OBJETIVOS Objetivos General Objetivos Específicos • •
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Comprobar la desnaturalización y coagulación de las proteínas. Realizar ensayos de precipitación de proteínas al mezclarlas con sales de metales pesados, o con reactivos ácidos. Verificar la importancia de la reacción de Biuret para el reconocimiento de las proteínas.
TEORIA RELACIONAA Las proteínas son un grupo de biomolculas caracterizados por su gran variedad estructural y enorme diversidad de funciones biológicas. Las proteínas de cada ser vivo, animal o vegetal son especificas ya !ue estas codificadas por su genoma. " pesar de !ue desempe#an la misma función, las proteínas presentan diversas variaci variaciones ones estruct estructural urales es en las difere diferencia nciass especi especies. es. $uímic $uímicame amente nte pueden pueden diferenciarse en proteínas simples, constituidas %nicamente por aminoácidos y proteínas comple&as !ue contienen material adicional como carbo'idratos, lípidos o ácidos nucleicos. Las Las prot proteí eína nass pued pueden en vari variar ar sus sus cara caract cter erís ístitica cass de solu solubi bililida dad d medi median ante te alteraciones en el medio acuoso en el !ue 'allen disueltas. Cuando una proteína se disuelve en agua, las fuerzas 'idrofilicas, electrostáticas y los puentes de 'idrogeno, participan positivamente, aportando un mayor grado de solubilidad entre más efectivas sean estas interacciones. (in embargo factores físicos como el calor, radiaciones, variaciones en los valores de p) y la presencia de solventes !ue !ue afec afecta tan n esta estass inte interac racci cione ones, s, pueden pueden prod produci ucirr seri serias as alte alterac racio ione ness en la solubilidad. "lgunas veces pueden ocurrir cambios en la estructura nativa de #la prot prote eína y se cons onsidera era !ue en estas cond condiiciones la prot roteín eína se 'a desnaturalizado. *l fenómeno fenómeno físico observado en este este caso, es la información de un coagulo o proceso de coagulación.
!ROCEI"IENTO #$ eter%inaci&n 'el p(nto 'e coa)( a)(laci& ci&n 'e (na proteína * 'e%ostraci&n 'e la 'esnat(rali+aci&n, se rotulo + ensayos con la letra " y B, agregamos a cada uno - ml de solución de albumina de 'uevo. (e agregó -. ml de buffer p) -/ al tubo ". Colocamos los tubos en un ba#o de 0aría y aumentamos la temperatura en forma gradual anotando cual!uier cambio en los tubos y la temperatura a la !ue ocur ocurre re.. Cont Contin inua uamo moss cal calent entado ado 'ast 'asta a la ebul ebullilici ción ón del del gua gua y prolongamos el calentamiento por min más, separamos el tubo " y lo de&amos enfriar y agregamos ml de Buffer p) -/, llevamos al balo de agua caliente 'asta ebullición. 1eterminamos si el precipitado !ue se 'a formado, redisuelve despus de enfriar o diluir con agua.
-$ !reci !recipit pitaci aci&n &n 'e 'e prote proteína ínass a2 !recip !recipita itaci& ci&n n con sal sales es %et.li %et.licas cas,, en una serie de tubos se adiciono en cada uno 3 ml de solución "LB4056" de 'uevo, se adiciono a uno gotas de solución de cloruro mercurio al +7, al segundo gotas de la solución de acetato de plomo al +7, más 8 gotas de ácido actico y al tercero gotas de sulfato c%prico al +7, obs obsrve rvese se cuida cuidados dosam amen ente te la form formaci ación ón o no de preci precipi pita tado dos. s. *9pli!ue, repetir el procedimiento de caseína y luego por solución de gelatina. b2 !recip !recipita itaci& ci&n n con reacti reactivos vos aci aci'ico 'icos, s, en tres tubos de ensayo colo!ue en cada uno 3. ml de solución de caseína: a#ádale al primero 8 gotas de una solución acuosa saturada de ácido pícrico, al segundo igual cantidad de una solución de ácido tánico al 3-7 y al tercero tercero 8 gotas de una solución solución acuosa de ferrocianuro de potasio y 3 gota de ácido actico al 3-7. ;bserve lo !ue ocurre, repetir el procedimiento remplazando la solución de caseína por albumina.
"ATERIALES / REACTIVOS
3- tubos de ensayo 3 pinza para tubo de ensayo 3 estufa o calentados 3 Beaerrocianuro de potasio acuoso "cetato de plomo al +7 Cloruro de mercurio al +7
ANALISIS E RES0LTAOS A1 SALES "ETALICAS ?ara la precipitación con sales metálicas se implementaron 8 tubos de ensayos en los cuales se agregaron 3 ml de solución de albumina en cada uno de los tubos, identificándolos de la siguiente forma: @ubo 6A 3 ""2D @ubo @ubo 6A+ "B2D @ubo @ubo 6A8 "C2.
@4B; 6A3 ""2: una vez agregado 3 ml de solución solución de "lbumina se procedió a agregársele gotas de cloruro de merc mercur urio io )gC )gCl+ l+22 al +7D +7D lueg luego o de real realiz izad ada a la mezcla de estos compuestos se pudo observar una pe!ue#a concentración de precipitado en el fondo del tubo. " la vez, se notó un poco de precipitado disuelto disuelto en la totalidad del lí!uido, de igual forma se observó un cambio en la coloración del lí!uido a un todo un poco más blanco.
@4B; 6A+ "B2: se realizó una mezcla en un tubo de ensayo utilizando 3ml de solución de albumina, gotas de acetato de plomo C)8C;;2+?b2 C)8C;;2+?b2 y 8 gotas de ácido actico C)8C;;)2. 4na vez realizada dic'a mezcla se pudo observar un cambio de coloración en el compuesto compuesto formado y el tono se volvió un poco más blanco, además de esto, la reacción no arro&o ning%n tipo de precipitado y se mantuvo todo el tiempo en estado lí!uido.
@4B; 6A8 "C2: en el tubo de ensayo "C se adiciono 3 ml de solución de albumina mezclado con gotas de sulfato de cobre Cu(;2, en este tubo se pudo observar !ue la reacción entre estos dos compuestos origino un cambio en su coloración y esta paso de un tono transparente a un tono un poco más azul, tambin se observó !ue la reacción no arro&o ning%n tipo de precipitado y se mantuvo todo el tiempo en estado lí!uido.
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continuación se pueden observar en la imagen . *l resu result ltad ado o de est estas reac reacci cion ones es con los camb cambio ioss
presentados una vez finalizadas dic'as mezclas.
B1 !RECI!ITACI2N !RECI!ITACI2N CON REACTIVOS ACIICOS *n el punto B de las precipitaciones de proteínas se realizó a base de una solución de caseína a 3. ml, con el fin de identificar la precipitación obtenida por medio de reactivos acidicos, se utilizaron 8 tubos de ensayo con esta sustancia los cuales identificamos de la siguiente forma: @4B; 6A3 B"2D @4B; 6A+ BB2D @4B; 6A8 BC2.
@4B; 6A3 B"2: luego de 'aberse disuelto 3. ml de solución de caseína, se procedió a agregársele 8 gotas de ácido pícrico el cual reacciono de inmediato dándole una coloración diferente a dic'a mezcla, esta paso a un tono amarillo y además de esto se observaron una gran cantidad de precipitado el cual se mantuvo presente en todo el medio, la solución permaneció en menos cantidad de forma lí!uida, mientras !ue el resto se notó en forma de precipitado.
@4B; @4B; 6A+ 6A+ BB2 BB2:: ?ara ?ara este este punt punto o una una vez vez realizada la mezcla de 3. ml de solución de caseína y 8 gota gotass de ácid ácido o táni ánico al 3-7, -7, se pudo pudo obse observ rvar ar un resultado en el cambio de la coloración del medio, pasando a un tono oscuro, mientras !ue no se presentó ning%n tipo de precipitado, el medio se mantuvo todo el tiempo en forma lí!uida.
@4B; 6A8 BC2: en el tubo BC se disolvió 3. ml de solución de caseína, a la cual se le adicionaron 8 gotas de ferrocianuro de potasio, una vez realizada esta mezcla de sustancias se pudo observar un cambio de coloración en el medio, pasando a un tono un poco amarillo, casi transparente, no se presentó ning%n tipo de precipitado en el medio y la solución se mantuvo en su estado lí!uido.
" continuación podemos observar los cambios presentados pr esentados en cada uno de d e los tubos de ensayo en los cuales se realizaron dic'as mezclas.
C1 !RECI!ITACION !RECI!ITACION CON SALES "ETALICAS "ETALICAS 0TILI3ANO CASEINA *sta *sta vez vez se real realiz izó ó una una mezc mezcla la de sust sustan anci cias as util utiliz izan ando do case caseín ína a en una una conc concen entr trac ació ión n de 3 ml en tres tres tubos ubos de ensa ensayyos dife difere rent ntes es,, los cuale ualess identificamos de la siguiente forma
@4B; 6A3 C"2D @4B; 6A+ CB2D @4B; 6A8 CC2
@4B; 6A3 C"2: en el primer tubo de ensayo se le adiciono 3 ml de caseína, al cual le agregamos gotas de cloruro de mercurio al +7, durante la reacción se pudo observar un cambio en la coloración del compuesto pasando a un tono un poco más blanco, al mismo tiempo se pudo notar !ue arro&o un poco de precipitado en la totalidad del medio y 'ubo una pe!ue#a concentración de este en el fondo del tubo, se pudo observar !ue la sustancia permaneció en estado lí!uido.
@4B; @4B; 6A+ CB2: CB2: una vez agreg agregad ado o 3 ml de solu soluci ción ón de case caseín ína a y mezclado con gotas de acetato de plomo al +7, más 8 gotas de ácido actico, se pudo observar !ue no e9istió ning%n tipo de reacción y el medio continuo en su estado natural, la coloración de este permaneció en un tono transparente transparente,, no se presentó ning%n precipitado y el medio permaneció permaneció en estado lí!uido.
@4B; 6A8 CC2: CC2: para el tubo tubo CC despus de realizad realizada a la mezcla entre entre 3 ml de solución de casina y gotas de sulfato c%prico, el compuesto general de esta reacción reacción permaneció permaneció en estado estado lí!uido, lí!uido, su concentración concentración presento una serie de burbu&as en pe!ue#a cantidad y la coloración del medio perm perman anec eció ió en un tono tono tran transp spare arent nte, e, esto esto sign signifific ica a !ue !ue no e9is e9istitier eron on grandes cambios en esta reacción.
1 !RECI!ITACION CON SALES "ETALICAS 0TILI3ANO GELATINA *n el punto 1, se adiciono 3 ml de solución de gelatina en 8 tubos de ensayos diferentes, los cuales se pusieron a reaccionar con diferentes compuestos y se observaron y analizaron los cambios presentados en estos, 'emos identificado los tubos de la siguiente forma: @4B; 6A3 E"2D @4B; 6A+ EB2D @4B; 6A8 EC2
@4B; 6A3 E"2: para el tubo E" se adiciono 3 ml de gelatina el cual se puso a reaccionar con gotas de cloruro de mercurio al +7, en esta mezcla no se pres presen enta taro ron n gran grande dess camb cambio ios, s, ya !ue !ue el medi medio o perm perman anec eció ió en su esta estado do natu natura ral,l, con con tono tono de coloración coloración transparente transparente y no se presentó presentó precipitado precipitado en el medio.
@4B; 6A+ EB2
@4B; 6A8 EC2
E1 !RECI!ITACI2N !RECI!ITACI2N CON REACTIVOS ACIICOS EN "EIO E CASEINA (e implementaron 8 tubos de ensayos en en los cuales se agregaron 3. ml de solución de caseína y se identificaron identificaron de la siguiente forma: @4B; 6A3 C3"2D @4B; 6A+ C3B2D @4B; 6A8 C3C2
@4B; 6A3 C3"2: en el tubo de ensayo C3" se adiciono 3. ml de solución de gelatina, al cual se le agregaron 8 gotas de ácido pícrico y se pudo observar un cambio de coloración en el medio presentándose un tono amar amarilillo lo,, no arro& arro&o o ning ning%n %n tipo tipo de preci precipi pita tado do y la solu soluci ción ón del del medi medio o permaneció en estado lí!uido.
@4B; 6A+ C3B2: para el C3" se mezcló 3. ml de solución de gelatina con 8 gotas de ácido tánico al 3-7, el medio permaneció en su estado natural li! li!ui uido do2, 2, adem además ás se obse observ rvó ó !ue !ue no 'ubo 'ubo camb cambio io de colo colora raci ción ón y
perm perman anec eció ió en un tono tono trans transpa pare rent nte, e, no se pres present entó ó ning% ning%n n tipo tipo de precipitado.
@4B; 6A8 C3C2: luego de reaccionar 3. ml de solución de gelatina con 8 gotas de ferrocianuro de potasio, se pudo observar un cambio de coloración en el medio, este se presentó en un tono un poco amarillo y no arro&o ning%n tipo de precipitado en la solución final, además de esto el medio permaneció en estado lí!uido.
41 !RECI!ITACI2N !RECI!ITACI2N CON REACTIVOS ACIICOS EN "EIO GELATINA (e implementaron 8 tubos de ensayos en en los cuales se agregaron 3. ml de solución de gelatina gelatina y se identificaron identificaron de la siguiente forma: @4B; 6A3 E3"2D @4B; 6A+ E3B2D @4B; 6A8 E3C2
@4B; 6A3 E3"2: Luego de agregada 3. ml de solución de gelatina se le adiciono 8 gotas de ácido pícrico y se pudo observar un cambio de colo colora raci ción ón en el medi medio, o, pres presen entá tánd ndos ose e con con un tono tono amar amarilillo lo,, no se presentaron precipitados en esta solución y el medio se conservó en un estado un poco gelatinoso.
@4B; 6A+ E3B2: en el tubo E3B se mezcló 3. ml de solución de gelatina con 8 gotas de ácido tánico y se pudo observar !ue el medio permaneció
en un tono transparente, transparente, su consistenci consistencia a permaneció permaneció un poco gelatinosa gelatinosa y no se presentó ning%n tipo de precipitado.
@4B; 6A8 E3C2: para el tubo 6A 8 luego de realizada realizada la mezcla entre 3. ml de solución de gelatina y 8 gotas de ferrocianuro ferrocianuro de potasio potasio se observó observó un cambio de coloración en el medio, pasando a un tono un poco amarillo, no en igual tonalidad !ue en el E3" pero si un poco más fuerte !ue el E3B, de igual forma !ue en los tubos anteriores el medio permaneció en un estado gelatinoso y tampoco se presentaron ning%n precipitado en l.
!REG0NTAS CO"!LE"ENTARIAS #$ Cons(l Cons(ltar tar en for%a for%a clara * breve en 5(e cosist cosistee la 'esnat( 'esnat(ral rali+a i+aci& ci&n n 'e las proteínas$ esnat(rali esnat(rali+aci&n +aci&n,, Consiste en la prdida de la estructura terciaria, por romperse los puentes !ue forman dic'a estructura. @odas las proteínas desnaturalizadas tienen la misma conformación, muy abierta y con una interacción má9ima con el disolvente, por lo !ue una proteína soluble en agua cuando se desnaturaliza se 'ace insoluble en agua y precipita. La desnaturalización se puede producir por cambios de presión y temperatura, variaciones del p), determinadas radiaciones electromagnticas agentes físico físicos2 s2 así como como los cambio cambioss en concent concentraci ración ón salina salina o determi determinad nadas as sustancias sustancias !uímica como la urea agentes !uímicos2. !uímicos2. *n algunos algunos casos, si las condiciones se restablecen, una proteína desnaturalizada puede volver a su ante anteri rior or pleg plegam amie ient nto o o conf confor ormac mació ión, n, proce proceso so !ue !ue se deno denomi mina na renaturalización. La desnaturalización de las proteínas tambin se da e por la e9posición de estas a: Calor La luz ultravioleta. =cidos y bases. (olventes orgánicos. (ales de iones metálicos pesados. -$ E6pli5(e E6pli5(e 5(7 s(ce'e s(ce'e c(an'o c(an'o el cabello cabello se so%ete so%ete a los tinte tintes s 'e iris iris * alisa'o8 este proceso es reversible o irreversible9 :$ E6pli E6pli5(e 5(e por5(e por5(e las pe+(;a pe+(;as8 s8 los c(ernos c(ernos88 las (;as8 el cabello cabello * las pl(%as no se 'is(elven con el a)(a$ <$ Cons(ltar Cons(ltar 'e 'e 5(e 'epen'e 'epen'e la sol(bi sol(bili'a' li'a' 'e 'e las proteín proteínas$ as$ La solubilidad de una proteína depende de los siguientes factores: e s( co%posici&n en a%ino.ci'os: una proteína rica en aminoácidos pola polare ress es, es, en gene genera ral,l, más más 'idr 'idros osol olub uble le !ue !ue una una prot proteí eína na rica rica en aminoácidos 'idrofóbicos. e s( estr(ct(ra tri'i%ensional : las proteínas fibrosas son, en general, menos solubles !ue las globulares. el entorno 'e la propia proteína, La temperatura, la constante dielctrica del medio, el p) del mismo y la fuerza iónica son los principales factores ambientales !ue influyen en la solubilidad de una proteína.
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La solubilidad es debida a los radicales FR2 libres de los aminoácidos !ue, al ionizarse, establecen enlaces dbiles puentes de 'idrógeno2 con las molculas de agua. "sí, cuando una proteína se solubiliza !ueda recubierta de una capa de molculas de agua capa de solvatación2 !ue impide !ue se pueda ueda uni unir a otra otrass prot proteí eína nass lo cua cual prov provoc ocar aríía su prec precip ipit itac aciión insolubilización2. *sta propiedad es la !ue 'ace posible la 'idratación delos te&idos de los seres vivos.
=$ E6pli5(e E6pli5(e c(an'o es es positiva positiva la reacci&n reacci&n 'e Bi(ret8 Bi(ret8 escrib escriba a la reacci&n$ reacci&n$ La producen los pptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya !ue se debe a la presencia del enlace peptídico F C;F 6) F2 !ue se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia comple&a denominada Biuret. 1ebido 1ebido a dic'a reacción reacción fue !ue observamos !ue al agregar el reactivo de sulfato sulfato de cobre mas solución solución de proteína proteína precipito precipito una coloración coloración violeta. $uedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reacción positiva. ?recipitand ?recipitando o a una coloración coloración amarilla la reacción reacción nos torna negativa negativa al no 'aber presencia de proteínas. La reacción debe su nombre al Biuret, una molcula formada a partir de dos de urea )+6FC;F6)FC;F6)+2, !ue es la más sencilla !ue da positiva esta reacción. La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. *l reactivo de Biuret contiene Cu(; en solución acuosa alcalina de 6a;) o G;)2. La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un comple&o de coordinación entre los iones Cu+H y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno !ue forma parte de los enlaces peptídicos presentando un má9imo de absorción a - nm.
1a positiva esta reacción en todo todoss los los comp compues uesto toss !ue !ue teng tengan an dos dos o más más enla enlace cess peptídi peptídicos cos consec consecuti utivos vos en sus molculas.
>$
Cons(lte otras t7cnicas (tili+a'as (tili+a'as para la c(antifica c(antificaci&n ci&n
'e proteínas$ 0todo de Biuret (e basa en la formación de un comple&o coloreado entre el Cu+H y los grupos 6) de los enlaces peptídicos en medio básico. 3Cu+H se acomple&a con 6). La intensidad intensidad de coloración coloración es directamente directamente proporcional proporcional a la cantidad cantidad de proteínas proteínas enlaces peptídicos2 y la reacción es bastante específica, de manera !ue pocas sust sustan anci cias as inte interf rfie iere ren. n. La sens sensib ibililid idad ad del del mto mtodo do es muy muy ba&a ba&a y sólo sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados por e&emplo en suero2. 0todo de Bradford
(e basa en la unión de un colorante, colorante, Comassie Comassie Blue EF+- tambin tambin (erva Blue2 a las proteínas. *l colorante, en solución ácida, e9iste en dos formas una azul y otra naran&a. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un comple&o proteínaFcolorante con un coeficiente de e9tinción mayor !ue el colorante libre. *ste mtodo es sensible 3F3 Ig2, simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. *ntre las sustancias !ue interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. 0todo de BC" *l ácido bicinconínico, bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un comple&o p%rpura intenso con iones Cu3H en medio alcalino. *ste reactivo forma la base de un mto mtodo do anal analít ític ico o capaz capaz de moni monito tori riza zarr el ion ion cupro cuproso so prod produci ucido do en una una reacción entre las proteínas con Cu+H en medio alcalino reacción de Biuret2. La est estabil abilid idad ad del del reac reacttivo ivo y el crom cromóf ófor oro o prop propor orci cion ona a un mtod todo o para para la cuantificación de proteínas !ue es sencillo, rápido, muy sensible, y !ue muestra una gran tolerancia a compuestos !ue afectan a otros mtodos. ;)F ?roteína H Cu+H J Cu3H Cu3H H BC" J comple&o p%rpura BC"F Cu3H
BIBLIOGRA4IA •
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