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MANUAL DE LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA
1. PREPARACIÓN DE ANTICOAGULANTES Fundamento Debido a que en hematología se requiere estudiar a la sangre con sus elementos formes, así como hacer recuentos en sus células y revisiones morfológicas, es indispensable obtener la sangre con un anticoagulante que sea capaz no sólo de mantener la sangre sin coagularse, sino que preserve, de la mejor manera posible, la morfología celular. Para esto, existen diversos anticoagulantes que actúan de diferentes modos: la heparina es un inactivador de la trombina y de la trombo-plastina; los citratos, oxalatos y EDTA remueven el calcio, ya sea precipitándola como sal (oxalatos) o fijándolo en forma no ionizada (citratos y EDTA). La desfibrinación es un método alterno para obtener sangre líquida mediante la remoción de la fibrina formada al coagularse la sangre. Sin embargo, de esta manera no se evita la coagulación y, por lo tanto, la sangre pierde diversos factores de coagulación, pudiendo sufrir alteraciones morfológicas y volumétricas. Por ello, su uso se restringe a algunos estudios especiales. No debemos olvidar que una cantidad insuficiente de anticoagulante puede provocar una coagulación parcial y que el exceso del mismo diluye la muestra, con los consecuentes errores de medición. Por otro lado, el anticoagulante inadecuado puede ocasionar distorsión de las células. Por lo anterior, resulta obvia la importancia que tiene la elección y dosificación correcta del anticoagulante.
Cuando requerimos estudiar los factores de la coagulación, es conveniente utilizar, adicionalmente, material siliconizado, con la finalidad de retrasar la activación del factor XII y la adherencia de las plaquetas a las paredes del tubo Objetivos
Al terminar la práctica, el alumno será capaz de: 1. Preparar correctamente correctamente los principales anticoagulantes de importancia en hematología. 2. Seleccionar el anticoagulante más adecuado para cada determinación. Equipo
Balanza analítica Material
Biológico Ninguno b) De laboratorio Oxalato de amonio (reactivo núm. 1) Oxalato de potasio (reactivo núm. 2) Citrato disódico (reactivo núm. 3) Dextrosa (reactivo núm. 4) Ácido etilen diamino tetraacético ( EDTA) (reactivo núm. 5) Heparina (reactivo núm. 6) Agua destilada Tubos de ensayo de 13 x 100 mm, con t apón Matraces aforados de 100 ml Tubos de centrífuga graduados de 5 mi Pipetas serológicas de 5 ml a)
Procedimiento Oxalatos
Se utiliza la mezcla de oxalatos de amonio y potasio en proporción de 3: 2, la que es conocida como mezcla de Wintrobe o de Heller y Paul. La sal de amonio tiende a aumentar el volumen eritrocitario en tanto que la de potasio lo disminuye. Con las proporciones mencionadas, se logra mantener el volumen sin alteraciones. Preparación: Oxalato de amonio Oxalato de potasio Agua destilada ........
1.2 g 0.8 g 100.0 ml
En tubos con tapón, se coloca 0.1 ml de anticoagulante por cada mi de sangre que se vaya a depositar, es decir, que si necesitamos 5 ml de sangre, deberemos colocar 0.5 mi de la mezcla de oxalatos. Con la finalidad de evitar la dilución, los tubos destapados se ponen en una incubadora hasta que se evapore el agua y quede únicamente el polvo seco. Ventajas 1. Bajo costo. 2. No modifica el volumen eritrocitario. 3. El plasma obtenido se puede utilizar para otros exámenes (como bioquímicos por ejemplo), exceptuando aquellos en los que el nitrógeno contenido en el oxalato de amonio pudiera ocasionar una interferencia, como en las determinaciones de urea. Desventajas 1. Puede producir hemolisis. 2. No pueden hacerse extendidos sanguíneos después de algunos minutos, ya que se producen alteraciones leucocitarias como: vacuolas en los neutrófilos, degeneración nuclear en los leucocitos, fagocitosis de cristales de oxalato. Citratos
Citrato de sodio Se utiliza el citrato disódico en solución a 3.8 %, que es isotónica. a)
Preparación: Citrato disódico ................................................ 3.8 g Agua destilada .............................................. 100 ml En tubos, de preferencia graduados, se colocan 0.5 ml de la solución de citrato de sodio, para aforar a 5 ml con la sangre. Su uso se ha restringido al estudio de la coagulación. Ventajas 1. Es excelente para realizar pruebas de coagulación. 2. Bajo costo. Desventajas 1. No es muy útil para estudios morfológicos pues altera la morfología eritrocitaria y leucocitaria. 2. Debido a que ocasiona dilución importante (1 a 10) no es útil para realizar otras determinaciones cuantitativas. 3. ACD (Ácido cítrico-dextrosa)
Tiene su principal aplicación en bancos de sangre pues preserva la sangre hasta por tres semanas y se puede transfundir sin toxicidad. En el laboratorio de hematología, se utiliza para preservar los antíge-nos de los eritrocitos cuando se requieren estudiar.
Preparación: Citrato disódico (monoácido) ........................ 2.0 g Dextrosa ............................................................ 3.0 g Agua destilada (libre de pirógenos) ............ 20 ml Se usa en proporción de 4 ml de sangre por uno de anticoagulante. La sangre así obtenida se conserva en refrigeración a 4o C. Ventajas 1. Conserva las células viables durante tres semanas. 2. No es tóxico, por lo que se puede transfundir. Desventajas 1. No es útil para la mayoría de los estudios hematológicos cuantitativos porque ocasiona gran dilución. EDTA
El ácido etilen diamino tetraacético se puede utilizar como sal disódica o tripotásica. Tiene una actividad anticoagulante muy intensa ya que impide que se ionice el calcio por quelación del mismo; además, conserva la morfología celular durante muchas horas, por lo que es el anticoagulante de mayor uso en hematología. La sal tripotásica es más soluble, razón por la que se usa preferentemente. En los contadores automáticos, que cuentan plaquetas, también funciona mejor ya que no deja pequeñas partículas que puedan ser contadas como plaquetas. Preparación: EDTA (disódico o
tripótasico) ......................... 2.0 g Agua destilada............................................. 100 ml Se disuelve el EDTA en el agua, de preferencia a 37° C, y posteriormente se filtra; se deposita en tubos a razón de 0.1 mi de anticoagulante para 5 ml de sangre. Se puede evaporar a sequedad con lo que se evita totalmente la dilución de la muestra. Ventajas 1. Es muy barato. 2. Fácil de preparar. 3. Tiene gran poder anticoagulante por lo que se requieren bajas concentraciones. 4. Conserva excelentemente la morfología celular, hasta 24 horas después de obtenida la muestra. 5. Evita la aglutinación plaquetaria. 6. Se considera el mejor anticoagulante para la hematología habitual. Desventajas Ninguna
Heparina
Es un anticoagulante natural de gran potencia; se considera el mejor para prevenir la hemolisis y las alteraciones morfológicas. Sin embargo, su uso se ha limitado debido a que su costo es significativamente mayor que los anticoagulantes artificiales. La heparina se puede obtener en sales de sodio, calcio o amonio. Preparación: Heparina ............................................ 1 000 Ul/ml Colocar en un tubo una gota de la solución de heparina y evaporar a sequedad. Esta cantidad es suficiente para anticoagular 7 mi de sangre. Un método alterno consiste en aspirar la heparina con la jeringa y regresarla nuevamente al recipiente; la cantidad que queda impregnada en las paredes de la aguja es suficiente para 10 mi de sangre. Ventajas 1. Tiene una gran actividad anticoagulante natural. 2. No ocasiona alteraciones morfológicas. 3. El plasma obtenido puede ser utilizado para otras pruebas bioquímicas. 4. Es ideal para gasometrías. Desventajas 1. Su costo es más elevado que el de los demás anticoagulantes. Comentarios Es importante mencionar que, aun con el mejor anticoagulante, se pueden tener errores que ocasionen defectos analíticos. Para minimizarlos, conviene tener en cuenta lo siguiente: 1. Al obtener una muestra de sangre, hay que depositarla de inmediato en el tubo con anticoagulante y mezclarla perfectamente por inversión del tubo o mediante un mezclador mecánico rotatorio, nunca por agitación, que podría hemolizarla. 2. Los extendidos sanguíneos deberán realizarse lo más pronto posible para evitar que la acción del anticoagulante provoque alteraciones morfológicas. 3. Si en un lapso de 24 horas no se realizaran las determinaciones analíticas, es conveniente refrigerar la muestra a 4-8° C. 4. Si se van a efectuar exámenes en plasma, es conveniente separarla por centrifugación lo más pronto posible. Actualmente, para la obtención de muestras, se utiliza un sistema de tubos al vacío que ya tienen el anticoagulante y que se identifican por el color del tapón:
TAPON
ANTICOAGULANTE
Lavanda
EDTA
Azul claro
Citrato de sodio
negro
oxalatos
Amarillo claro
ACD
Verde
heparina
rojo
Sin anticoagulante
