovima bolje se razdvajaju fragmenti DNK  male molekulske težine, dok rjeđi gelovi služe za razdvajanje velikih fragmenta. Za pripremu agaroznog gela i elektroforetsku analizu koristi se neki od standardnih pufera za elektroforezu, npr. TAE (gla cijalna sirćetna kiselina),  TBE (borna kiselina), TPE (fosforna kiselina); sadrže Tris kao deterdžent te Na-EDTA za denaturaciju, a razlikuju se u koncentraciji, tj. u jačini. Agarozni gel se priprema na sledeći način: 1. U staklenu bocu ili erlenmajer ( zapremine 2-4 puta veće od zapremine gela koji želimo da napravimo) usuti željenu zapreminu pufera već razblaženog do finalne koncentracije (0,5X ili 1X). Dodati odgovaraj odgovarajuću uću količinu količinu prethodno prethodno izmjerenog izmjerenog agaroznog agaroznog 2. Dodati praha i mućkanjem omogućiti disperziju agaroze u puferu. 3. Izmjeriti Izmjeriti ukupnu ukupnu masu suda, suda, pufera pufera i agaroze agaroze i prekriti prekriti plastičnom plastičnom folijom da bi se smanjio gubitak tečnosti isparavanjem. Na foliji probušiti iglom nekoliko rupica. 4. Zagrij Zagrijati ati u mikro mikrotal talasn asnoj oj rerni (na najveć najvećoj oj snazi snazi za niskonisko-pro pro-55

1. 5. 6. 7. 8.

9.

centne gelove, odnosno na srednjoj snazi za gelove koncentracije >2%) ili u ključaloj vodi, dok se u rastvoru agaroze ne pojave mjehurići. Izvaditi erlenmajer i lagano ga promućkati. Pažn Pa žnja ja:: rast rastvo vorr agar agaroz oze e nako nakon n vađe vađenj nja a iz mikr mikrot otal alas asne ne rern rerne e može prilikom mućkanja dodatno proključati ili se zapjeniti pa treba biti oprezan. Ponovo Ponovo zagrijati zagrijati rastvor rastvor agaroze, agaroze, ovog ovog puta do ključanja, ključanja, i pustiti pustiti ga da ključa oko 1 mi- nut, odnosno dok se sva agaroza ne rastvori. Izmjer Izmjeriti iti sud sa agaroz agarozom om ponovo ponovo na vagi vagi i doliti doliti vruće vruće destil destilovovane vode dok se ne dobije prvobitno izmjerena masa (iz koraka 3 ovog protokola). Ohladiti Ohladiti rastvor rastvor do tempe temperature rature od 50-60°C. 50-60°C. Sastaviti kalup za nalivanje gela i postaviti češalj na odgova odgovaraj rajuće uće mes mesto, to, pazeći pazeći da zubići zubići češ češlja lja ne dodiru dodiruju ju dno kalupa. Rastvor agaroze sipati u kalup tako da se dobije gel debljine oko 3 mm i ostaviti na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta da se postepeno ohladi i očvrsne. Formiran gel se može čuva čuvati ti do 1 dan, an, najbo ajbolj lje e u friž frižid ider eru, u, umot umotan an u plas plasti tičn čnu u rastegljivu foliju. Gel, Gel, zajedn zajedno o sa plastičn plastičnim im nosačem, nosačem, staviti staviti u kadicu kadicu za ele elektr ktrooforezu i doliti pufer tako da prekrije gel 3-5 mm. (Koristiti isti pufer i u istoj koncentraciji kao za pripremu gela.) Izvaditi češalj i pre nalivanja uzoraka eventualno, ukoliko je potrebno, ukloniti pasterovom pipetom iz bunarića komadiće otkinutog gela.

Uzorci koje želimo da analiziramo prethodno se pomiješaju sa puferom za nalivanje uzoraka koji služe da povećaju gustinu uzorka čime se omogućuje da DNK iz uzorka padne na dno bunarića. Zatim se uzorak boji čime se olakšava njegovo nalivanje u gel i olakšava se praćenje elektroforeze jer se boje u električnom polju kreću određenom brzinom u smjeru prema anodi. Najč Na jčeš ešće će se kori korist ste e glic glicer erol olsk skii ili ili sa saha haro rozn znii pufe puferi ri.. Na gel gel se običn bično o nano nanosi si 100-5 00-500 00 nano nanog gra ram ma DNK što zavi zavisi si od veli veliči čin ne frag fragme mena nata ta DNK DNK u sm smje jesi si (da (da bi se mogl moglii vidj vidjet etii veći veći frag fragme ment ntii potrebno je staviti više DNK). Uobičajeno se koristi struja konstantnog intenziteta od 5 V/cm (ras (rasto toja janj nje e izme između đu elek elektr trod oda) a).. Prej Prejak aka a stru struja ja će dove dovest stii do brže bržeg g propadanja puferskog sistema što se ogleda u prekomjernom grijanju pufera, topljenju gela i difuziji traka u gelu. Do difuzije molekula DNK u gelu će doći i ako se primjenjuje struja previše niskog intenziteta. Za vizu vizuel eliz izac acij iju u mole moleku kula la DNK DNK u gelu gelu,, najč najčeš ešće će se kori korist stii etid etidij ijum um bromid, supstanca koja se «umeće» između lanaca DNK molekula i koja floure flouresci scira ra kada kada se osvije osvijetli tli UV svjetl svjetlom. om. Etidij Etidijum um bromi bromid d se može može staviti u gel prilikom pripreme, može se staviti u pufer za elektroforezu ili se može dodati nakon elektroforeze rastvoren u destilovanoj vodi (etidijum bromid je kancer kanceroge ogen n pa je neoph neophodn odno o nositi nositi gumen gumene e rukavi rukavice ce prilik prilikom om manipu manipulac lacije ije njime). Trajni zapis rezultata elektroforetske analize u agaroznom gelu može se 56

dobiti dobiti fotog fotograf rafisa isanje njem m gela gela izlože izloženog nog UV svjetl svjetlu u (fotog (fotograf rafisa isanje nje se obavlj obavlja a u mraku). Nakon bojenja moguće je vizuelno uočiti do 10 ng DNK veličine do 1 kb. Najjasnija traka DNK na gelu se vidi kod oko 100 ng DNK  fragmenta.

9.2. ANALIZA IZOLOVANE RNK

Analiza rRNK se vrši denaturišućom agaroznom elektroforezom bojeno bojenom m etidij etidijum um bromid bromidom. om. Za analiz analizu u izolov izolovani anih h RNK poželj poželjna na je denatu denaturiš rišuća uća agaro agarozna zna ele elektr ktrofo oforez reza a zato zato što većina većina RNK formir formira a sekundarnu strukturu na osnovu intramolekulskog sparivanja baza što može može sprij spriječi ečiti ti da se kroz kroz gel kreće kreće pravil pravilno no propo proporci rciona onalno lno dužini dužini fragmenta. Priprema gela: 1. zagrijati 1 g agaroze u 72 ml vode dok se ne rastvori i onda ohladiti na 60oC 2. dodati dodati 10 ml MOPS MOPS pufera pufera (0,4 M MOPS, MOPS, pH 7.0; 0,1 0,1 M Na aceta acetata; ta; 0,01 M EDTA u 18 ml 37% formaldehida (12,3 M) 3. izliti gel korist koristeći eći «češalj» «češalj» koji će formirat formiratii «bunariće»u «bunariće»u koje koje će se staviti RNK uzorci 4. gel koji se nalazi u kadici prelije se puferom u visini od nekoliko mm i onda ukloniti «češalj»

U sam RNK uzorak dodaje se određena količina formaldehida u svrhu denaturacije, tj. narušavanja sekundarne strukture RNK. Slijedi nastavak denaturacije na temperaturi od 65-70 oC u trajanju od 5-15 min. Uključ Uključiti iti elektr elektrofo oforez rezu u na 5-6 V/cm V/cm. RNK je takođe takođe negati negativno vno nael naelek ektr tris isan ana a i u neut neutra raln lnom om pH okru okruže ženj nju u (u ele elekt ktri ričn čnom om polj polju) u) kretaće se ka katodi. Za bojenje se koristi etidijum bromid koji se doda u formaldehid. Rezultati eletroforeze vidljivi su pod UV svjetlom. Kretanje RNK molekula u gelu zavisiće od molekulske veličine RNK (veće molekule kreću se sporije), konformacije RNK (sekundarna struktura), jačine struje, baznog sastava RNK, vrste pufera, boje, tipa aparata za elektroforezu itd. Migr Migrac acijija a frag fragme mena nata ta i DNK DNK i RNK RNK u agar agaroz ozno nom m gelu gelu obrn obrnut uto o je proporcionalna log 10 njihove molekulske težine.

57

9.3. ANALIZA IZOLOVANIH PROTEINA Elektroforetsko ispitivanje proteinskih frakcija krvnog s eruma danas ima široku primjenu. S obzirom da proteini krvnog seruma nisu homogeni već se razlikuju po veličini, obliku i električnom naboju, mogu se ovom metodo metodom m odvoj odvojiti iti jedni jedni od drugih drugih.. Naj Najčeš češće će se primje primjenju njuje je zonska zonska elektroforeza na filter-papiru. at za elektroforezu na papiru se sastoji od izvora konstantne Apar at struje (ispravljača) i vlažne komore. Vlažna komora je kada 50x50 cm od poci pocink nkov ovan anog og lima lima ili ili neke neke plas plasti tičn čne e mate materi rije je,, na čiji čijim m bočn bočnim im stranama se nalazi po jedan otvor za prolaz elektroda. Pokrivena je pokretnom staklenom pločom. U unutrašnjosti vlažne komore nalaze se četi če tiri ri suda suda za pufe pufer, r, dime dimenz nzij ija a 47x5 47x5 cm. cm. U spol spolja jašn šnje je sudo sudove ve su uronjene elektrode koje su povezane sa izvorom konstantne struje. Kao izvor struje se koristi koristi ispravljač ispravljač sa stabilizat stabilizatorom orom koji omogućuje omogućuje izbor željenog napona. Oba puferska suda su međusobno povezana, obično filter-papirom. Za elektroforezu na papiru se upotrebljava specijalni filter papir (Whatman No I, Munktell No 20, Schleicher i Schull No 2043).

oforezu su potrebni sledeći reagensi: Za papirnu elektr oforezu 1) Pufer ufer Ver Veronalnal-na nattriju rijum m pH pH 8,6 8,6 jon jonske jači jačine ne 0,1 ( pri prip prem ema a se od 29, 29,428 428 gram grama a ver veronalnal-na natr trij ijum uma, a, 19,4 19,42 28 g natr atrijum ijumac acet etat ata, a, 270 ml 0,1 0,1 mol/ mol/ll HCl, do 3000 000 ml redestilovane vode. 2) Boja brom-fenol plavo ili amido crno ( 1g boje, 40 ml glacijalne sirćetne kiseline, 20 g sublimata do 2 litre vode) 3) Ras astv tvo or 83,3 3,3 mmol mmol//l sir sirće ćettne kise kiseli lin ne za za isp ispiran iranje je tra traka 4) Rastvor 0,01 mol/l NaOH za eluiranje traka. POSTUPAK: U svaki sud za pufer usuti po 500 ml svjež e napravljenog pufera. Na isječenu traku filter papira dimenzija 27x4 cm staviti mikropipetom 0,05 ml seruma, a potom traku pokvasiti puferom izuzev mjesta gdje je stavljen serum. Serum se nanosi 5-6 cm od kraja trake i taj kraj se postavlja prema katodi. Pokvašena traka se pažljivo zategne između dva dva unut unutra rašn šnja ja suda suda,, tako tako da njen njenii kraj krajev evii leže leže u pufe puferu ru.. Po Posl slij ije e postavljanja traka elektrode se dovedu u kontakt sa izvorom struje odre određe đene ne volt voltaž aže. e. Po Pošt što o su trak trake e post postav avlj ljen ene, e, kada kada se pokr pokriv iva a staklenom pločom da bi se izbjeglo nepoželjno isparavanje. U cilju održavanja stalne vlažnosti komore, ispod traka se postavi petrijevka sa destil destilova ovanom nom vodom. vodom. Ovako Ovako postav postavlje ljene ne trake trake stoje stoje 19-20 19-20 sati, sati, nakon čega se skidaju i suše na sobnoj temperaturi. Osušene trake se boje tako što se u sud za bojenje sipa brom fenolplavo i ostave se desetak minuta da boja djeluje. Nakon toga trake se vade i suvišak sirćetnoj boje se uklanja odbojavanjem tri puta po 10 min u 83,3 mmo l/l sirćetnoj 58

kiselini. Tamo gd je na traci nema bjelančevina, pri odbojavanju traka se potpuno obezboji. Trake se zatim ponovo suše na sobnoj temperaturi. Kada se traka os uši, boja se pojača parom amonijaka pa se traka isiječe na pojedine frakcije. Svaka frakcija se posebno isjecka i stavi u bočicu u koju se nalije po 5 ml 0,01 mol/l NaOH i ostavi 30 minuta. Poslije toga se intenzitet boja čita na fotometru sa zelenim filtrom talasne dužine 540 nm. Iz dobi dobije jene ne ekst ekstin inkc kcij ije e se izra izraču čuna nava va rela relati tivn vna a vrij vrijed edno nost st pojedinih frakcija kao što je dato na primjeru: Ekstinkcija za albumine Ekstinkicija za α globuline Ekstinkicija za β1 globuline Ekstinkicija za β2 globuline Ekstinkicija za γ globuline Ukupno

159

66 48 40

92 405

Relativan odnos pojedinih frakcija se izračunava iz proporcije: Ukupna ekstinkcija : 100 = ekstinkcija frakcije : X 405 : 100 = 159 : X X = 39,2  Tako se u ovom primjeru za albumine dobije relatina vrijednost 39,2%. Ovako se izračuna i za sve ostale frakcije, a zbir relativnih vrijednosti mora iznositi 100%.

59

60