Precipitación, Separación y Punto Isoeléctrico de Las Proteínas

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Laboratorio de Bioquímica general

Benítez Zúñiga iguel !ngel "ección # $ico Inocencio %osé &rlando '()*

Pr+ctica, Preci-itación. Preci-itación. se-aración / -unto isoeléctrico de -roteínas Introducción



1nalizar el e5ecto que -roduce la modi>cac modi>cación ión de 5actores 5actores >sicoquím >sicoquímicos icos en la solubilidad de las -roteínas3 @eter @etermin minar ar el -unto -unto iso isoelé eléctr ctrico ico de la insulina. bas+ndose en sus -ro-iedades de solubilidad a di5erentes )alores de -73

La unió unión n de dos dos o m+ m+ss am amin ino+ o+ci cido doss 0112 0112 mediante enlaces amida origina los -é-tidos3  En los los -é-t -é-tid idos os / en las las -rot -roteí eína nas. s. es esto toss enlaces amida reciben el nombre de enlaces -e-tídicos / son el resultado de la reacción del gru-o carbo4ilo de un 11 con el gru-o $esultados, amin am ino o de otr otro. co con n elim elimin inac ació ión n de una una  =abla  =abla *, "e-aración "e-aración de -roteínas -roteínas con sales sales molé molécu cula la de agua agua33 La  =abla  =abla #, Preci-itación Preci-itación -or -or e5ecto del -7 -0"1L=INA6&=2 7/ 5ormación de los enlaces Biure Inter-retación sol)entes -e-tí e-tíd dico icos da lug lugar a t'  =ubo  =ubo No3 * #  la caden dena -ri -rinci-a i-al o "obrenadan  Positi)o debido a la Clara de esqueleto de la -roteína. te -resencia de -roteínas 9ue)o en la que la unidad  3 F  3 F  3 F  3 F >ltrada dil3 solubles re-et e-etit iti) i)a a b+si b+sica ca est+ est+ *, 0mL2 Preci-itado  @ebido a la -resencia de 5ormada -or el 6N76 0del 7Cl F3* N * 6 -roteínas -reci-itadas *3F 6 6 gru-o amino2. el C8 0con 0mL2 Diltrado  @ebido a la -resencia de su 9idrógeno / su Na&7 F3* N -roteínas 6 *3F 6 6 caden dena late laterral2 / el : 0mL2 Preci-itado  @ebido a la -resencia de $egulador de C;& del gru-o carbo4ilo3 carbo4ilo3 # -roteínas 1 -artir del esqueleto se acetatos F3*  Preci-itación 6 6 *3F 6  -7 '3G -ro/ -ro/ec ecta tan n las las ca cade dena nass 6 No 9a/ 0mL2 latera laterales les.. resres-ons onsabl ables es -reci-itación 1gua 6 6 6 *3F de sus -ro-iedades 6  6 quím químic icas as<< =al como como su &bser)acio  =abla  =abla , Preci-itación Preci-itación -or modi>cación modi>cación de  nes solu solubi bili lida dad. d. la cual cual es la constante dieléctrica una -ro-iedad que Etanol HJ  =ubo # 3F 3F  =ubo 3FNo3 3F * -erm -ermit ite e la -uri -uri>c >cac ació ión n &bser)acio  6 Clara  de Contro#3F l de -roteínas en 5unción 9ue)o >ltrada #3F nes dil3 *, 0mL2 de los agentes que Etanol 0mL2 *3F 6 modi>quen esta interacción 9idro5ílica entre 1gua 6 *3F las moléc molécula ulass -olar -olares es del disol) disol)ent ente e / los Preci-itaci gru-os ionizados de las -roteínas3 No se obser)a ón de la -reci-itación &bser)acion -roteínas &b?eti)o de -roteínas es -or el ti-o -or el ti-o de de disol)ente disol)ente

  Los metales 5a)orecen la  =abla ', Punto isoeléctrico de la insulina  =u 1c3 1cetato Insulin -7 &bser)acio -reci-itación bo 1cét de a nes 6 "e solubilizan n ico sodio 6K1usencia de metales no -reci-itan F3# F3# @iscusión 0m 0mL2 L2 étodo de salting outM. el ión sul5ato F3F di)alente -ermite alcanzar altas 5uerzas * F3# F3F# mL0 6 iónicas. -or lo que des-laza al agua de 2 9idratación alrededor de los gru-os F3F cargados de la -roteína. ocasionando # F3*O F*F mL0 6 agregados -roteínicos. donde este 2 -roceso se )e 5a)orecido con altas F3F concentraciones de sales3 "in embargo.  F3FO F3#F mL0  la concentración -ara -reci-itar 2 di5erentes -roteínas es )ariable3 F3F 1l realizar la -rueba de Biuret al ' F3F* F3#' mL 6 sobrenadante / al -reci-itado ambos 02 dieron -ositi)os dado el com-le?o color F3F -ur-ura que se 5ormó. -or la O F3FF F3#O mL 6 interacción con el ión cú-rico 0Cu#2 / 02 un tri-e-tido o -roteína<  Preci-itación -osteriormente al sobrenadante se le 6 No 9a/ -reci-itación adicionó sul5ato de amonio sólido se >ltró / al )ol)er a realizar la -rueba de Biuret Preci-itación -or metales -esados 6 al -reci-itado #. se es-eraría que la  =ubo No3 * #  ' O Clara de -rueba 5uese negati)a. dado que se 9ue)o -reci-ito la -roteína -or la -resencia de >ltrada *3F *3F *3F *3F *3F la sal / este se quedaría sus-endido en dil3 *, el -a-el >ltro. situación que no sucedió 0mL2 -osiblemente a una mala >ltración o Cloruro centri5ugación3 mercúrico # gt Preci-itación -or e5ecto del -7 / de O sol)entes se logró )er que en los tubos Nitrato de * /  que contenían 7Cl / regulador de # gt -lata # acetatos. res-ecti)amente las -roteínas 1cetato -reci-itaron. en el tubo # que contenía de -lomo # gt Na&7. la clara de 9ue)o se solubilizó O com-letamente dado que estas Cloruro -roteínas se encuentran le?os de su de sodio -unto isoeléctrico 0"e encuentra OQ relati)amente -rotonada2. -or lo que se # gt Cloruro -uede decir que, la clara de 9ue)o a un de bario -7 b+sico se encuentra en un -unto O donde su solubilidad es ma/or3 1gua # gt &bser)aci   6 6K

1l agregar el etanol se 5a)orece la -reci-itación de las -roteínas. dado que su constante dieléctrica es menor que la del agua -or lo que disminu/en las interacciones de sol)atación entre -roteína6agua3 La -reci-itación con metales 5ue -ositi)o -ara la sale de mercurio. -lata / -lomo -ues al 9aber iones -ositi)os / negati)os que interactúen ?unto con las moléculas de -roteínas. se 5orman com-le?os que aumentan su tamaño molecular / -or lo tanto su -reci-itación. sin embargo. las sales de bario / sodio no -reci-itaron a la -roteína estas las solubilizaron. -ues se -resentó el 5enómeno de salting inM /a que a9ora 9a/ una interacción entre la -roteína / los iones de la sal. la interacción con el agua es m+s 5uerte3

En la determinación del -unto isoeléctrico de la insulina. solo se obser)ó -reci-itación en el tubo . como /a sabemos el -unto isoeléctrico es el -7 en el cual la carga neta es F / adem+s a este -7 la -roteína tiene menor solubilidad -or lo que -reci-ita3

Conclusiones La solución de las -roteínas de-ende de la concentración de sales disueltas. el -7 / el disol)ente utilizado / tem-eratura3 Referencias bibliográcas

Le9ninger. 1lbert3. Nelson. @a)id L3. Co4. ic9ael 3.0*HH2 Princi-ios de BioquímicaM3 "egunda Edición. Ediciones &mega. Barcelona. Es-aña3