Determinación de la Actividad Actividad de Ureasa
Bioquímica
PRÁCTICA DE LABORATORIO N°1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA I.
INTROD INT RODUCC UCCIÓN IÓN..
Las enzimas son biocatalizadores biocatalizadores específcos de naturaleza proteica proteica que actúan actúan aceler acelerand ando o las reacc reaccion iones es químic químicas as exper experime imenta ntando ndo cambios ísicos durante ellas, pero recuperando su estado original cuando dichas reacciones han culminado. De manera general, una reac reacci ción ón quím químic ica a cata catali liza zada da por por una una enzi enzima ma se repr repres esen enta ta de la siguiente manera: '1'?23?6 4 +/GF=3
6=L+%6 +/GF=3 '1'?23 ?23?6
+/GF=3
La ure ureasa, asa, aisl aislad ada a cris cristtaliz alizad ada a en !"#$ !"#$ por por el bio bioquím químic ico o estadounidense %.&. 'ummer, 'ummer, se puede puede aislar de de (egetales, mohos bacterias, no encontr)ndose presente en las c*lulas de mamíeros. +sta enzima actúa sobre enlaces carbononitrógeno - /0 dierente de los enlaces peptídicos cataliza la siguiente reacción: 12+3 4 5 #6 6# 4 #/57, pudiendo ser inhibida por iones plata, mercurio, otros metales pesados. 'e se8ala que un reductor sua(e como el sulfto produce su inacti(ación re(ersible. 1na unidad de ureasa se defne como aquella que libera un micromol de amoníaco a partir de urea, por minuto, ba9o condiciones de ensao específcas de p5 temperatura - h ;.# 7; <0. +l ob9e ob9eto to de la pres presen ente te exper xperie ienc ncia ia es demo demost stra rarr la acti acti(i (ida dad d enzim)tica, determinando para ello la acti(idad de ureasa.
II. II.
MATERI MATERIAL ALES ES.. !. =aterial =aterial &iológ &iológico: ico: +nzima +nzima 1reasa 1reasa.. #. =aterial =aterial +quipo +quipo de Labora Laboratorio: torio: >radillas para tubos. ?ubos de ensao de !7 x !@@ mm. -@;0. ?ubos ipetas de ! ml. -@.#A una al !B!@@0, #ml, Cml !@ ml. &a8o =aría a 7; <. >oteros o pipetas descartables de pl)stico. izeta con agua destilada. +spectrootómetro o otocolorímetro. otocolorímetro. +spectrootómetro 7. 2eact eacti( i(os os:: &uEer ?ris5L @.@C =, p5 ;.#
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III.
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'olución de urea @.@;C = en buEer ?ris 5l @.@C =, p5 ;.# 'olución de ureasa @.@C H 'olución de 5gl # !H 'olución de ro9o de metilo @.@IH
PROCEDIMIENTO. A. SISTEMA DE INCUBACIÓN:
COMPONENTES(ml) Y PROCESO
TUBO 1
TUBO
&uEer ?ris 5l @.@C = p5 ;.#
@.C
@.C
1rea @,@;C= buEerada 7.@ 7.@ =ezclar preincubar a 7;J por C minutos 1reasa @.@CH @.C Fncubar a 7;J por !C minutos =ezclar sua(emente e incubar a 7;< por !C minutos 5gl# ! H, mezclar
# gotas
# gotas
1reasa @.@C H
@.C
=ezclar, preparar seguir con los siguientes sistemas
B. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL MÉTODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS: 1. CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTO FORMADO. REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN: 'e pasa #ml. De contenido del tubo !-ontrol o &lanco0 a otro tubo marcado -!&0, se a8ade una gota del indicador ro9o de metilo al @.@I H se titula con 5l @.@C/ -usar pipeta de ! ml. >raduada al !B!@@0. +l punto fnal es la aparición de un color rosa p)lido. 'e anota el (olumen del )cido gastado, el cual se restar) del (alor de titulación a obtener en el tubo #. +ste tubo blanco represente el )cido necesario para neutralizar los componentes del medio inicial.
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Luego se pasa #ml del contenido del tubo # -roblema0 a otro tubo marcado -#&0 se procede a titular como en el paso anterior. omo se produce una base en esta reacción, el tubo experimental problema -tubo #0 necesita )cido para lograr la neutralización.
CÁLCULOS: 'e calculan los resultados en t*rminos de (elocidad de reacción o acti(idad enzim)tica expresados como micromoles de úrea desdoblados por minuto a 7;< -unidades de ureasa0.
Kelocidad-Kol. 5l gastado -problema0 M Kol. 5l-blanco0 -=olaridad de 5l0-!@@@0-I0 +xpresar la acti(idad de ureasa en t*rminos de unidades enzim)ticas -unidades de ureasa0, considerando, adem)s de la temperatura el tiempo, la cantidad -en peso0 de ureasa empleada el h.
. CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTO FORMADO. MÉTODO COLORIMÉTRICO
(
ESPECTROFOTOMÉTRICO)!
REACCIÓN DE NESSLER:
COMPONENTES (mL) ?ubo
!
BLANCO
1
del
sistema
de
@.!
incubación ?ubo # del
sistema
de
@.!
incubación 3gua destilada
I.C
I.I
I.I
2eacti(o de /essler
@.C
@.C
@.C
De9ar en repodo durante !@ minutos leer en otocolorímetro con fltro (erde, o en espectrootómetro a CI@ nm. Fngeniería 3groindustrial
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CÁLCULOS: ") CORRECCIÓN DE LECTURAS: 2estar lectura del tubo blanco de reacti(os de las lecturas de los tubos ! -control o blanco0 # -problema0. Luego, restar la lectura del tubo ! de la lectura del tubo #.
#) VELOCIDAD DE REACCIÓN O ACTIVIDAD DE UREASA: 'e determina en t*rminos de mg de /5 7 producido por mL, mediante la siguiente órmula:
Kelocidad -Lectura del tubo#0 -actor de calibración0
actor
de
calibración:
otocolorímetro
@.@$
Nlett'ummerson,
7;
mg
/57BmL
para
espectrootómetro
'pectronic#@, respecti(amente. Determinar
las
1nidades
de
1reasa
en
t*rminos
de
micromoles de /57 producidos pro minuto, a 7;< a p5 ;.#, considerando la cantidad -en peso0 de ureasa utilizada.
IV.$ CUESTIONARIO: 1.$ E%PLICAR EL DISE&O E%PERIMENTAL. 'CUAL ES EL PROPÓSITO DE CADA TUBO 'CUÁL ES EL TUBO CONTROL 'ES NECESARIO MÁS DE UN TUBO CONTROL E%PLICAR EL DISE&O E%PERIMENTAL. +l propósito de esta pr)ctica es demostrar la acti(idad enzim)tica determinando la acti(idad de la ureasa. 'abemos que las enzimas son biocatalizadoras específcos de naturaleza proteica que actúan acelerando las reacciones, uno de los actores que aectan es el tiempo de incubación en los dos tubos que se expreso en t*rminos de (elocidad.
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1na (ez obtenidos los tubos ! # por sistema de incubación procedemos a la (aloración de la acti(idad de la ureasa por el m*todo de productos ormados. rimero lo haremos por reacción de neutralización donde tomamos ! mL de cada tubo para colocarlos en los tubos !-&0 #-&0 donde luego a8adimos ! gota de ro9o de metilo al @.@IH lo titulamos con 5L @.@C/obser(ando como punto fnal un rosa p)lido que indicara por fnalizada la titulación. +n el tubo -&0 obser(amos que necesito mas acido para lograr neutralizarse. on los datos obtenidos en esta experiencia se precedió a calcular los resultados en t*rminos de (elocidad de reacción o acti(idad enzim)tica expresados como micro moles de urea desdoblados por minuto a 7;J -unidades de ureasa0 con un p5 optimo de ;.# 'egundo por reacción de /essler donde haremos tres tubos: &lanco, ! # de acuerdo a los componentes indicados, de9aremos en reposo por !@ minutos lo leeremos en otocolorímetro con fltro (erde, o un espectrootómetro a CI@ nm. Lo cual nos permitió hacer c)lculos en corrección de lecturas hallar la (elocidad de reacción o acti(idad de ureasa
'CUAL ES EL PROPÓSITO DE CADA TUBO •
+n el primer tubo se demostró que cuando existe un inhibidor enzim)tico en el sistema, la reacción no se da, quedando la enzima
•
inacti(a. +n el segundo tubo se demostró que a condiciones especifcas, se orma amoniaco debido a la acti(idad de la enzima.
'CUÁL ES EL TUBO CONTROL
+l tubo control (iene a ser el tubo ! en el cual no hubo ninguna reacción enzim)tica, el cual nos sir(e para la comparación del tubo #
'ES NECESARIO MÁS DE UN TUBO CONTROL +n este caso si hubiera sido necesario un tubo donde hubiera tenido todos los reacti(os excepto la ureasa, para así (erifcar si (erdaderamente el inhibidor enzim)tico inacti(a al !@@H a la enzima. Fngeniería 3groindustrial
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.$ OBSERVE LAS REACCIONES EN LOS TUBOS DE TITULACIÓN Y ANOTAR SUS OBSERVACIONES. Luego de haber realizado el sistema de incubación de los tubos ! #, agregamos en los tubos !-&0 #-&0 #mL de *stos para agregarles ro9o de metilo al @.@I H se obser(ó que en ambos la solución tornó amarillenta. Despu*s se procedió a titular con 5l hasta que dio en ambos una coloración rosa p)lido que es el punto fnal. Las obser(aciones en el tubo !-&0 ueron que con solo @.!C mL se tornó color rosa p)lido lo que se indicó como tubo control, en el tubo #-&0 para que se torne rosa p)lido en la titulación de 5l requirió @.C$ mL lo que se indicó como un tubo problema que requiere de m)s acido para poder neutralizarse.
.$ CALCULE LAS UNIDADES DE LA UREASA A PARTIR SUS RESULTADOS. Kelocidad
-Kol. 5l gastado
-problema0
M Kol. 5l gastado
-blanco0
0
-molaridad 5l0 -!@@0 -I0 -!C minutos0 -#0 -#ml.0 Kelocidad P u moles de úrea desdobladasBminuto, a 7;<, p5 ;.#
1nidad de ureasa: antidad de ureasa necesaria para desdoblar ! u mol de úreaBminuto, a 7;<, p5 ;.#
•
•
'i:
P u moles úrea desdobladas
Q -P u moles úrea0 @.C ml. de ureasa
Q u moles úrea desdobladas
!@@ ml. de ureasa
-!@@ ml.0
@.C ml Q O u moles de úrea.
'i: Q u moles úrea son desdobladas
@.@C g. Gureasa -Q moles úrea0
G u moles úrea son desdobladas
!@@ g. ureasa
P*+ ,"-,*: 'i ! unidad de ureasa % unidad ureasa
!@@ g
! u mol úrea G u moles úrea
C"-,/"/ /0 +0"2" " 3"+,+ /0 -02,+*2 +02l,"/*2 :
V*l. 45l 6"2,"/* TUBO 1 @.!C m l
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-@.@C g0
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V*l. 45l 6"2,"/* TUBO @.C$ m l
Kelocidad
[email protected]$ M @.!C0 -@.@C0 -!@@@0 -I0 -!C minutos0 -#0 -#0 Kelocidad !.7$ u moles de úrea desdobladasBminuto.
Q -!.7$ u moles de úrea0 -!@@ ml0
[email protected] Q #;# u moles de úrea. G -#;# u moles úrea0 -!@@ g.0 -@.@C g.0 G CII@@@ u moles úrea.
P -! unidad de ureasa0 -CII u moles úrea0 -! u mol úrea0 P CII@@@ unidades de ureasa.
7.$ 'CUÁL ES LA FUNCIÓN DEL 48CL EN ESTE ENSAYO La unción del 5g L# en experimentación del sistema de incubación es detenerla acti(idad enzim)tica de la ureasa. +l 5gl# cumplió la unción de inhibir o neutralizar el proceso de la reacción.
9. DISE&AR TABLA CON SUS RESULTADOS: VELOCIDAD Y Z %
!,7$ moles de urea desdobladaBmin #;# unidades molesde úrea CII@@@ unidades moles de urea CII@@@ unidades de ureasa
. 'A ;UÉ DATOS E%PERIMENTALES PUEDE REMITIRSE PARA AFIRMAR ;UE LAS ENZIMAS SON DE NATURALEZA PROTEICA SE8
omo el ob9eti(o de nuestra practica es demostrar la acti(idad enzim)tica determinando para ello la acti(idad de la ureasa, por conocimiento
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sabemos que las enzimas son biocatalizadores específcos de naturaleza proteica que actúan acelerando las reacciones químicas en este caso uno de los actores que aectan esta acti(idad enzim)tica es el tiempo de incubación en los tubos ! # - con los componentes indicados en cada uno de ellos0 que nos permitió expresar esta acti(idad en t*rminos de (elocidadA es decir, la cantidad de producto ormado por unidad de tiempo que generalmente se determina en micromoles de producto ormado por minuto, teniendo en cuenta un p5 optimo de ;.# un temperatura de7;J.1na (ez obtenidos los tubos ! # por sistema de incubación procedemos a la (aloración de la acti(idad de la ureasa por el m*todo de productos ormados. rimero lo haremos por reacción de neutralización donde tomamos ! mL de cada tubo para colocarlos en los tubos !-&0 #-&0 donde luego a8adimos ! gota de ro9o de metilo al @.@IH lo titulamos con 5L @.@C/ obser(ando como punto fnal un rosa p)lido que indicara por fnalizada la titulación. +n el tubo -&0 obser(amos que necesito mas acido para lograr neutralizarse. on los datos obtenidos en esta experiencia se precedió a calcular los resultados en t*rminos de (elocidad de reacción o acti(idad enzim)tica expresados como micromoles de urea desdoblados por minuto a 7;J -unidades de ureasa0 con un p5 optimo de ;.#.'egundo por reacción de /essler donde haremos tres tubos: &lanco, ! # de acuerdo a los componentes indicados, de9aremos en reposo por !@ minutos lo leeremos en el otocolorímetro con fltro (erde, o un espectrootómetro a CI@ nm. Lo cual nos permitió hacer c)lculos en corrección de lecturas hallar la (elocidad de reacción o acti(idad de ureasa.
•
+l *xito del traba9o con enzimas depende del cuidado con que se e(iten las condiciones en las cuales son inestables: Deben e(itarse altas temperaturas acidez o alcalinidad extremas. Durante el aislamiento la purifcación con(iene, en general, traba9ar entre @ I o e(itar p5 maor que " o menor que C.
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•
Debe e(itarse la ormación de espuma, a que la misma es
•
indicador de desnaturalización proteica. Los sol(entes org)nicos inacti(an
muchas
enzimas
a
temperatura ambienteA de modo que los raccionamientos con los mismos deben lle(arse a cabo a ba9a temperatura *sta no debe ele(arse hasta que el sol(ente se haa eliminado o diluido a concentraciones inocuas. Deben tomarse tambi*n (arias precauciones en lo que se
•
refere a las condiciones de la reacción: +legir p5 temperatura en las zonas de maor estabilidad de
la enzima Lle(ar a cabo la reacción a temperatura constante. +legir un buEer adecuado para e(itar cambios de p5 +(itar la introducción de trazas de otras enzimas -por e9emplo
sali(a0. +legir una cantidad de enzima adecuada para obtener
(ariaciones apropiadas de la magnitud a medir.
=) E%PLI;UE EL FUNDAMENTO DE LA VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA MEDIANTE EL MÉTODO DELOS PRODUCTOS FORMADOS UTILIZANDO LA REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN. 3 partir del experimento realizado se puede concluir que la ureasa aceleró la reacción a que cuando se aplicó el amortiguador a ambos tubosA el tubo #, el cual contenía la enzima tenía como producto: 3=6/F36 dióxido. +sto se (io e(idenciado en el proceso de titulación, cuando el tubo # requirió un maor gasto para neutralizar la base ormada -amoniaco0.
>) 'CÓMO SE DENOMINA LAS SUSTANCIAS SOBRE LAS CUALES ACT
eneralmente, las
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enzimas se nombran a8adiendo la terminación SasaS a la raíz del nombre de la sustancia sobre la que actúan. =ecanismos de control de la acti(idad enzim)tica: •
L" ,0m30+",+": 'i se suministra a una reacción enzim)tica energía en orma de calor, al ser captada por las mol*culas es transormada en energía cin*tica. +llo a(orece la mo(ilidad de estas mol*culas por tanto el número de encuentros se incrementa. 'i la temperatura es excesi(a, la enzima, cua estructura es proteínica, se desnaturaliza perdiendo totalmente
•
sus propiedades, de orma que la acti(idad enzim)tica P4: ?odas las enzimas tienen dos (alores límite de p5 entre los cuales son eecti(as. ?raspasados estos (alores, la enzima se desnaturaliza de9a de actuar. +ntre estos dos (alores extremos se sitúa un p5 en el cual la enzima alcanza una eecti(idad m)xima: +s el llamado p5 óptimo. +ste es independiente del punto isoel*ctrico de la mol*cula enzim)tica, es decir, cuando *sta no tiene carga global, a que ha tantos radicales )cidos como b)sicos. +l p5 óptimo est) condicionado por el tipo de enzima de sustrato, debido a que el p5 inTue
•
en el grado de ionización de los radicales del sustrato. C*-50-,+"5?- /0l 22,+",* : +n toda reacción enzim)tica, si se incrementa la concentración del sustrato se produce un aumento de la (elocidad de ormación del producto, tiende a restablecer el equilibrio químico entre la concentración del
•
sustrato la del producto. +n este proceso la enzima no (aría. A5,@"/*+02: 3lgunos iones a(orecen la unión de la enzima con el sustratoA por e9emplo, la enzima osorilasa, que regula la ormación de 3?a partir de 3D un grupo osato -576I0 que se suele representar como i -osato org)nico0, se (e
•
acti(ada por la presencia de iones magnesio =g4 #. I-#/*+02: 5a inhibición cuando disminue la acti(idad la efcacia de una enzima. Las sustancias distintas del sustrato que tienen este eecto se denominan inhibidores
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La inhibición irre(ersible o en(enenamiento de la enzima tiene lugar cuando el inhibidor se f9a permanentemente al centro acti(o inutiliz)ndolo al alterar su estructura. La inhibición re(ersible tiene lugar cuando no se inutiliza el centro acti(o, sino que solo se impide su normal uncionamiento.
V.$CONCLUSIONES: •
+l tubo ! -&0 se indicó como un tubo control a que sólo contiene una cantidad de sustancia que luego se procedió a cuantifcar se tomó de
•
reerencia al medir la muestra real. +l tubo #-&0 se indicó como tubo problema porque se ormó una base, por lo cual *ste
requirió de m)s )cido, lo cual se usó
cuantifcación de la (elocidad de reacción.
VI.$ ANE%OS.
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