PRACTICA No. 4 CUANTIFICACIÓN DE ADN OBJETIVO GENERAL El alumno realizará la cuantificación de ADN obtenido anteriormente anteriormente por distintos métodos. métodos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS espectrofotométricos. Cuantificar DNA por métodos espectrofotométricos.
Cuantificar DNA por densitometría en gel.
Realizar el análisis comparativo de ambos métodos.
FUNDAMENTO TEÓRICO Espectrofotometía La concentración de DNA se puede estimar utilizando un espectrofotómetro espectrofotómetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases púricas y pirimidínicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. Es importante importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de hidrógeno), el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario. Una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, a 40 μg/ml de ARN y ADN de cadena simple, y a 33 μg de oligonucleótidos.
La determinación de la pureza de ADN se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260, 280 y 230 nm. En las preparaciones de ácidos nucléicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobreestimaciones sobreestimaciones de la concentración concentración de ácidos nucléicos. La concentración de proteína puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado esperado para ácidos nucléicos nucléicos puros. puros. Una muestra muestra pura debe presentar presentar un radio de absorba absorbancia ncia a 260/280 nm que exceda el valor de 1.75 para propósitos analíticos (para ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8). Si la muestra es impura deberán repetirse extracciones extracciones con fenol para remover dichas impurezas. impurezas. Teniendo el valor de absorbancia a 230 nm, podemos obtener la razón Abs230/Abs260, si ésta es mayor de 0.5, sugiere contaminación con fenol, cloroformo o carbohidratos. Otro parámetro a considerar es la absorbancia a 320 nm, que está relacionada con la difracción de la luz por material particulado en la muestra.
Otro método empleado para la estimación de la concentración de ADN, es por visualización en gel mediante corrida electroforética. electroforética. Para ello se colocan las muestras a analizar en pozos individuales, se corre la electroforesis a un voltaje constante, se visualiza el producto con U.V. en el transiluminador y se toma una fotografía. En este método la estimación se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algún programa computacional que contraste intensidades de color. Electroforesis Electroforesis en gel de agarosa El movimiento de moléculas cargadas a través de un soporte sólido bajo la influencia de un campo eléctric eléctrico, o, es conocido conocido como como electrof electroforesi oresis. s. Si el campo campo eléctric eléctricoo es aplicado aplicado a través través de electrodos electrodos a una solución de moléculas cargadas positivamente, éstas se dirigirán hacia el electrodo negativo y aquellas cargadas negativamente hacia el electrodo positivo. Las moléculas de ADN presentan una elevada carga
negativa, por lo tanto su movimiento será hacia el electrodo positivo. Su migración a través del gel es inversamente proporcional al log 10 del número de bases de pares. Las grandes moléculas migran con mayor lentitud debido al arrastre de una mayor fricción, y debido a que su paso a través de los poros del gel es menos eficiente que el de las moléculas pequeñas.
Los geles de agarosa son el medio más común para la electroforesis de ADN. La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D- y L- galactosa unidos por enlaces glucosílicos α (1-3) y β (1-4). Un amplio rango de tamaños (<10 bp a >20 kb) puede ser resuelto dependiendo de la concentración de agarosa (Tabla 1). Existe una relación lineal entre el logaritmo de la movilidad electroforética del DNA (μ) y la concentración del gel (Ґ) que se describe con la ecuación:
Log μ= log μ 0 –K r Ґ
μ0= movilidad electroforética libre del ADN, K r =coeficiente de retardación, una constante relacionada a las propiedades del gel, el tamaño y forma de las moléculas migratorias. La acrilamida puede también ser usada para la separación de pequeños ácidos nucléicos y oligonucleótidos (Tabla 1).
Tabla1. Porcentajes de agarosa y el posible rango de kb observado en gel.
Las moléculas de DNA del mismo tamaño se moverán a través del gel a la misma velocidad, observándose como una sola banda. Una muestra de ADN con diferentes tamaños producirá varias bandas en el gel.
El método más conveniente y comúnmente utilizado para la visualización de ADN y RNA en geles de agarosa es mediante tinción con bromuro de etidio, el cual contiene un grupo tricíclico planar que se intercala entre las bases de los ácidos nucléicos. Una radiación a 254 nm es absorbido por el ADN y transmitido a la tinción. La energía es re-emitida a 590 nm en la región rojo-naranja del espectro visible.
Agarosa
REACTIVOS
MATERIAL (por equipo) Cámara de electroforesis para ácidos nucléicos
Agua destilada
Molde para gel
TAE 1x
Fuente de poder
Buffer de carga para DNA (Glicerina 30%, Azul de bromofenol 0.05%)
Espectrofotómetro
TE 1x
Celdas de cuarzo
Bromuro de etidio 10mg/ml
1 Probeta de 100 ml estéril
Marcador de peso molecular de 1 Kb (Adicionar a un tubo eppendorf 15 µl de marcador 1kb + 15 µl de buffer de carga)
1 Matraz erlenmeyer de 250 ml estéril 1 espátula papel para pesar Papel parafilm Transiluminador Cámara fotográfica Puntas de 2-20µL, de 20-200µL y de 100-1000µl estériles Micropipetas de 2-20µL, de 20-200µL y de 1001000µl Hielera Hielo
METODOLOGÍA MUESTRAS 1. ADN total de bacterias 2. ADN total de plantas de chile
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS MEDIANTE DENSITOMETRÍA A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de las muestras. 1.- Pesar 0.5 gramos de agarosa para preparar 50 ml de un gel al 1% en buffer TAE 1X. 2.- Disolver en horno de microondas, verter la preparación de agarosa en un molde adecuado con peines y dejar gelificar. 3.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrir con buffer de corrida TAE 1X (aproximadamente 300-400 mL). 4.- Colocar 5 µl de cada muestra de ADN en parafilm de forma independiente, mezclar con 2 µl de buffer de carga para ADN. Colocar el volumen total (7 µl) dentro de los pozos del gel de agarosa con ayuda de una micropipeta. 5.- Adicione en uno de los pozos 4 µl de 1 Kb como marcador de peso molecular. 6.- Corra el gel a 100 V. 7.- Tiña el gel en la solución de bromuro de etidio (Solución de Tinción de los geles: 20 µl de bromuro de etidio 10 mg/ml + 200 ml de agua destilada. Colocar el gel en una charola conteniendo esta solución durante 5 minutos, cubra la charola con papel aluminio o tapa. Para desteñir coloque el gel en una charola con agua, durante 5 minutos). 8. Visualice en el transiluminador y obtenga la foto. 9.- Integre la fotografía digitalizada en un programa de cómputo para procesamiento y análisis de las imágenes previamente sugerido por sus profesores.
10.- Estime la concentración de ADN de las muestras mediante el programa de cómputo.
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE ESPECTROFOTOMETRÍA. 1.- Previo a la medición de los ácidos nucléicos, enjuagar las celdas de cuarzo con agua destilada, dejar secar. 2.- Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a una longitud de onda de 260 nm permitiendo el calentamiento de la lámpara de deuterium por 20 min. 3.- Colocar 1 ml de solución TE en la celda de cuarzo y utilizarlo como blanco, retirar la solución TE y secar la celda. 4.- Colocar 10 μl de la solución de ácidos nucléicos en la celda de cuarzo y adicionar 990 μl de solución TE, colocar la tapa de la celda y mezclar por inversión. 5.- Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm para evaluar la concentración de ácidos nucleicos. Si la absorbancia de la muestra excede el valor de 0.8, diluir la muestra. 6.- Considerar el ó los factores de dilución utilizados y calcular la concentración de ADN (Tabla 2) utilizando la siguiente fórmula: Concentración de ADN (μg/ml)= 50/(1/OD
)
260
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS MEDIANTE EL NANODROP 1.- Procesar la muestra de acuerdo a un protocolo establecido. 2.- Enchufar el cable USB del Nanodrop a la computadora y el cable correspondiente a la corriente eléctrica que indique el aparato (110V ó 220 V). 3.- Limpiar con agua destilada la celda del aparato, hacerlo pipeteando un pequeño volumen (20 l) sobre la celda y retirando varias veces, de tal manera que quede lo más limpio posible la celda. 4.- Colocar de 1-2 l de agua destilada en la celda, para que el aparato haga la lectura del blanco (260/280 nm). Cubrir nuevamente la celda. 5.- Mediante la computadora, realizar la lectura del blanco. 6.- Colocar de 1-2 l de la muestra. 7.- Mediante la computadora, realizar la lectura de la muestra. En caso de que la muestra se encuentre muy concentrada y el Nanodrop no la pueda leer, diluir la muestra en el orden de magnitud conveniente. 8.- Interpretar y reportar resultados.
RESULTADOS I) Describa la composición e integridad de las muestras observadas en el gel de agarosa después de la electroforesis. II) Determinación de la concentración de ácidos nucléicos mediante análisis densitométrico del gel. III). Complete la siguiente tabla con los parámetros de la cuantificación del DNA y las relaciones de absorbancia.
Muestra
Dilución
Abs.
Abs.
Abs.
260 nm
280 nm
230 nm
260/280
230/260
DNA (μg/ml)
DNA total de bacterias
DNA total de plantas
ANALISIS Y DISCUSION Analizar y discutir sus resultados en base a lo obtenido en la práctica y a la bibliografía consultada: De los dos métodos de cuantificación utilizados en la práctica (espectrofotométrico y densitométrico) determine cual considera más preciso y cual más exacto. Realice un análisis y comparación de las relaciones 260/280 y 230/260 de cada una de las muestras, haciendo referencia a su fundamento de cada relación y a la naturaleza de las muestras.
CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos, el análisis, la discusión, los objetivos y la bibliografía consultada dar las conclusiones de la práctica. CUESTIONARIO 1.- De que manera cuantificarías el ADN en caso de no contar con espectrofotómetro? 2.-Menciona otra tinción que podrías utilizar para la visualización de ADN en geles de agarosa
REFERENCIAS Nelson, D. y Cox, M. (2001). Principios de Bioquímica, (3 ªr Ed.). Barcelona, España: Editorial Omega. Stryer, L.; Berg, J. y Tymoczko, J. (2003). Bioquímica, (5 ªt Ed.) Barcelona, España: Editorial Reverté. Sambrook, J. y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 3 ªr Ed.). Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories.
PRACTICA No. 6 CUANTIFICACIÓN DE ARN OBJETIVO GENERAL El alumno realizará la cuantificación del ARN obtenido anteriormente por distintos métodos. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Cuantificar el RNA obtenido a partir de plantas por métodos espectrofotométricos.
Cuantificar el RNA obtenido a partir de plantas por densitometría en gel.
Realizar el análisis comparativo de ambos métodos.
FUNDAMENTO TEÓRICO Espectrofotometía La concentración de ácidos nucléicos se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las bases púricas y pirimidínicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. Una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, a 40 μg/ml de ARN y ADN de cadena simple, y a 33 μg de oligonucleótidos. De modo que para obtener la concentración de los ácidos nucléicos se utilizan las siguientes fórmulas:
Concentración de ADN (μg/ml)= 50/(1/OD 260) Concentración de ARN (μg/ml)= 40/(1/OD
)
260
La determinación de la pureza del ácido nucléico se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260, 280 y 230 nm. En las preparaciones de ácidos nucléicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobreestimaciones de la concentración de ácidos nucléicos. La concentración de proteína puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucléicos puros. Una muestra pura debe presentar un radio de absorbancia a 260/280 nm que exceda el valor de 1.75 para propósitos analíticos (para ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera A260/A280 ≥ 1.8 y para ARN, A260/A280 ≥ 2.0). Si la muestra es impura deberán repetirse extracciones con fenol para remover dichas impurezas.
Teniendo el valor de absorbancia a 230 nm, podemos obtener la razón Abs230/Abs260, si ésta es mayor de 0.5, sugiere contaminación con fenol, cloroformo o carbohidratos. Otro parámetro a considerar es la absorbancia a 320 nm, que está relacionada con la difracción de la luz por material particulado en la muestra.
Otro método empleado para la estimación de la concentración de ácidos nucléicos, es por visualización en gel mediante corrida electroforética. Para ello se colocan las muestras a analizar en pozos individuales, se corre la electroforesis a un voltaje constante, se visualiza el producto con U.V. en el transiluminador y se toma una fotografía. En este método la estimación se realiza contrastando intensidades de luz entre las muestras, lo cual se realiza visualmente o con el auxilio de algún programa computacional que contraste intensidades de color. Electroforesis en gel de agarosa El movimiento de moléculas cargadas a través de un soporte sólido bajo la influencia de un campo eléctrico, es conocido como electroforesis. Si el campo eléctrico es aplicado a través de electrodos a una solución de moléculas cargadas positivamente, éstas se dirigirán hacia el electrodo negativo y aquellas cargadas negativamente hacia el electrodo positivo. Las moléculas de ADN presentan una elevada carga negativa, por lo tanto su movimiento será hacia el electrodo positivo. Su migración a través del gel es inversamente proporcional al log 10 del número de bases de pares. Las grandes moléculas migran con mayor lentitud debido al arrastre de una mayor fricción, y debido a que su paso a través de los poros del gel es menos eficiente que el de las moléculas pequeñas.
Los geles de agarosa son el medio más común para la electroforesis de ADN. La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D- y L- galactosa unidos por enlaces glucosílicos α (1-3) y β (1-4). Un amplio rango de tamaños (<10 bp a >20 kb) puede ser resuelto dependiendo de la concentración de agarosa (Tabla 1). Existe una relación lineal entre el logaritmo de la movilidad electroforética del ADN (μ) y la concentración del gel (Ґ) que se describe con la ecuación:
Log μ= log μ 0 –K r Ґ
μ0= movilidad electroforética libre del ADN, K r =coeficiente de retardación, una constante relacionada a las propiedades del gel, el tamaño y forma de las moléculas migratorias. La acrilamida puede también ser usada para la separación de pequeños ácidos nucleicos y oligonucleótidos (Tabla 1).
Tabla1. Porcentajes de agarosa y el posible rango de kb observado en gel.
Las moléculas de ácidos nucleicos del mismo tamaño se moverán a través del gel a la misma velocidad, observándose como una sola banda. Una muestra con diferentes tamaños producirá varias bandas en el gel.
El método más conveniente y comúnmente utilizado para la visualización de ADN y ARN en geles de agarosa es mediante tinción con bromuro de etidio, el cual contiene un grupo tricíclico planar que se intercala entre las bases de los ácidos nucléicos. Una radiación a 254 nm es absorbido por los ácido nucléicos y transmitido a la tinción. La energía es re-emitida a 590 nm en la región rojo-naranja del espectro visible.
Agarosa
REACTIVOS
MATERIAL (por equipo) Cámara de electroforesis para ácidos nucleicos
TAE 1x
Molde para gel
Buffer de carga para RNA 2X (95 % Formamida, 0.025% SDS, 0.025% Azul de bromofenol, 0.025% Xilencianol, 0.5 mM EDTA)
Fuente de poder
Agua miliQ estéril
Celdas de cuarzo
TE 1x
1 Probeta de 100 ml estéril
Bromuro de etidio 10mg/ml
1 Matraz erlenmeyer de 250 ml estéril
Espectrofotómetro
Marcador de peso molecular de 1 Kb (Adicionar a 1 espátula un tubo eppendorf 15 µl de marcador 1kb + 15 µl papel para pesar de buffer de carga) Papel parafilm Transiluminador Cámara fotográfica Puntas de 2-20µL, de 20-200µL y de 100-1000µl estériles Micropipetas de 2-20µL, de 20-200µL y de 1001000µl Hielera Hielo
METODOLOGÍA Muestras 1. RNA total extraído en prácticas anteriores.
CUANTIFICACIÓN DE RNA POR DENSITOMETRÍA A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de las muestras. 1.- Pesar 0.5 gramos de agarosa para preparar 50 ml de un gel al 1% en buffer TAE 1X. 2.- Disolver en horno de microondas, verter la preparación de agarosa en un molde adecuado con peines y dejar gelificar. 3.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis y cubrir con buffer de corrida TAE 1X (aproximadamente 300-400 mL).
4.- Colocar 5 µl de cada muestra de ARN en parafilm de forma independiente, mezclar con 2 µl de buffer de carga para ARN. Colocar el volumen total (7 µl) dentro de los pozos del gel de agarosa con ayuda de una micropipeta. 5.- Adicione en uno de los pozos 4 µl de 1 Kb como marcador de peso molecular. 6.- Corra el gel a 100 V. 7.- Tiña el gel en la solución de bromuro de etidio (Solución de Tinción de los geles: 20 µl de bromuro de etidio 10 mg/ml + 200 ml de agua destilada. Colocar el gel en una charola conteniendo esta solución durante 5 minutos, cubra la charola con papel aluminio o tapa. Para desteñir coloque el gel en una charola con agua, durante 5 minutos). 8.- Visualice en el transiluminador y obtenga la foto. 9.- Integre la fotografía digitalizada en un programa de cómputo para procesamiento y análisis de las imágenes previamente sugerido por sus profesores. 10.- Estime la concentración de ARN de las muestras mediante el programa de cómputo.
CUANTIFICACIÓN DE RNA POR ESPECTROFOTOMETRÍA 1.- Previo a la medición del ARN, enjuagar las celdas de cuarzo con agua estéril, dejar secar. 2.- Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a una longitud de onda de 260 nm permitiendo el calentamiento de la lámpara de deuterium por 20 min. 3.- Colocar 1 ml de agua miliQ en la celda de cuarzo y utilizarlo como blanco, retirar la el agua y secar la celda. 4.- Colocar 10 μl de la solución de la muestra de ARN en la celda de cuarzo y adicionar 990 μl de agua miliQ, colocar la tapa de la celda y mezclar por inversión. 5.- Medir la absorbancia a 230, 260 y 280 nm para evaluar la concentración de ácidos nucleicos. Si la absorbancia de la muestra excede el valor de 0.8, diluir la muestra. 6.- Considerar el ó los factores de dilución utilizados y calcular la concentración de RNA (Tabla 2) utilizando la siguiente fórmula: Concentración de ARN (μg/ml)= 40/(1/OD
)
260
RESULTADOS I) Describa la composición e integridad de las muestras observadas en el gel de agarosa después de la electroforesis. II) Determinación de la concentración de ácidos nucleicos mediante análisis densitométrico del gel. III). Complete la siguiente tabla con los parámetros de la cuantificación del ARN y las relaciones de absorbancia.
Muestra
RNA de plantas
Dilución
Abs.
Abs.
Abs.
260 nm
280 nm
230 nm
260/280
230/260
ARN (μg/ml)
ANALISIS Y DISCUSION Analizar y discutir sus resultados en base a lo obtenido en la práctica y a la bibliografía consultada: De los dos métodos de cuantificación utilizados en la práctica (espectrofotométrico y densitométrico) determine cual considera más preciso y cual más exacto. Realice un análisis y comparación de las relaciones 260/280 y 230/260 de cada una de las muestras, haciendo referencia a su fundamento de cada relación y a la naturaleza de las muestras.
CONCLUSIONES Con los resultados obtenidos, el análisis, la discusión, los objetivos y la bibliografía consultada dar las conclusiones de la práctica. CUESTIONARIO 1.- Analice que factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de los ácidos nucleicos cuando se purifican. 2.- A partir del siguiente problema, responda los incisos a, b, c y d: Las siguientes imágenes muestran los productos de ARNm de tejido de flor de plantas de chile (carril 2, 3 y 4) por un método basado en perlas magnéticas (Dynabeads mRNA Purification Kit Dynal Biotech, Brown Deer, WI), a partir de RNAt (carril 8). El panel A corresponde a una corrida después de 2 minutos de iniciada la electroforesis a 100 V y el panel B a la misma corrida después de 30 minutos.
a) Analice la integridad de las muestras 2, 3 y 4. b) Teniendo en cuenta los controles de ARN utilizados en la electroforesis (carriles 5, 6 y 7), estime visualmente la cantidad de ARN en las muestras de ARNm de los carriles 2, 3 y 4. c) Calcule mediante un programa de cómputo de análisis y procesamiento de imágenes, la concentración de las mismas muestras. d) Compare los resultados obtenidos en los incisos a y b. Emita conclusiones. 3.- Por qué es necesario tomar dos imágenes en diferentes tiempos de corrida para la estimación visual de la concentración de ARNm en gel de agarosa. 4.- Realice un análisis comparativo entre el método espectrofotométrico y densitométrico para cuantificar ácidos nucléicos, teniendo en cuenta:
• • • • • •
fundamento precisión exactitud reproducibilidad cantidad de muestras a analizar costo de las determinaciones.
REFERENCIAS Nelson, D. y Cox, M. (2001). Principios de Bioquímica, (3 ªr Ed.). Barcelona, España: Editorial Omega. Stryer, L.; Berg, J. y Tymoczko, J. (2003). Bioquímica, (5 ªt Ed.). Barcelona, España: Editorial Reverté. Sambrook, J. y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual . (3 ªr Ed.). Nueva York. USA: Cold Spring Harbor Laboratories.
