Calculo de la Actividad enzimática de la Ureasa Oscar Javier Montiel 1*, Dagoberto Ortiz Ome 1*, Mateo Bolaños 1* 1 *Estudiantes del programa de química, acultad de !iencias B"sicas, #niversidad de la $mazonia% lorencia &!aquet"' ()1
Resumen +e determin la actividad enzim"tica de la ureasa, enzima principal de la -arina de +o.a, a trav/s de Espectro0otometría #2 +e realiz el an"lisis de la dependencia de la velocidad de reaccin en 0uncin de la cantid cantidad ad enzim enzim"ti "tica ca &comp &composi osici cin', n', de la tempe temperat ratura ura . del del p-% p-% $sí mismo, mismo, se anali analiz z la especi0icidad de la accin enzim"tica, empleando la presencia de ureasa en la 3arina de so.a . contrastar su accin en la tiourea% Palabras claves: $ctividad enzim"tica enzim"tica,, +o.a, Determinaci Determinacin, n, 4e 4emperatura, mperatura, p-, Espectro0otom Espectro0otometría etría #% #% Abstract: 43e enz.matic activit. o0 urease, t3e main enz.me o0 +o.bean Meal, 5as determined t3roug3 # spectrop3otometr.2 6eaction rate dependence anal.sis 5as per0ormed as a 0unction o0 t3e enz.matic amount amount &composi &composition tion', ', temperat temperature ure and p-% 7i8e5ise 7i8e5ise,, t3e speci0ic speci0icit. it. o0 t3e enz.matic enz.matic action 5as anal.zed, using t3e presence o0 urease in t3e so.bean meal and contrasting its action in t3e t3iourea% Key words: Enz.matic words: Enz.matic activit., +o.a, Determination, 4emperature, p-, # spectrop3otometr.%
Introducción 7as 7as enzi enzima mas s son son mol/ mol/cu cula las s de natu natura rale leza za prot proteí eíni nica ca prod produc ucid idas as por por los los sere seres s vivo vivos, s, desempeñan un papel esencia cial en el meta metabo boli lism smo o de todo todos s los los orga organi nism smos os,, se encargan encargan de acelerar acelerar reaccion reacciones es químicas químicas o 3acer posibles aquellas reacciones que de otra manera no se producirían% En pocas palabras, son catalizadores biolgicos que, al reducir la ener energí gía a de acti activa vaci cin n nece necesa sari ria a para para las las reac reacci cion ones es,, tran trans0 s0o orman rman las las sust sustan anci cias as invo involu lucr crad adas as en el meta metabo boli lism smo o celu celula lar r &inclu &inclu.e .end ndo o el anab anaboli olismo smo o reacc reaccion iones es de construccin, . el catabolismo o reacciones de dest destru rucc cci in' n'%% 7a velo veloci cida dad d de la reac reacci cin n catalizada por una enzima depende del p-, de la 0uer 0uerza za ini inica ca,, de la temp temper erat atur ura a . de la presenci presencia a o ausenci ausencia a de in3ibido in3ibidores res &Burns, &Burns, 19:(2 7orens, ()1)'%
7a libe libera raci cin n de enzi enzima mas s es un proc proces eso o const constan ante te ., aunq aunque ue las planta plantas s . animal animales es intervienen, son los microorganismos los que contribu.en en ma.or medida a este proceso, debid debido o a su gran gran biomas biomasa, a, su alta alta activi actividad dad metablica . su corto ciclo de vida &!ern . Melgare;o, ())<'% % 7a ureasa es una e=oenzima que cataliza la reaccin reaccin de 3idrlis 3idrlisis is de la urea, urea, el principa principall producto celular nitrogenado de la degradacin de las proteínas . los "cidos nucleicos, el cual es m"s 0"cil de eliminar que otras 0ormas de nitr nitrg gen eno o &com &como o el amon amonia iaco co'' porq porque ue es solub soluble le en agua agua . meno menos s t=ico t=ico &+cien &+cience ce in +c3ool, ()):'% En dic3a reaccin, la urea se romp rompe e para para 0orm 0ormar ar di= di=id ido o de carb carbon ono o .
amonio, como se describe en la siguiente reaccin &>uintero?7izaola et al%, ())<'@
•
!O&A-('( -(O ⇑ (A-C !O( 7a ureasa tambi/n es considerada una $mido 3idrolasa que acta sobre los enlaces no peptídicos de amidas lineales tales como la #rea . sus derivados &BremnerMulvane., 19:(' 7a ureasa se encuentra principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados% En las plantas, es un 3e="mero &consiste en seis cadenas id/nticas' . se encuentra en el citoplasma% En las bacterias, consiste en dos o tres subunidades di0erentes% Fara su activacin necesita unir dos iones de níquel por subunidad &+cience in +c3ool, ()):'% +u p- ptimo es %G, . su temperatura ptima H) I! &andeler . Kerber, 19::'% 7as t/cnicas para obtener una determinacin cuantitativa de ureasa en muestras se basan en que la tasa inicial de la reaccin catalítica es proporcional al nmero de moles presentes, el cual se podría calcular a partir del nmero de moles de sustrato que reaccionan por minuto . mol de enzima ba;o condiciones est"ndares% &!asanova Benavides, 199<'% En nuestro caso usaremos la determinacin por espectro0otometría #%
Materiales y metodología +e prepararon di0erentes disoluciones que se de;aron en reposo durante : días, las disoluciones preparadas 0ueron@
•
Solución de Ureasa: se Pesó 14 g de harina de soya, y se depositaron en un vaso de precipitado, se adicionó 100 mL de glicerol al 75, y se agitó la suspensión por 15 minutos, se taparla y se llevó al re!rigerador por un d"a# Luego se $ltró el e%tracto glicerinado a trav&s de una gasa#
• • • • • •
Solución de Ureasa# Se disolvió 0#1 g de Ureasa a 100 mL con solución de glicerol al 75 conserv'ndola en re!rigerador# Solución (u)er de *os!ato de Sodio 1m+ p 7#00# Solución Urea 1 p-v en (u)er de !os!ato de sodio 1m+ p 7#00# Solución .iourea 1 p-v en (u)er de !os!ato de sodio 1m+ p 7#00 Solución /oo !enol 0#1 p-v en solución de etanolagua# Solución de 2a3 +# Solución de cido *os!órico +#
Determinación de la actividad enzimática del extracto de Ureasa
• 6on una pipeta de vidrio de 5 mL se midieron mL de la solución de urea 1 p-v, y se introducen en una cu8eta de espectro!otómetro# Se adicionaron 100 µL de solución 8u)er !os!ato y 100 µL de solución de roo !enol, se tapó la cu8eta con un peda9o de Para$lm y se agitó# • Se limpiaron cuidadosamente con un pao las caras lisas de la cu8eta# • Se introduce la cu8eta en el compartimiento de muestra del espectro!otómetro, procurando ;ue el ha9 de lu9 del mismo atraviese la cu8eta por las caras lisas# • Se austó el espectro!otómetro a cero de a8sor8ancia o 100 de transmitancia con el mando correspondiente# • Se con$guró el espectro!otómetro en modo de lectura continuo para ;ue registre medidas de a8sor8ancias cada 15 seg durante 1 minuto# • +omento de inicio de la reacción?# = Se tapó la cu8eta con un tro9o de Para$lm, y se invierte o
veces para me9clar 8ien el contenido de la cu8eta#
Desnaturalización de la enzima por cambio de pH.
• Se utili9ó esta solución para la determinación de la actividad de ureasa segCn el numeral 4#
@
,40D
0,057D
7 D
,A7 ,504
0,05@4 0,05
A 10
,40@ ,454
0,05 0,04AD
11
,50
0,050D
0,74@@ @7 0,D171 4 0,AD 0,@@A55 5@ 0,454 0,75@ @4
Tabla 2: Concentración y velocidad de reacción Moles = 0.1666 mol/L Epsilon rojo Fenol= 0,94 M -1cm-1
•
de
especifcidad
de
la
♣ Se reali9ó la medida de la actividad de ureasa segCn el numeral 4 pero utili9ando como sustrato la solución de tiourea#
Resultados
Tabla 1
Datos de absorbancia de la
actividad enzimática de la Ureasa 1.
tiempo !s"
#bs
activity
$ de rxn
0 1 4 5
1,DD4A 1,A4A ,005 ,0@5 ,1 ,1D
0 0,05D 0,0@ 0,0@ 0,057D 0,0@
E8s-t 1,A4A 1,00@ 0,@DD4 0,5075 0,4@@
Graica !: Absorbancia s tiem!o, elocidad de reacción s tiem!o, Actividad en"im#tica s tiem!o.
actividad en9imatica 1 #5
!>%? F 0#0@% G 1#DA /H F 1 E8sor8ancia 1#5 1 0#5 0
0
4
@
D
10 1
."empo >sg?
datos lineales Linear >datos lineales? velocidad de reaccion actividad en9ima
Tabla 3: A$%ste de m&nimos c%adrados.
pendien te
0,05@555 A4 0,0554DA 51 0,054A@ 5 0,05A 57
0,044@@ 0,01A0@707 0,01A74@ 0,055A74
Tabla ": 'atos actividad en"im#tica en"ima !re!arada. Absorbancia s (iem!o.
Time
0 1,00 ,004 ,00@
#bs
0,A4D 0,A71@ 1,0011 1,01A
4,00D 5,01 @,01 7,014 D,01@ A,01D 10,0 11,0 1,04 1,0@ 14,0D 15,0 1@,0 17,04 1D,0@ 1A,0D 0,04 1,04 ,044 ,04@ 4,04D 5,05 @,05 7,054 D,05@ A,05D 0,0@ 1,0@ ,0@4 ,0@@ 4,0@D 5,07 @,07 7,074 D,07@ A,07D 40,0D 41,0D 4,0D4 4,0D@ 44,0DD 45,0A 4@,0A
1,044 1,0@@7 1,0A 1,1145 1,1D@ 1,1@51 1,1A11 1,1@4 1,41 1,@@ 1,A 1,177 1,45 1,@AD 1,A@ 1,4 1,44D 1,474@ 1,5017 1,5D@ 1,555@ 1,5D1 1,@105 1,@7A 1,@@5@ 1,@A 1,70@ 1,747D 1,7751 1,D04 1,DA 1,D5@4 1,DD1 1,A105 1,A7@ 1,A@47 1,AA ,01DD ,045D ,071 ,0ADA ,14A ,151@
47,0A4 4D,0A@ 4A,0AD 50,1 51,10 5,104 5,10@ 54,10D 55,11 5@,11 57,114 5D,11@ 5A,11D
,17@7 ,0A ,D ,5D ,777 ,0 ,@ ,50 ,7A ,A@ ,41A ,441 ,4@5
Tabla #: datos concentración y velocidad de reacción en"ima !re!arada.
concentra velocidad de ción reacción
0 1,0@170 1 1,0@5 1,0D717@ @ 1,110@D AD 1,147D7 4 1,1@1A14D A4 1,1D5@D AD 1,117@5 A@ 1,A4@D0 D5 1,@717@ @ 1,A4045 5 1,0455 1,4701 77
0 0A4@,@174 15A4,1177 10D4A,57744 D1,1@0A1 @7A5,11D 57A7,A7D511 5071,1@4@@ 45,07A 41,1@5@ 7A,7A5DD 5,1@@D A4,474DD 10,0@0@
1,744@D0 D5 1,401D0D5 11 1,4A55 1A 1,45740 4 1,4D510@ D 1,510D51 0@ 1,540744@ D1 1,5@D74 04 1,5A7551 A1 1,@@170 1 1,@54DA@ 17 1,@D414DA @ 1,71A7D 7 1,7444@D 0A 1,771A14D A4 1,D017@5 A@ 1,D0455 1,D5A@17 0 1,DDD404 55 1,A1744@D 0A 1,A45A574 47 1,A74DA@ 17 ,00A7D 7 ,044@D 0A ,0@17@5
AA,40AA4 7AD,00A7A @74,504714 5@@,45@574 470,@D1 D4,111 0@,50401 @,5@014 174,15D 11@,D57D@@ 0@4,4DD045 01@,A44D4 1A7,A@DD 1A,1D7@4 1DA4,@A0D@1 1D5A,@7041 1D@,771ADD 17A5,7A0711 17@@,D45AA 17A,@54154 171,5A40DD 1@DA,D71D 1@@@,0D7D 1@44,@405@4 1@4,075477
A@ ,0A010@ D ,11A14DA @ ,147@5A5 74 ,17@DA 7A ,04@17 0 ,D7 4 ,@051A 15 ,DDA@1 7 ,15@D AD ,4510@ D ,7017 @@ ,A@5A57 45 ,40D51 0@ ,44DA@1 7 ,474@D0D 51 ,5001A1 4A ,54@17 0 ,54A55 1A ,57@170 1 ,5A701 77 ,@0744@ D1
1@04,5@5011
en9ima preparada actividad
15D@,1DA 15@D,15D
!>%? F 0#0% G 0#A
a8sor8ancia 1 /H F 1
1551,45@5D
0
154,D57055
0
10 0 0 4 0 5 0 @0 70
tiempo
151A,7411 1504,015 14DA,D04D4A 1475,11@7@5 14@1,770@0D 144D,541@5 145,0D77 14,4AA1D 1410,0775 1A7,A@@D1 1D@,A@07 174,17@1 1@,A4@5AA 151,D1@11 140,@05@5@ 1A,A1A7
Graica 2: Absorbancia s tiem!o
Tabla $: Datos de la )n*l%encia tem!erat%ra +60 C en la en"ima.
Time
0 1,00 ,004 ,00@ 4,00D 5,01 @,01 7,014 D,01@ A,01D 10,0 11,0 1,04 1,0@ 14,0D 15,0 1@,0 17,04 1D,0@ 1A,0D 0,04 1,04 ,044 ,04@ 4,04D
#bs
0,@717 0,@AD7 0,74@ 0,75A 0,77AA 0,D07A 0,D@1 0,D@4 0,DA5 0,A05 0,A4D7 0,A7@7 1,004 1,01D 1,05DA 1,0D5A 1,114 1,1DD 1,1@4 1,1A 1,14A 1,A@ 1,@A 1,D7D 1,11
de
la
5,05 @,05 7,054 D,05@ A,05D 0,0@ 1,0@ ,0@4 ,0@@ 4,0@D 5,07 @,07 7,074 D,07@ A,07D 40,0D 41,0D 4,0D4 4,0D@ 44,0DD 45,0A 4@,0A 47,0A4 4D,0A@ 4A,0AD 50,1 51,10 5,104 5,10@ 54,10D 55,11 5@,11 57,114 5D,11@ 5A,11D
1,41 1,5@7 1,7A 1,4011 1,47 1,44D 1,4@45 1,4D5 1,5054 1,55 1,5447 1,5@4 1,5D@ 1,@01@ 1,@01 1,@7A 1,@55D 1,@75 1,@A1 1,70D 1,75@ 1,741 1,75A1 1,7755 1,7A 1,D0D1 1,D4 1,DA7 1,D5@ 1,D71@ 1,DD7 1,A04 1,A1@7 1,A4 1,A474
Tabla %: datos concentración y velocidad de reacción de la in*l%encia de la tem!erat%ra +60C en la en"ima%
%oncentra ción
$elocidad de reacción
0,74A7D 7 0,770D510 @4 0,D00A574 47 0,DA@D0D 51 0,D5A4@D0 D5 0,DDA4@D0 D5 0,A1A@17 0 0,A4A4@D0 D5 0,A7A55 1A 1,00A55 1A 1,0A045 5 1,0@D404 55 1,0A7@5A5 74 1,1@4DA @ 1,15517 @@ 1,1D404 55 1,114DA @ 1,D@170 1 1,@5A574 47 1,A44@D 0A 1,1D74 04 1,445744 @D 1,7 1,A5 1,41A55 1A 1,44A7D
54,47 115A,@D@5D 7AA,5D7A @10,1D@011 514@,5154D 44D,4@4AA A,570@@ 55,AD5 57,@@A05A 01,751 DD,0A@5 @@5,@7AD 5D,004547 40A,0D7@ 05,D1A04 14,454071 1,@550A 0@0,41 1AA4,DA0AD 1A4,D00@1 1DD0,1017 1DA,D50A@ 17D,DA74 1740,@A4@1 1@AA,70@A@A 1@@,01A@@
7 1,4@701 77 1,4A051A 15 1,51510@ D 1,55A574 47 1,557A7D7 1,5D010@ D 1,@014DA @ 1,@@5A5 74 1,@4A7D 7 1,@@DA7 D7 1,@D@170 1 1,70DA7 D7 1,7510@ D 1,7444@D 0A 1,7@14DA @ 1,7D01A1 4A 1,7ADA@1 7 1,D1740 4 1,D5744@ D1 1,D5A7D 7 1,D71DA 7A 1,DDDDA7 D7 1,A0@DA 7A 1,A510@ D
1@@,7701 15A,D10D5A 15@,57550A 15,DA1@@ 1504,711A1 147D,AA4D 145,AA4 14D,A00@47
1,A40744@ D1 1,A5717@ @ 1,A744@D0 D5 1,AA10@D ,00744@D 0A ,0DA7 D7 ,0A045 5 ,055744@ D1 ,071701 D
11A,5D4@ 11@,D5DA5 1115,A@5A 110,AD@A5 10A,7D541@ 10D,004@D 1071,0D15 10@1,1AD7 1051,0551
1405,7A574 1D,7570D 1@,7014 14,44DA 1,1115
Graica &: )n*l%encia de la tem!erat%ra sobre la actividad en"im#tica. Absorbancia s (iem!o.
en9ima a B@06 1 ensayo #5
104,@@5 1D@,011
1#5
a8sor8ancia
1@A,11DAD
!>%? F 0#0% G 0#75 /H F 0#AA
1 0#5 0
15,5@@@1
0 10 0 0 40 50 @0 70
tiempo
1@,550111 11,D701 10@,@0005 11A,11554 117D,1@A 11@4,D45@5 1151,D0777
Tabla ': in*l%encia del ! 4 sobre la en"ima.
Time
0 1,00 ,004 ,00@ 4,00D
#bs
0,11 0,11 0,11@ 0,11A 0,114
5,01 @,01 7,014 D,01@ A,01D 10,0 11,0 1,04 1,0@ 14,0D 15,0 1@,0 17,04 1D,0@ 1A,0D 0,04 1,04 ,044 ,04@ 4,04D 5,05 @,05 7,054 D,05@ A,05D 0,0@ 1,0@ ,0@4 ,0@@ 4,0@D 5,07 @,07 7,074 D,07@ A,07D 40,0D 41,0D 4,0D4 4,0D@ 44,0DD 45,0A 4@,0A 47,0A4
0,1145 0,1147 0,114D 0,114D 0,115 0,115 0,1151 0,115 0,115 0,115 0,1154 0,1155 0,115@ 0,1157 0,115D 0,1157 0,1157 0,1157 0,115@ 0,115@ 0,115@ 0,115@ 0,115@ 0,115@ 0,115@ 0,1155 0,1155 0,1155 0,1155 0,1154 0,1154 0,1154 0,115 0,115 0,1154 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115
4D,0A@ 4A,0AD 50,1 51,10 5,104 5,10@ 54,10D 55,11 5@,11 57,114 5D,11@ 5A,11D
0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115 0,115
Tabla (: datos de concentracin . velocidad de reaccin
concentra velocidad de ción reacción
0,11A14DA @ 0,1017 @@ 0,10D510 @4 0,11170 1 0,114DA @ 0,11D0D5 11 0,101 77 0,117@ @ 0,117@ @ 0,1404 @ 0,1404 @ 0,144@D 0A 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551
0 5AA,1D4@1 1D0A,147@@ 10A,D5@1 A0A,5150A7 7A,A7A @0D,DDD@05D 5,5A5@ 457,0@45A4 40@,AD744@ @@,DD@AA ,7ADD 05,77145A D,5055@ @,0DAD0
A1 0,17@5A 57 0,1D7 4 0,1A7D7 0,10D51 0@ 0,11A14 DA 0,10D51 0@ 0,10D51 0@ 0,10D51 0@ 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1A7D7 0,1D7 4 0,1D7 4 0,1D7 4 0,1D7 4 0,17@5A 57 0,17@5A 57 0,17@5A 57 0,1551 A1 0,1@5A5 74
45,041D1 A,A57D@7 1@,5DD1004 04,77A 1A4,14@D7 1D4,5A141 175,4D4DA@5 1@7,50D10 1@0,0D@D5@D 15,41@5711 147,7AA0D 141,@15A@4 1@,70D54 11,4AAA1D1 1@,A@54D 1,@70D@ 11D,@717D 114,A@DA4 111,47A1@A 10D,10@@A0
0,17@5A 57 0,1@5A5 74 0,1@5A5 74 0,1@5A5 74 0,1551 A1 0,1@5A5 74 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1@5A5 74 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1 0,1551 A1
A4,4@D5D17 A1,D1105D7 DA,5717@4@ D7,4A105@ D5,15@4A D,4@45ADD5 D1,5A04A5@ 7A,7@@4@15 7D,0@A077 7@,44D5DA@ 74,DDD00@ 7,D5144@ 71,A4@0 70,@DA1 @A,1@D4A @7,A4A07A7 @@,717@7D @5,545054 @4,7AD@ @,@055@A @,1A0D0051
105,017A77 10,1007@ AA,1@A114 A@,@41A7
Graica ": Absorbancia s tiem!o. 'atos de la in*l%encia del ! 4 sobre la en"ima %
tiempo vs a8sorvancia 0#1 0#1
!>%? F 0%I G 0% G 0#11
a8sor8ancia 0#11 /H F 0#@@ 0#11 0#11
0 10 0 0 40 50 @0 70
tiempo
Tabla !): in*l%encia del ! 1 sobre actividad de la en"ima%
Time
0 1,00 ,004 ,00@ 4,00D 5,01 @,01 7,014 D,01@ A,01D 10,0 11,0 1,04 1,0@ 14,0D 15,0 1@,0 17,04 1D,0@ 1A,0D 0,04 1,04 ,044 ,04@ 4,04D
#bs
0,D5 0,D5 0,D54 0,D5 0,D5 0,D4A 0,D4A 0,D47 0,D4@ 0,D44 0,D4 0,D4 0,D4 0,D41 0,D4 0,DA 0,D4 0,DA 0,DA 0,DD 0,DD 0,DD 0,D7 0,DD 0,D7
la
5,05 @,05 7,054 D,05@ A,05D 0,0@ 1,0@ ,0@4 ,0@@ 4,0@D 5,07 @,07 7,074 D,07@ A,07D 40,0D 41,0D 4,0D4 4,0D@ 44,0DD 45,0A 4@,0A 47,0A4 4D,0A@ 4A,0AD 50,1 51,10 5,104 5,10@ 54,10D 55,11 5@,11 57,114 5D,11@ 5A,11D Tabla !!: reacción.
0,D7 0,D@ 0,D@ 0,D5 0,D5 0,D4 0,D 0,D1 0,D 0,D1 0,D1 0,D1 0,D 0,D 0,DA 0,DA 0,DD 0,DD 0,DD 0,DD 0,D7 0,D7 0,D7 0,D@ 0,D5 0,D@ 0,D@ 0,D5 0,D@ 0,D4 0,D5 0,D 0,D4 0,D4 0,D Concentración
y
velocidad
concentra velocidad de ción reacción
0,D77@5A5 74
0
de
0,D77@5A5 74 0,D7D0D51 0@ 0,D77A7D7 0,D77@5A5 74 0,D77551 A1 0,D77551 A1 0,D77404 @ 0,D7740 4 0,D7701 77 0,D7@A14D A4 0,D7@D0D5 11 0,D7@D0D5 11 0,D7@701 D 0,D7@5A57 45 0,D7@4DA @ 0,D7@5A57 45 0,D7@4DA @ 0,D7@4DA @ 0,D7@DA 7A 0,D7@DA 7A 0,D7@DA 7A 0,D7@7@5 A@ 0,D7@DA 7A 0,D7@7@5 A@ 0,D7@7@5
@77,77 1144,AD@@ D7@,@70A @5@A,0D1A 554,D0A5 47A,007A4 75,5544 D,0@157 A17,5@A117 @5,4A@A D@,5DA 1D7,@45AD5 01A,10515 1D74,@7011 174A,47A7@4 1@40,@4A 154,@5D@15 1457,DAAD0 1D1,0005A7 111,A505@7 14A,47@7 11A,57555 1140,D@5D 10A,15A4@ 104A,404A
A@ 0,D7@170 1 0,D7@170 1 0,D7@0@D 0,D7@0@D 0,D75A574 47 0,D75744@ D1 0,D75@D AD 0,D75744@ D1 0,D75@D AD 0,D75@D AD 0,D75@D AD 0,D7551A 15 0,D7551A 15 0,D75455 0,D75455 0,D751A1 4A 0,D751A1 4A 0,D751A1 4A 0,D751A1 4A 0,D7517 @@ 0,D7517 @@ 0,D7517 @@ 0,D7510@ D 0,D75 0,D7510@
100D,A4775 A71,57A A@,7@@D51 A04,4@AAA4 D74,0A0DD D45,D045A D1A,75A5 7A4,5444 771,07AD@7D 74A,04A0144 7D,40A74 70D,477A4 @DA,DA747 @7,0@015 @55,5D@17 @A,1AA0D @,AD0005 @0A,4@DD40@ 5A5,@177@1 5D,1055@ 5@A,@51@11 557,51D@ 545,D4A7DAD 54,@44AA57 54,0157AD
D 0,D7510@ D 0,D75 0,D7510@ D 0,D74DA@ 17 0,D75 0,D747D7 4 0,D74DA@ 17 0,D74DA@ 17 0,D747D7 4
51,740A7D@ 50,D000A1 4A4,545@@ 4D5,0D1D45D 47@,00D71 4@7,700@17 45A,551 451,@7A54 44,A1AA7
Graica #: in*l%encia del ! 1 en la actividad de la en"ima.
tiempo vs a8sor8ancia 0#D 0#D 0#D !>%? F 0% G 0#D /H F 0#A5 0#D a8sor8ancia 0#D 0#D 0#D 0 10 0 0 40 50 @0 70
tiempo
Tabla !2: 'atos de la es!eci*icidad de la en"ima con (io%rea.
Time
#bs
0 1
0,@1A7 0,@1A 0,@1A7 0,@1
4 5 @ 7 D A 10 11 1 1 14 15 1@ 17 1D 1A 0 1 4 5 @ 7 D A 0 1 4 5 @ 7 D A 40 41 4 4 44 45 4@
0,@1 0,@4 0,@5 0,@ 0,@1 0,@ 0,@1 0,@ 0,@D 0,@A 0,@A 0,@7 0,@D 0,@1 0,@7 0,@D 0,@4 0,@4 0,@7 0,@ 0,@5 0,@5 0,@1A 0,@15 0,@0@ 0,@0@ 0,@0 0,@0 0,@0 0,@0 0,@01 0,@01 0,@ 0,@1AD 0,@1A7 0,@ 0,@04 0,@05 0,@11 0,@15 0,@1@ 0,@1 0,@0A
47 4D 4A 50 51 5 5 54 55 5@ 57 5D 5A
0,@1A7 0,@1D 0,@17@ 0,@17 0,@17 0,@17 0,@171 0,@17 0,@17 0,@1@D 0,@1@D 0,@1@@ 0,@1@@
Tabla !&: concentración reacción de la tio%rea.
y
velocidad
concentra velocidad de ción reacción
0,@5A55 1A 0,@5D74 04 0,@5A55 1A 0,@@0D510 @4 0,@@1D0D5 11 0,@@17@ @ 0,@@40 4 0,@@1A14D A4 0,@@1D0D5 11 0,@@1701 D 0,@@1D0D5 11 0,@@A7D7 0,@@@170 1 0,@@74 04
0 1A7@1,701 ADDD,DA7D7 @@0D,510@D 4A@,5@D A7,7@5A57 11,1701 D@,77D11@ 4D1,7D1A15 05,@775A 1AD5,455 1D0D,17A1 1@5A,0455 151,@@AA4
de
0,@@74 04 0,@@510@ D 0,@@551 A1 0,@@1D0D5 11 0,@@44@D 0A 0,@@@170 1 0,@@414DA @ 0,@@4045 5 0,@@510@ D 0,@@0D51 0@ 0,@@40 4 0,@@40 4 0,@@15A57 45 0,@@1170 1 0,@@017 @@ 0,@@017 @@ 0,@5A7D7 4 0,@5ADA@ 17 0,@5ADA@ 17 0,@5ADA@ 17 0,@5A@D0D 51 0,@5A@D0D 51 0,@5A5744 @D 0,@5A@17 0 0,@5A55
14,@44D 17,0177 14,D74 11@7,DA77 1104,07D014 1047,D1@4A AA@,404 A4D,@1DD A04,7D74 D@4,DA@17 D7,7A55 7A4,@D0D511 7@,7A7054 74,@5@A7 707,70D07 @D,A7D74 @5A,7D74 @D,@0@7@1 @1D,@50@@ 5AA,A0DD 5D,071A 5@5,4407A5 54A,@45A01 54,@175A@ 50,4@475@
1A 0,@5A5744 @D 0,@@ 0,@@010@ D 0,@@0744@ D1 0,@@1170 1 0,@@17@5 A@ 0,@@0@D AD 0,@@051A 15 0,@5A55 1A 0,@5744@D 0A 0,@5701 77 0,@5@5A57 45 0,@5@5A57 45 0,@5@701 D 0,@5@4DA @ 0,@5@DA 7A 0,@5@DA 7A 0,@5@170 1 0,@5@170 1 0,@55A574 47 0,@55A574 47
507,@4A755 4A5
tiempo vs a8sor8ancia 0#@ 0#@
4D,004@705 471,A@04D@ 4@1,D154D 450,D7040@
!>%? 0% G G 0#@ F F 0%I 0% G 0#@ a8sor8ancia 0#@ !>%? /H F 0#54 /H F 0#77 0#@ 0#@1
0 10 0 0 40 50 @0 70
tiempo
440,4551A *iscusión de los resultados
40,7D1@D@ 40,D01@75 410,A0455 40,57A44 A,A5744@D D@,7A1 7D,D@@@11 71,5A7751A @4,@57104 5D,0707A 51,51A75@D 45,574@ A,DD4@ ,57@D4D
ra!ica " 2s!eci*icidad de la en"ima con toi%rea.
En la tabla 1 . ( se encuentran los datos obtenidos en el espectro0otmetro # . los datos de concentracin . velocidad de reaccin obtenidos con la ecuacin de 7amber?Beer% Fara obtener la concentracin . la velocidad de reaccin 0ue necesario obtener el !oe0iciente de e=tincin molar del indicador 6o;o enol que se encontraba a una concentracin de ),(: M, el Epsilon obtenido 0ue de ),9G M ?1cm?1, con el cual se obtuvo la concentracin que se puede observar en la tabla (2 en las concentraciones obtenidas se puede observar claramente como a medida que pasa el tiempo la concentracin aumenta, esto es debido que las mol/culas de ro;o 0enol reaccionan con las mol/culas de amoniaco producidas por in0luencia de la enzima #reasa de la -arina de +o.a que acta como catalizador, el aumento en la concentracin indica que se produce la 0ormacin de producto . por lo tanto la coloracin de la disolucin es m"s intensa% !aso contrario ocurre con la velocidad de la reaccin pues como se ve en la tabla ( esta disminu.e a medida que pasa el tiempo, esto es debido a que cada vez 3a. menos mol/culas de sustrato con el que la enzima pueda 0ormar el intermediario +E &sustrato? enzima, que tiene una energía de activacin m"s ba;a', por lo que 3a. cada vez menos mol/culas que lleguen al estado de transicin, lo que 3ace que la velocidad disminu.a, .a que
esta es proporcional a las mol/culas en estado de transicin% 7as tabla G . < ;unto con la gra0ica (, nos muestran los datos . valores obtenidos en el e=perimento de la actividad enzim"tica de la enzima preparada de la -arina de so.a comercial, en ella se observa los mismos rasgos que anteriormente se e=plicaron, sin embargo se 3ace notar que en el tabla 1 . ( solo se tomaron 1) datos que proporcionaron una linealidad aceptable que nos permiti obtener un 6 ( mu. cercano a 1, en cambio en las tablas G . < si se tomaron todos los datos . el 6( obtenido pr"cticamente 1, esto signi0ica que en la e=periencia ( se presentaron menos errores que en la 1% 7a velocidad de reaccin por enzimas proporciona in0ormacin directa del mecanismo de reaccin catalítica . la especi0icad de la enzima% 7a velocidad de reaccin catalizada por una enzima se debe tener en cuenta las condiciones que esta se debe mantener, puesto si no se logra obtener las situaciones ideales est" no su0rir" ningn cambio% En la tabla H . , se recogieron los datos de la in0luencia de la temperatura sobre la actividad enzim"tica, en ellas se puede observar que al calentar la enzima a H)I! no a0ecta de manera seria a la actividad de la enzima, pues la enzima no se alcanza a desnaturalizar, sin embargo, al calentarla la enzima a una temperatura de 9)I! si se observa la inactividad de la enzima o como comnmente se conoce la enzima se desnaturalizo, pues la alta temperatura provoca el aumento en la vibracin de las mol/culas provocando la ruptura de enlaces, entre ellos los mas dediles como los de -idrogeno, este proceso al ser irreversible la enzima de;a de 0uncionar% En las tablas :,9,1) . 11 se encuentran los datos obtenidos de la in0luencia del p- sobre la actividad de la enzima en p- G . 1( &por duplicado', la ma.oría de las enzimas son mu. sensibles a cambios de p-, valores con pocas d/cimas por deba;o o por encima del p- optimo
pueden a0ectar dr"sticamente la actividad de la enzima, la ureasa tiene un p- optimo de , segn &!asanova et al, 199<' por lo que a p-% G . 1( no eran de esperarse una actividad considerablemente 0avorable a nivel industrial o de laboratorio% En las gra0icas previamente mencionadas &tablas :, 9,1) . 11' se ilustra los resultados que corroboran dic3a in0ormacin% 7os enzimas poseen grupos químicos ionizables &carbo=ilos ?!OO-2 amino ?A- (2 tiol ?+-2 imidazol, etc%' en las cadenas laterales de sus amino"cidos% +egn el p- del medio, estos grupos pueden tener carga el/ctrica positiva, negativa o neutra% !omo la con0ormacin de las proteínas depende, en parte, de sus cargas el/ctricas, 3abr" un p- en el cual la con0ormacin ser" la m"s adecuada para la actividad catalítica% Este es el llamado +, ó+timo segn &!asanova et al 199<'% Fara el caso de la ureasa esta tiene una carga negativa la cual en medio protonado &acido' estabiliza su carga . a medida que esta se estabiliza pierde su accin de catalizar . por ende la enzima se desnaturaliza% 7a gra0ica a p- G, ilustra como la activada enzim"tica es optima 3asta los () segundos &ubic"ndose el pico m"s alto en este punto', de allí empieza a decaer, revelando una desnaturalizacin de la enzima, la cual va in3ibiendo su actividad 3asta el segundo G), donde se observa su actividad en una mínima proporcin, posteriormente siguiendo una tendencia lineal constante indicando inactividad enzim"tica% Fara la actividad enzim"tica a p- 1( &gra0ica <' se observa una desnaturalizacin de la enzima desde el momento de la medida en el equipo de #?vis% Este comportamiento o 3ec3o se debe a la cantidad de iones Opresentes en el medio acuoso &p- alcalino', .a que estas enzimas son optimas a p- neutros &' . este medio es mu. alcalino el cual no es el adecuado para la ureasa% Fara la especi0idad &ver gra0ica H' se observa una actividad bien particular, .a que las
literaturas muestran otro tipo de tendencias en cuanto a esta variable, &gra0icas con 0ormas de arco'% En este punto la #reasa se encuentra en su p- ptimo &', temperatura ambiente . concentracin ),(:M condiciones apropiadas para una actividad enzim"tica normal para esta enzima, no obstante la gra0ica re0le;a una variacin donde la actividad enzim"tica sube, ba;a, se mantiene constante por unos segundos . vuelve a subir . a ba;ar, dando a entender que en ciclos de tiempo Ltraba;a . vuelve a descansar, dato opuesto al bibliogr"0ico% Este comportamiento se puede atribuir a errores aleatorios, a la 3ora de medir las cantidades de soluciones, contaminacin de la muestra problema, o de soluciones% +i bien la actividad enzim"tica depende de la temperatura, concentracin . p- . a0inidad, a las condiciones e=puestas de la enzima los resultados deberían ser de tendencia normal &parecidos a los de las biogra0ías'%
%onclusiones 7as enzimas son mol/culas de naturaleza proteínica producidas por los seres vivos, desempeñan un papel esencial en el metabolismo de todos los organismos, se encargan de acelerar reacciones químicas% 7o que signi0ica que a mayor velocidad de
reacción menor es la concentración de la en9ima#
es un para la de la en9ima,
Para una actividad optima en campo se podr"a modi$car la varia8le
temperatura, ya ;ue esta aumenta las colisiones entre en9ima sustrato permitiendo mas contacto y velocidad de reacción, el cual ser"a un caso !avora8le para sistemas ;ue re;uieran descomposición de reactivos espec"$cos>o8viamente sin descartar los riesgos ;ue pueda llevar esta acción, por !ormación de compuestos tó%icos o e%plosión al contacto con otros reactivos presentes en el sistema?# -eerencias
(urns, /#K# 1AD# 1A7A?# E modi$ed diacetyl mono%ime method !orm colorimetric determination o! urea in soil e%trac# 6ommunications in Soil Science and Plant Enalysis# Jol 10:1# Pag 1#1@1#170# <% 6erón, /#L#, +elgareo, +#L# 005# 1AA5?# Ectividad de la Ureasa en 1%
suelos de la 9ona central de chile# Egricultura .ecnica >6hile?# Jol 55:# Pag 15515D#
