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EXPERIENCIA EDUCATIVA:
Laboratorio de Bioquímica CATEDRÁTICO:
MTRA. LAURA MARTÍNEZ MÁRQUEZ INTEGRANTES:
LUIS ALFREDO RODRÍGUEZ BLANCO JULIO VICENTE SERNA
XALAPA, VER A 9 DE MARZO DEL 2012
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
Objetivo:
Que el alumno realice una curva de titulación de aminoácidos y a partir de ella determine el pK y el pH en el que se encuentra su poder amortiguador. Fundamento:
Los ácidos difieren en el grado en que se disocian en agua. Los ácidos fuertes se disocian por completo; los ácidos débiles no. La probabilidad de que un ácido se disocie se define por su constante de disociación, Kd: Kd= [H+][A]/ [HA]
Debido a que las formas protonada y no protonada tienen propiedades biológicas diferentes, es importante poder predecir el grado de disociación de un ácido a cualquier pH. Es conveniente modificar la expresión de Kd en una forma análoga al pH, el pK. pK= -log kd Ahora, es posible usar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para predecir el grado de disociación del medio: pK= pH + log [A]/[HA] Los aminoácidos tienen un grupo amino que les permite actuar como base y combinarse con ácidos y un grupo carboxilo les permite combinarse con bases. Los aminoácidos y las proteínas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y de alcalinidad. Material y reactivos:
Material de laboratorio Vasos de precipitados de 100m\ Vasos de precipitados de 150ml Pipeta graduada de 1mi Bureta Agitador magnético
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
Reactivos
Glicina 0.025M pH 2.0 Lisina 0.025M pH 2.0 Ácido aspártico 0.025M pH 2.0 NaOH 1M Equipo Potenciómetro
Procedimiento:
Determinación de pKa. 1. Ponga 20ml de la solución de glicina en un vaso de precipitado de 100ml. 2. Proceda a la medición del pH 3. Añada 0.1 ml de NaOH 1.0M. Agitar el vaso y volver a medir el pH anotando los resultados. 4. Repita el paso 3 hasta llegar a un pH de 12 aproximadamente. 5. Haga lo mismo (pasos del 1 a 4) para los otros aminoácidos. 6. Haga una gráfica de pH contra volumen en mI de NaOH gastados luego de tomar en cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en 20ml aumenta la concentración de OH- en 50mmoles. 7. Localiza en la grafica los diferentes pK de los aminoácidos. 8. Identifica a que pH tienen poder amortiguador Determinación de la capacidad buffer La capacidad buffer es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH de la disolución reguladora, en una unidad de pH: C.B.= d b/ dpH Siendo dpH el incremento de pH resultante de la adición de un volumen d b de base.
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
1. Ponga su disolución en un vaso, introduzca los electrodos del potenciómetro y disponga una bureta con disolución de NaOH 1N Y un agitador magnético, dentro del vaso. Determine el pH inicial.
2. Ponga el agitador en marcha sin que este golpee los electrodos, y agregue un volumen de NaOH 1N medido exactamente en la bureta (1 ml). Anote el pH resultante. Repita las adiciones de base, en volúmenes iguales (1ml) y anote los valores de pH correspondientes, hasta obtener por lo menos cinco lecturas. Hipótesis:
Los valores de pH deberían ir en aumento conforme se van agregando las cantidades de hidróxido de sodio a los diferentes aminoácidos partiendo del pH de cada uno de estos hasta llegar a un pH de 12 para cada uno de estos. Los valores obtenidos deberán arrojar valores que al momento de graficar nos dará una curva que va en aumento de manera directamente proporcional al aumento de pH sobre el aumento de la cantidad agregada de hidróxido de sodio.
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
Hoja de reporte
1. Determinación de pka:
Acido aspártico pH inicial 3.08 ml de NaOH agregados
pH obtenido
.4 .2 .5 .3 .3 .1 .2 .1
3.62 4.03 9.05 10.07 10.75 10.85 11.85 12.03
Lisina pH inicial 9.21 ml de NaOH agregados
pH obtenido
.2 .2 .2 .2 .2 .2 .2 .2 .2
9.55 9.85 9.90 10.43 10.78 10.98 11.28 11.62 12.00
Glicina pH inicial 7.11 ml de NaOH agregados
pH obtenido
.1 .1 .1 .1 .1 .1 .1 .1 .1 .1 .1 .1
8.58 8.79 8.95 9.08 9.26 9.35 9.44 9.52 9.65 9.69 9.79 9.84
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
.1 .1 .1 .1 .1 .2 .3 .3 .3 .3
9.94 10.04 10.15 10.19 10.26 10.32 11.60 11.69 11.81 12.0
2. Realice una grafica de los resultados (pH contra ml de NaOH gastados)
Acido aspártico pH inicial 3.08 14 12 10 o d i n e t b o H p
8 NaOH agregados (ML)
6
pH obtenido
4 2 0 1
2
3
4
5
6
NaOH agregado (ml)
7
8
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
Lisina pH inicial 9.21 14 12 10
o d i n e t b O H p
8 6
pH obtenido
4
ml de NaOH agregados
2 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
NaOH agregados (ml)
Glicina pH inicial 7.11 14 12 10
o d i n e t b O H p
8 6
pH obtenido
4
ml de NaOH agregados
2 0 1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21
NaOH agregado (ml)
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
3. Calcule el pK y el pH en el cual se encuentra la máxima capacidad amortiguadora.
Acido aspártico pH= 10.85
pK= 12.45
Lisina pH=10.98
pK= 12.49
Glicina pH=10.32
pK= 11.92
4. Determine la capacidad buffer
Acido aspártico 1.8/1= 1.8 Lisina 1.2/.40= 3 Glicina 1.9/.90= 2.1 Discusión de resultados:
Al agregar las cantidades en ml de NaOH se puede observar que se llega a un momento donde el cambio del pH no es muy significativo, es decir se mantiene un tanto constante dentro de un rango, después de agregar determinada cantidad de NaOH se puede observar que el pH se dispara de manera considerable es por eso que las cantidades agregadas de NaOH se controlan y son muy pocas ya que si se agrega demasiado se puede sobrepasar el valor de pH que se espera obtener.
Conclusión:
Una forma conveniente de expresar la relativa fortaleza de un ácido es mediante el valor de su pK a, que permite ver de una manera sencilla en cambios pequeños de pK a los cambios asociados a variaciones grandes de K a. Valores pequeños de pK a equivalen a valores grandes de K a (constante de disociación) y, a medida que el pK a decrece, la fortaleza del ácido aumenta. Un ácido será más fuerte cuanto menor es su pKa y en una base ocurre al revés, que es más fuerte cuanto mayor es su pKa. Esas constantes de disociación no son fijas, dependen de otras variables. Por ejemplo, la constante de disociación cambia a temperaturas diferentes. Sin embargo, mantiene su valor a la misma temperatura, ante cambios de la concentración de alguna de las especies o incluso ante la acción de un catalizador.
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
Cuestionario: Indica el pKa de los siguientes ácidos:
a) Ácido pirúvico pK= 3.5 b) Ácido láctico pK= 3.5 c) Ácido benzoico pK=4.20 d) Ácido oxálico pK= 1.19 e) Ácido succínico pK= 4.20 f) Ácido carbónico pK= 6.35 Indique el nombre completo, pKa y peso molecular (o formula) de los siguientes compuestos usados como reguladores de pH en bioquímica: TRIS, CAPS, MES, TES Y tricita. es el nombre abreviado del compuesto orgánico conocido como Tris tris(hidroximetil)aminometano, de fórmula (HOCH 2)3CNH2. El Tris tiene un pKa de 8,06, lo que le aporta capacidad tamponante efectiva en un intervalo de pH entre 7,0 y 9,2.
¿Por qué los aminoácidos actúan como reguladores del pH?
R= Los aminoácidos son sustancias anfóteras, esto quiere decir que en disolución acuosa se pueden comportar como ácidos y como bases dependiendo del pH de la disolución, esto es debido la presencia del grupo carboxílico que tiene carácter ácido y del grupo amino que tiene carácter básico. Cuando están en disolución acuosa con pH próximo a la neutralidad los aminoácidos están ionizados formando iones dipolares o híbridos, el pH en el que un aminoácido forma un ión híbrido se denomina punto isoeléctrico (PI). El grupo carboxílico pierde un protón (actúa como ácido) y el grupo amino gana un protón (actúa como base). En algunos aminoácidos en las cadenas laterales existen otros grupos aminos (básicos) y carboxílicos (ácidos) que también se ionizan. Si aumenta el pH el medio se hace básico, disminuye la concentración H+. El aminoácido tiende a neutralizar la basicidad, libera protones y se carga negativamente, se comporta como un ácido. Disminuye el pH, el medio se hace ácido, aumenta la concentración de H+. El aminoácido tiende a neutralizar la acidez captando H+ y se carga positivamente, se comporta como base. El carácter anfótero de los aminoácidos permite la regulación del pH, ya que se comportan como ácidos o bases según convenga al organismo.
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
5. Define ¿Qué es la capacidad buffer?
Un buffer o Tampón químico, en términos químicos, también es un sistema constituido por un ácido débil y su base conjugada o por una base y su ácido conjugado que tiene capacidad "tamponante", es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH (en un margen concreto) en una disolución acuosa.
Bibliografía:
Horton Robert H. Lawrence A. Moran. Raymonds S. Ochs. David Rawn J.\Scrirngeour Gray K (1996). Principies of Biochemistry. (2a edición).USA: Prentiee-Hall. Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2009). Principios de Bioquímica (4a Edición) Barcelona, España: Omega.
ARTICULO
La administración de glicina en el estriado induce daño oxidativo en lípidos y proteínas y altera las defensas antioxidantes en el cerebro de ratón. Objetivos: Hemos investigado los efectos de la administración in vivo en el estriado de
glicina (Gly), que se halla en elevadas concentraciones en el cerebro de pacientes afectados de hiperglicinemia no cetósica (NKH), sobre parámetros importantes de estrés oxidativo. Métodos principales: Se han medido en el estriado de ratas de 30 días de edad los valores
de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBA-RS, que valoran la peroxidación lipídica), fomación de grupos carbonilo ( expresión del daño oxidativo en proteínas), contenido de grupos sulfidrilo, concentración de glutatión reducido, producción de óxido nítrico y actividad de las enzimas antioxidantes glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, catalasa, superóxido dismutasa y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (defensas antioxidantes), después de la inyección de glicina. Resultados clave: La administración de Gly aumenta significativamente los valores de
TBA-RS, lo que implica daño oxidativo en lípidos. Además, este aumento se puede prevenir totalmente mediante el antagonista MK-801 del receptor de NMDA, lo que indica
PRACTICA #2: DETERMINACIÓN DE PK
la implicación del receptor de glutamato NMDA en este efecto. La inyección de Gly también induce la formación de carbonilos de las proteínas, así como la elevación de las actividades de glutatión peroxidasa, glutatión reductasa, catalasa y superóxido dismutasa. Por el contrario, los niveles de glutatión, contenido de sulfidrilos, producción de óxido nítrico y actividad de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa no se modifican por la Gly. Significado: Estos datos muestran que la administración de Gly in vivo causa peroxidación
lipídica, probablemente secundaria a la estimulación de NMDA, induce la oxidación proteica y modula las actividades de importantes enzimas antioxidantes en el estriado. En el caso de que estos hallazgos se puedan extrapolar a la NKH humana, es posible que el estrés oxidativo pueda estar implicado en la fisiopatología del daño cerebral observado en pacientes con esta enfermedad neurológica. Lycine intrastriatal administration induces lipid and protein oxidative damage and alters the enzymatic antioxidant defenses in rat brain. Seminotti B, Knebel LA, Fernandes CG, Amaral AU, da Rosa MS, Eichler P, Leipnitz G, Wajner M. Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil. Life Sci. 2011 Aug 15;89(7-8):276-81.
