Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica Curso práctico de Métodos de análisis Determinación de ribofaina por fuorometría !imón Martíne" #uis $ngel %po& '()* !ecc& + Introducción La ribofavina se conocía como vitamina B 2 y lactofavina. Su descubrimiento como uno de los componentes del grupo vitamina B se debe a su fuorescencia característica y su calidad de pigmento en alimentos tan comunes como la leche y la yema de huevo. El aislamiento y la caracterización de la enzima prote proteica ica amaril amarilla la origin originalm alment ente e de la levad levadura ura motiva motivaro ron n la reali realizac zación ión de estudios sobre el carácter esencial del pigmento favínico de la enzima en el metabolismo del ser humano el crecimiento y la salud. En solución alcalina es soluble con !acilidad pero es bastante inestable al calor y a la luz !orma lumifavina un producto de degradación fuorescente "ue carece de actividad biológica. La ribofavina es más estable al calor en solución ácida en particular de p# $ a %.& pero ante la irradiación !orma lumicr lumicromo omo "ue tambi' tambi'n n carece carece de activi activida dad d biológ biológica ica.. Las soluci solucione ones s de ribofa ribofavin vina a tiene tiene una fuore fuoresce scenci ncia a amaril amarillo lo verde verde carac caracter teríst ística ica con una absorción má(ima en &%& nm en el rango de p# ácido. Esta propiedad se aprovecha para la determinación "uímica de ribofavina. Se reduce con rapidez por hidrosul)to o por hidrogeno en presencia de cinc en solución ácida a la !orma leuco "ue es incolora y no fuorescente. *n gramo se disuelve en + ,,, a 2, ,,, mL de agua- las variaciones de solubi solubili lidad dad se deben deben a di!er di!erenc encias ias de la estruc estructura tura crista cristalin lina a intern interna a de la ribofavina es mas soluble en solución isotónica de cloruro de sodio o alcalina "ue en agua y es menos soluble soluble en alcohol. alcohol. Es insoluble en la mayoría mayoría de los solventes lípidos. Las determinac determinaciones iones "uímicas se basan basan en procedimi procedimientos entos colorim'tricos colorim'tricos y fuorom'tric fuorom'tricos. os. La determinac determinación ión directa directa del color amarilla intrínseco intrínseco de la ribofavina suele ser su)ciente para el análisis de preparados !armac'uticos. El m'todo fuorom'trico es más sensible y esta libre de inter!erencias y por lo tanto es más adecuado para el análisis de la vitamina en alimentos. /epende de la e(tracción de la vitamina con ácido diluido )ltración tratamiento de )ltrado con permanganato y peró(ido de hidrogeno para destruir pigmentos "ue inter)eren y determinación de la fuorescencia. Los estudios tambi'n se pueden pueden e!ectu e!ectuar ar por por croma cromatog togra! ra!ía ía li"uid li"uida a de alta alta presi presión ón y un detect detector or fuorom'trico.
,b-etio
0onocer el mane1o de un fuorómetro de )ltros /eterminar el e!ecto del p# del disolvente sobre la intensidad de fuorescencia
.esultados abla abla $.3 4esultados 4esultados de la curva d de e calibración de ribofavina ribofavina en di!erentes medios 5ntensidad de fuorescencia en 4ibofavina 6ppm7 #28 #0l ,.$ 9 :a8# ,.$ 9 , ;.<2 ;.=< ;.=% $ ., &.<< &.,+ ;.== 2 ., %.=& &.$> ;.=< + ., >.%> &.+, ;.=< ; ., =.%2 &.;$ ;.=< & ., <.$> &.&2 ;.<, <.& < =.& = #28 Linea>.& r 6#287 > Intensidad de fuorescencia %.& % &.& Linear 6#0l ,.$ 97 :a8# ,&.$ 9 ;.& , $
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.ibofaina /ppm0 ?ra)ca $.3 0urva de calibración de la ribofavina en di!erentes medios
Preguntas adicionales $.3@Aor "u' se deben conocer las longitudes de onda de má(ima e(citación y de má(ima emisión Al ser estimulados con fotones fotones de una determinada longitud longitud de onda, denominada de de absorción o excitación, emiten otro fotón de mayor longitud longitud de onda, es decir con menor energía. El uorocromo prototipo prototipo es la uoresceína que al ser estimulada con luz azul (abs.máx. a !" nm# emite luz $erde (emisión máxima a "%& nm#. 'anto la excitación como la emisión no son exactas a esa longitud deonda aunque la excitación de la uoresceína sea máxima a !" nm, tambi)n es
posible estimular (menos e*cazmente# e*cazmente# con +& o con con "& nm, puesto que en realidad la longitud de onda de excitación es una campana de -aus s (espectro de absorción#. iempre que se /able de excitación y emisión de un uorocromo se entiende que se está /ablando de los $alores máximos. 2.3 /iga cuales son las !ormas coenzimaticas de la ribofavina y cuál es su papel en el metabolismo celular 0la$ín adenín dinucleótido inter$iene en las reacciones metabólicas de oxidación1reducción 0la$in mononucleótido (023#, oriboa$ina1"41 fosfato act5a como coenzima coenzima de di$ersas oxidoreductasas. Es un agente oxidante más fuerte que el 3A67 y es particularmente 5til que puede tranferir uno o dos electrones
ya
Discusión de resultados El fuorómetro de )ltros "ue utilizamos mane1a dos monocromadores "ue son )ltro )ltros s "ue son utilizad utilizados os para aislar aislar la luz incide incidente nte y la luz fuore fuoresce scente nte seleccionar dos di!erentes tipos de longitudes de onda. Los )ltros utilizados !ueron para la e(citación !ue de ;2& nm y para la emisión &;, nm como se conoce el de emisión es más grande "ue el de e(citación esto es debido a procesos de rela1ación no radiante. La ribo ribofa favi vina na es una una vita vitami mina na hidr hidros osol olub uble le "ue "ue como como se obse observ rvo o en las las di!erentes soluciones se disolvió más rápido en el hidró(ido hidró(ido pero como se sabe es inestable en soluciones álcalis así "ue se puede suponer "ue perdió sus propiedades y la solución !ue más rápida por esto y se ve directamente en los resultados obtenidos con :a8# "ue como se ve no hay mucha cantidad de ribofa ribofavin vina. a. La ribofa ribofavina vina es resis resisten tente te a los ácidos ácidos !uerte !uertes s pero pero como como se observo en la solución de #0l está tambi'n perdió su fuorescencia como se ve en los resultados obtenidos en la tabla $. El comportamiento "ue tuvo con respecto a los otros disolventes se ve muy claro solo "ue a la hora de disolver !ue !ue un proc proced edim imie ient nto o muy muy tar tardado dado aun" aun"ue ue se trat trate e de una una mol' mol'cu cula la hid hidrosol osolub ublle como como se observ serva a en la tabl tabla a $ los resul esulta tad dos de las las concentraciones !ueron muy buenos y se obtiene una curva tipo con me1ores características "ue con los disolventes anteriormente usados. Se puede decir "ue la ribofavina es muy inestable a di!erente p# debido a "ue cuando se tiene en agua su fuorescencia es la esperada y sin en cambio con los otros disolventes un ácido y un álcali a pesar de tener la misma concentración en toda todas s las las solu soluci cion ones es las las lect lectur uras as !uer !ueron on dist distin inta tas. s. En el álca álcali li pier pierde de comple completam tament ente e su fuores fuorescen cencia cia por"ue por"ue las lectur lecturas as son muy simila similares res al blanco y con el acido se va incrementando la fuorescencia con!orme aumenta la concentración pero como se observa en la gra)ca $ es mucho menor "ue cuando está en presencia de agua destilada. En agua destilada se observa una curva curva tipo tipo caract caracterí erísti stica ca donde donde aument aumenta a la concen concentra tració ción n de ribofa ribofavin vina a aumenta la intensidad de fuorescencia.
Conclusión
La ribofavina es inestable a p# ácido y álcali mantiene su fuorescencia a p# neutro 6agua destilada7
Bibliogra1ía Cl!onso 4. ?ennaro D4emington D 4emington armacia Folumen 2G 2,H edición. Editorial Aanamericana S. C. 9e(ico 2,,+ pág 2$>,32$>$ Cdela 9auri Cuce1o 9aría Ios' Llobat Estell's 4osa #erráez #ernández. DLaboratorio de análisis instrumentalG Editorial A*F E 4. *niversidad de Falencia 2,$,. Aág >,3>&
