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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE SANTIAGO PAPASQUIARO
EVALUACIÓN SENSORIAL
PRÁCTICA No. 3 "AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO, HIDRÓLISIS Y DETERMINACIÓN DE GLUCOSA"
UNIDAD TEMÁTICA I
PRÁCTICA No. 3 Aislamiento de glucógeno, hidrólisis y determinación de glucosa
Objetivos:
Utiliza las metodologías de bioquímica experimental para la extracción de glucógeno a partir de tejido animal y realizar su determinación cualitativa.
Determinar la función e importancia del glucógeno.
Marco teórico:
El glucógeno es un polímero a través del cual los animales almacenan glucosa. El glucógeno puede ser sintetizado o degradado en la mayoría de las células animales y solo dos tejidos lo contienen en grandes cantidades: músculo e hígado. En el hígado puede ocupar hasta un 10% de su peso y en músculo, un 1%. En situación de ayuno, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la glucemia, al menos durante dos horas.
El glucógeno consta de cadena de glucosa unidas por enlaces glucosídicos a (1-4) y ramificaciones, cada 8 o 10 unidades de glucosa, mediante enlaces glucosídicos a (1-6). Para extraer glucógeno del hígado se debe realizar una homogeneización del tejido y ruptura celular, seguido de una extracción y eliminación de las proteínas (desproteinizar) para evitar interferencias en los análisis posteriores. Para la obtención de glucosa (análisis cualitativo) hay que someter al precipitado de glucógeno a una hidrólisis ácida, de esta forma se rompen los enlaces glucosídicos y se libera glucosa.
Algunos azúcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe 3+ o Cu 2+. Esta característica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azúcares con un grupo carbonilo libre son llamados azúcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unión glicosídica se conocen como azúcares no reductores. Existen varias reacciones químicas que permiten determinar si se está en presencia de un azúcar reductor o no.
La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reacción o no de un azúcar con el ion Cu 2+, por lo que, la valoración cualitativa de la cantidad de glucosa presente en cada hidrolizado se realizará mediante esta prueba aprovechando el carácter reductor que tienen todos los monosacáridos. La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azúcar reductor.
Normas específicas de seguridad para la práctica
Cuadro de detección de riesgos.
Reactivo o sustancia
Tipo de peligro
Como evitarlo
Como proceder en caso de accidente
Reactivo de Benedict*
H319: Provoca irritación ocular grave.
H411: Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.
P280: Llevar guantes, prendas, gafas y máscara de protección.
P273: Impida que se libere al medio ambiente.
P305+P351+P338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando
Hidróxido de potasio
KOH al 30%**
Severo daño si es ingerido, irritación severa en la piel, en contacto con los ojos puede causar dolor, quemaduras posiblemente severas en función del tiempo de contacto
No comer, lavarse las manos después de su uso.
P280: Llevar guantes, prendas y gafas de protección.
No inducir al vómito. Beber abundante agua, lavar la boca con agua.
Lavarse al menos 15 min. con abundante agua y jabón en caso de contacto. Quitarse las ropas contaminadas.
Lavar los ojos durante 15 min. con abundante agua
Ácido Sulfúrico
H2SO4 5N**
Severo daño si es ingerido, quemaduras graves por contacto, lesiones oculares graves, quemaduras posiblemente severas en función del tiempo de contacto.
Corrosivo para los metales.
No inducir al vómito, beber abundante agua, lavar la boca con agua, no proceder a pruebas de neutralización.
Lavarse al menos 15 min. con abundante agua y jabón en caso de contacto. Quitarse las ropas contaminadas.
Lavar los ojos durante 15 min. con abundante agua
Fenolftaleína al 1% ***
Dañino si es ingerido, puede causar irritación leve por contacto; puede causar cáncer dependiendo del nivel y duración de la exposición.
No comer, lavarse las manos después de su uso.
P280: Llevar guantes, prendas y gafas de protección.
Inducir al vómito. Beber abundante agua.
Lavarse con abundante agua en caso de contacto. Quitarse las ropas contaminadas
Hidróxido de sodio
NaOH 5N
Severo daño si es ingerido, irritación severa en la piel, en contacto con los ojos puede causar dolor, quemaduras posiblemente severas en función del tiempo de contacto
No comer, lavarse las manos después de su uso.
P280: Llevar guantes, prendas y gafas de protección.
No inducir al vómito. Beber abundante agua, lavar la boca con agua.
Lavarse al menos 15 min. con abundante agua y jabón en caso de contacto. Quitarse las ropas contaminadas.
Lavar los ojos durante 15 min. con abundante agua
Nota: Esta práctica representa un bajo riesgo, no obstante es importante acatar el reglamento vigente colocado a la entrada del laboratorio. Estos datos son proporcionados como guía, para mayor información consulte la ficha de seguridad correspondiente. En casos graves buscar atención médica inmediatamente.
Consideraciones relativas a la eliminación:
* P501: Elimínense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida de eliminación residuos especiales o peligrosos, conforme a la reglamentación local, regional, nacional y/o internacional.
** Neutralización o dilución y desecho por la tarja.
*** No disponible.
Materiales y Sustancias.
Tubos de ensayo de plástico.
KOH al 30%
Fenolftaleína (en etanol)
Tubos de vidrio graduados
Na2SO4 15%
Reactivo Benedict
Pipetas
Alcohol etílico
Centrífuga de mesa
H2SO4 5N
Potenciómetro
NaOH 5N
Tubo de ensayo
Hielo
Vaso de precipitado 600 mL
Hígado
Procedimiento Experimental.
a) Extracción del glucógeno de una muestra hepática fresca (ratón, pollo o res).
1. Pesar aproximadamente 4 g de hígado. En el caso de hígados de animales en ayuno, se cuidará que el peso sea ligeramente superior a 4 g. Registrar el peso exacto de la muestra de hígado.
2. Introducir los fragmentos de hígado en dos tubos de ensayo (de 10 ml, de vidrio o de plástico translúcido).
3. Añadir a cada tubo 3 ml de KOH al 30%.
4. Incubar los tubos en un baño de agua hirviendo durante 20 minutos con agitación ocasional, hasta la completa digestión del tejido (que no queden partículas en suspensión). ¡¡ PRECAUCION: ALCALI HIRVIENDO!!
5. Enfriar y centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para eliminar los restos de tejido no digerido.
6. Pasar cuidadosamente los sobrenadantes (con una pipeta o por decantación) a dos tubos de vidrio graduado y previamente pesados, a los que se les añaden 0,2 ml de Na2SO4 al 15%, se agita fuertemente y dejar reposar 5 min
7. Se precipita el glucógeno que está en solución por adición de 7 mL de etanol al 95%. Se agita y deja en frío en un baño de hielo durante 5 minutos.
8. Dejar reposar en hielo durante un periodo de 5 a 10 minutos, para provocar la precipitación del glucógeno extraído.
9. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm para sedimentar el glucógeno.
10. Desechar con cuidado el sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrón-blanco, que es el que contiene el glucógeno.
Nota.- La purificación completa del glucógeno implicaría tres o cuatro precipitaciones alcohólicas y una precipitación ácida, pero en esta práctica haremos sólo una precipitación alcohólica.
11. Secar cuidadosamente con papel filtro y pesar el precipitado de glucógeno de cada tubo. Anotar el resultado.
b) Hidrólisis ácida del sedimento de glucógeno
1. Al sedimento de glucógeno obtenido en el tubo graduado, se le añade 1 ml de H2SO4 5N para proceder a su hidrólisis ácida y para ello se calienta la disolución cuidadosamente a 100°C durante 45 minutos. Como el ácido puede saltar en la ebullición, es conveniente poner en la parte superior del tubo papel filtro enrollado, para que absorba el ácido si éste salta y evitar riesgos. Tener en cuenta que en este tratamiento es donde se está obteniendo la glucosa que después se puede valorar, por lo cual no conviene perder muestra.
2. Ajustar a 2 ml con agua destilada y añadir de 2 a 3 gotas de fenolftaleína como indicador para la posterior neutralización.
3. Añadir gota a gota NaOH 5N y agitar bien hasta que se obtenga un pH 8 o superior. Se debe comprobar el pH de la muestra con papel indicador o potenciómetro.
4. Anotar el volumen de la disolución, hidrolizado de glucógeno, puesto que es la disolución problema donde se va a comprobar la presencia de glucosa proveniente del glucógeno extraído.
c) Medida cualitativa del contenido de glucosa
1. Se disponen de dos tubos de ensayo en los que se introduce 0,5 ml del hidrolizado de glucógeno de cada muestra, deposite 2.5 ml de reactivo de Benedict. Coloque los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos. Tenga cuidado de no quemarse.
2. Observe cualquier cambio de color durante calentamiento. Saque el tubo y póngalo en una gradilla y después de un corto tiempo observe si se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o verdoso. Observar y anotar lo que ocurre en cada tubo.
Resultados y discusión.
Registra tus resultados en una tabla. Realizar la discusión luego del análisis de los resultados en función de los objetivos particulares y del objetivo general de la práctica
Conclusiones.
Presentar las conclusiones a las que se llegaron.
Cuestionario (Explica ampliamente):
1. ¿Concuerdan sus resultados con lo esperado teóricamente sobre carbohidratos reductores?
2. ¿Qué otro reactivo se puede usar para análisis de azúcares reductores?
3. ¿Qué función biológica tiene el glucógeno hepático?
4. La enzima glucosa-6-fosfatasa se encuentra solo en el hígado, ¿Qué importancia tiene esta enzima?
5. ¿Quedo demostrada la presencia del glucógeno en el hígado y se interpretó adecuadamente su función biológica?
Anexos.
Incluir impresión o fotocopia de la rúbrica para la evaluación de la práctica y el diagrama de flujo, a quién no la integre no se le tomará en cuenta la práctica.
Bibliografía.
Harry R M., Richard A F., Roger L M. 1997. Biochemistry - A Short Course. John Wiley & Sons, Chapter 12.
Clark JM (1966): "Bioquímica Experimental", 1ª ed. Editorial Acribia (Zaragoza, España), pp 42-45.
Nelson DL, Cox MM (2001): "Principios de Bioquímica", 3ª ed. Editorial Omega (Barcelona, España), pp 304-305.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): "Bioquímica", 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona, España), pp 577-580.
Rúbrica
TEMA: Función biológica de los carbohidratos
EVIDENCIA DE APRENDIZAJE No. 3: Reporte de Práctica (10% de la calificación final del curso)
El propósito de esta herramienta es orientar a los estudiantes sobre la función biológica de los carbohidratos para la comprensión de la utilización y almacenamiento de energía a nivel celular.
Nombre del participante: ___________________________________________________________
Nombre de la persona que evalúa: ___________________________________________________
CRITERIO
NIVELES DE DESEMPEÑO Y PUNTOS A ASIGNAR
PUNTAJE OBTENIDO
COMENTARIOS
EXCELENTE
NOTABLE
BUENO
SUFICIENTE
DESEMPEÑO INSUFICIENTE
Entrega a tiempo: El documento fue entregado dentro del tiempo establecido.
El documento se entregó dentro del tiempo establecido.
10 puntos
El documento no se entregó dentro del tiempo establecido o no se entregó.
0 puntos
Estructura: Contiene los elementos, hoja de presentación, resultados, discusión, cuestionario, conclusiones, bibliografía.
Contiene todos los elementos
20 puntos
Contiene al menos 5 elementos
15 puntos
Contiene al menos 4 elementos.
10 puntos
Contiene al menos 3 elementos
5 puntos
Contiene menos de 3 elementos,
0 puntos
Limpieza y orden: Esta presentado sin borrones, enmendaduras, manchas y en hojas de igual tamaño y conforme la secuencia establecida
Tiene limpieza y orden
15 puntos
No tiene limpieza y orden
0 puntos
Cuestionario:
Responde las cuestiones de una manera amplia y correcta
Tiene los dos requisitos
15 puntos
Tiene más del 50% de los dos requisitos, pero no está completo o tiene errores
10 puntos
Tiene menos del 50% de los dos requisitos
5 puntos
No tiene los dos requisitos
0 puntos
Resultados y discusión de los resultados: presenta la información de acuerdo a lo solicitado, argumenta y compara sus resultados con los existentes en la bibliografía
Argumenta plenamente, y compara sus resultados con los existentes en la bibliografía
15 puntos
Argumenta claramente, y compara sus resultados con los existentes en la bibliografía
12 puntos
Argumenta débilmente , y compara sus resultados con los existentes en la bibliografía
8 puntos
Argumenta débilmente , y compara brevemente sus resultados con los existentes en la bibliografía
4 puntos
No contiene resultados o discusión de resultados
0 puntos
Conclusiones: incluye conclusiones en las cuales expone su punto de vista personal,
Incluye las opiniones, ideas y conclusiones personales
15 puntos
No contiene conclusiones.
0 puntos
Buena caligrafía:
Los reglones están alineados, se comprende lo escrito y elaborado con bolígrafo
Tiene buena caligrafía
10 puntos
Tiene una caligrafía aceptable
5 puntos
No tiene buena caligrafía
0 puntos
TOTAL
100 puntos
La rúbrica abarca 100 puntos de la actividad Reporte de práctica.
Para la calificación del curso se debe de multiplicar los puntos por 0.10
COMENTARIOS GENERALES
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