PEWARNAAN ALIZARIN RED
Oleh: Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten
: Rosi Nurbaeti Putri : B1A016017 : III :4 : Risa Umami
LAPORAN PRAKTIKUM PERKEMBANGAN HEWAN
KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2017
I. PENDAHULUAN A. Tujuan
Tujuan praktikum alizarin red adalah dapat mengerjakan prosedur pewarnaan alizarin dan menerangkan proses kalsifikasi tulang pada embrio. B. Manfaat
Manfaat praktikum alizarin red adalah dapat mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio, dapat
memahami manfaat dari berbagai larutan yang di
gunakan pada pewarnaan alizarin red, dapat mengetahui jenis tulang yang telah dan belum mengalami kalsifikasi.
II. MATERI DAN METODE A. Materi
Alat-alat yang digunakan pada acara praktikum pewarnaan alizarin red adalah botol sampel, kertas label, tissue, spuit injeksi tanpa jarum, kamera dan pipet tetes. Bahan yang digunakan pada acara praktikum praktikum pewarnaan alizarin red adalah embrio ikan nilem larutan NaCl fisiologis larutan alkohol 96%, akuades, KOH 1%, KOH 2%, larutan pewarna alizarin red , dan larutan penjernih A, B, C B. Metode
Metode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah: 1. ikan nilem dilumpuhkan dengan es batu 2. ikan direndam akuades 10 menit 3. ikan difiksasi dengan alkohol 96% selama 12 jam. 4. Kemudian diganti dengan akuades (selama 10 menit). 5. Setelah itu diganti dengan KOH 1% (selama 12 jam). 6. Kemudian diganti lagi dengan Pewarna alizarin red (selama 6 jam). 7. Terakhir dipindahkan ke dalam larutan penjernih A, B dan C masing-masing selama 15 menit. 8. Larutan penjernih C hingga hari pengamatan 9. Amati hasil.
I.
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
(G)
(G)
(H)
Keterangan:
a. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan akuades b. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan alkohol c. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan akuades d. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan KOH 1% e. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan alizarin red f. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan larutan penjernih A g. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan larutan penjernih B h. Foto ikan Nilem (Osteochilus vittatus) setelah dimasukkan larutan penjernih C
Tabel 1.Pengamatan Kelompok 4 Proses Pewarnaan Tulang Larutan Waktu Kondisi Preparat
No 1.
Akuades
2.
Alkohol
3.
Akuades
4.
KOH 1 %
5.
13.30-13.40 13.40-05.40 05.40-05.50 05.50-17.50
Alizarin red
- tidak terjadi perubahan - ikan mati - berwarna putih pucat - ikan berwarna pucat - sisik mulai mengelupas - daging mulai sobek - kulit dan daging mulai
17.50-23.20
mengelupas -tulang mulai terlihat
6.
Larutan penjernih A
7.
Larutan penjernih B
Larutan penjernih C
23.20-23.35
23.35-23.50
23.50-00.05
- tulang rangka sudah terlihat - warna insang terlihat agak merah -daging lembek dan tulang terlihat jelas
Tabel 2. Data Pengamatan Tulang Yang Terkalsifikasi
Kelompok 1 2 3
4
5
Tulang Yang Terkalsifikasi Tulang yang terwarnai : ruas tulang belakang, sirip punggung,tulang rusuk, sirip dada, tengkorak,sirip perut, sirip anal . Tulang yang terwarnai : rongga mata, sirip ekor, sirip perut, sirip belakang. Tulang yang terwarnai : tulang belakang, tulang rusuk, tengkorak (bagian atas), rongga insang dan rongga mata. Tulang yang terlihat : Tengkorak, sirip dada, tulang belakang, tulung rusuk, sirip punggung, sirip perut, ekor, rongga mata, urostyle. Tulang yang terwarnai : Rongga insang, articular, suspensorium, opercular series, pectoral fin, girdl, ribs. Tulang yang terwarnai : Tulang belakang, tulang tengkorak
B. Pembahasan
Hasil yang didapatkan pada praktikum pewarnaan alizarin red pada ikan nilem (Osteochilus vittatus) pada rombongan 3 didapatkan data yaitu kelompok satu ruas tulang belakang, sirip punggung,tulang rusuk, sirip dada, tengkorak,sirip perut, sirip anal . sedangkan kelompok dua bagian tulang yang terwarnai rongga mata, sirip ekor, sirip perut, sirip belakang. Kelompok tiga bagian tulang yang terwarnai tulang belakang, tulang rusuk, tengkorak (bagian atas), rongga insang dan rongga mata. Kelompok empat paling banyak bagian tulang yang terwarnai diantaranya Rongga insang, articular, suspensorium, opercular series, pectoral fin, girdl, ribs, seangkan Tulang yang terlihat diantaranya Tengkorak, sirip dada, tulang belakang, tulung rusuk, sirip punggung, sirip perut, ekor, rongga mata, urostyle. Tulang yang terwarnai pada kelompok lima adalah Tulang belakang, tulang tengkorak. Berdasarkan hasil tersebut di atas, dapat diketahui bahwa belum semua tulang dapat terwarnai oleh larutan Alizarin Red, hal ini dikarenakan proses kalsifikasi tulang terjadi pada waktunya masing-masing sehingga tidak terkalsifikasi secara bersamaan. Begitu pula dengan tulang dasar cranial dan seluruh tulang cranial menunjukan perubahan warna jika dilakukan pewarnaan Alizarin Red. Perubahan kenampakan warnanya berbeda – beda dari merah sampai merah tua tergantung pada pertumbuhannya (Anat, 1969). Menurut Cucikodana (2013), tulang merupakan jaringan vaskuler unik yang mengalami mineralisasi sebagai bagian dari proses perkembangannya. Mineral pada tulang memiliki peran penting terhadap fungsi tulang belakang, termasuk menyokong struktural, penyimpanan reversibel kalsium dan fosfor, dan tempat menyimpan kandungan logam dan karbon. Hasil pewarnaan alizarin red kelompok 4 tidak mengalami kehancuran yang fatal, tetapi hanya sebagian diarea dorsal terutama bagian ekor. Hal ini dimungkinkan beberapa faktor yang mempengaruhi keberhasilan pewarnaan alizarin atau faktor dari spesimen yang mungkin sudah tua dan sebagainya. Proses pewarnaan menggunakan Alizarin Red pada spesimen ikan beberapa kelompok mengalami perbedaan. Perbedaan dapat terjadi karena beberapa faktor, diantaranya adalah perbedaan umur ikan yang digunakan, perbedaan perlakuan saat menggunakan berbagai larutan, larutan Alizari Red yang sudah berumur, dan
kesalahan praktikan. Tetapi yang perlu digaris bawahi dalam menjawab perbedaan yang ada adalah dengan memahami konsep pewarnaan Alizarin Red itu sendiri. Menurut Ratih (2015) Teknik pewarnaan Alizarin Red berfungsi untuk mengetahui proses kalsifikasi atau osifikasi pada tulang. Tulang yang telah terkalsifikasi akan dapat diketahui setelah dilakukan pewarnaan menggunakan metode Alizarin Red . Interpretasi tulang yang telah mengalami kalsifikasi akan berwarna merah hingga merah tua. Kalsifikasi pada tulang dipengaruhi oleh usia perkembangannya. Mineral kalsium yang terdeposit pada tulang akan lebih banyak sebanding dengan usia pertumbuhan. Seperti yang disampaikan Anat (1969), bahwa Perubahan kenampakan warnanya berbeda – beda dari merah sampai merah tua tergantung pada pertumbuhannya. Perbedaan-perbedaan dalam perkembangan terjadi karena beberapa dari tulang-tulang embrio diendapkan dalam mesenkim yang belum terdiferensiasi. Sedangkan, pada bagian-bagian lain dari tubuh terjadi pembentukan tulang yang didahului oleh sistem tulang rawan penumpu yang sementara. Proses osifikasi kedua hal ini pada dasarnya sama (Djuhanda, 1983). Menurut Mahanthesha et al. (2009), senyawa alizarin berwarna oranyemerah memiliki rumus molekul C 14H8O4 dengan gugus hidroksil yang dalam praktik klinis digunakan untuk noda cairan sinovial untuk menilai kristal dasar kalsium fosfat dan alizarin ini akan menyoroti kalsium histokimia. Menurut Jasin (1989), pada pembentukan jaringan tulang baik tulang rawan maupun tulang keras terbentuk
endapan
garam-garam
kalsium,
sehingga
alizarin
red
akan
menyorotinya. Alizarin (1,2 dihydroxyanthraquinone), akan memancarkan sinyal merah di bawah sinar hijau neon, telah digunakan untuk pelabelan in vivo selama beberapa dekade. pewarnaan Vital ikan tulang dicapai dengan dua varian Alizarin, Alizarin S merah (ARS) dan alizarin complexone (ALC) (Besimon, 2016). Menurut Said (2011) Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan pewarnaan alizarin red antara lain kandungan mineral terlarut, kepekatan larutan alizarin red, dan ketepatan perlakuan pemberian larutan pendukung. Tulangtulang yang telah mengalami kalsifikasi akan berwarna merah tua. Menurut Soeminto (2000) tulang yang tidak terwarnai akan berwarna transparan. Tulang yang tidak terwarnai belum tentu tidak mengalami kalsifikasi, mungkin pada saat
diwarnai larutan belum terserap ke seluruh bagian, kandungan kalsium sedikit, sertaterlalu lama dalam perendaman larutan KOH 1% yang menyebabkan ikan menjadi hancur. Menurut Susanto (2016) fungsi KOH untuk mentransparansi lipid dan protein yang berada pada otot ikan sehingga ikan menjadi transparan.Proses terbentuknya warna pada tulang ikan disebabkan zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Komponen matriks eksternal utama yang berperan dalam proses pengerasan tulang adalah garam kalsium. Proses pengendapan garam kalsium terjadi secara berangsur-angsur.
IV. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan di atas, dapat disimpulkan bahwa : 1. Pewarna alizarin red digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi pada tulang. Prosesnya yaitu embrio ikan dibersihkan dalam larutan NaCl fisiologis, embrio direndam dalam alkohol 96% selama 12 jam, direndam akuades selama 10 menit, direndam di larutan KOH1% selama 3 jam, direndam larutan Alizarin Red dan KOH 2% kurang lebih 7 jam, lalu direndam di larutan penjernih A, B dan C, masing-masing selama 10 menit. 2. Proses kalsifikasi tulang adalah tahapan-tahapan pengerasan tulang melalui pengendapan garam-garam mineral kalsium. 3. Bagian-bagian tulang yang tulang yang terwarnai diantaranya Rongga insang, articular, suspensorium, opercular series, pectoral fin, girdl, ribs, seangkan Tulang yang terlihat diantaranya Tengkorak, sirip dada, tulang belakang, tulung rusuk, sirip punggung, sirip perut, ekor, rongga mata, urostyle B. Saran
Larutan yang digunakan lebih dispesifikkan kadarnya, supaya hasil yang didapatkan lebih maksimal dan wadah yang digunakan untuk tempat ikan sebaiknya lebih prorporsional lagi ketika proses pergantian larutan.
DAFTAR REFERENSI
Anat, J. 1969. The in Vivo Staining of Bone with Alizarin Red. Jakarta : Erlangga. Bensimon B. A , J. Cardeira, G. Dionísio1,4, A. Huysseune2, M. L. Cancela & P.E.Witten. 2016. Revisiting in vivo staining with alizarin red S - a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16(2) : 1-10 Cucikodana, Y. Agus, S. & Budi, P., 2013. Pengaruh Perbedaan Suhu Perebusan dan Konnsentrasi NaOH Terhadap Kualitas Bubuk Tulang Ikan Gabus (Channa striata). Jurnal Fistech. 1(1),pp. 1-7. Djuhanda, T. 1983. Embriologi Perbandingan. Bandung : Armico. Jasin, M. 1989. Sistematika Hewan (Invertebrata dan Vertebrata). Sinar Wijaya, Surabaya. Mahanthesha, K.R., Swamy B.E.K., Chandra, U., Bodke, Y.D., Pai, K.V.K., and Sherigara, B.S. 2009. Cyclic Voltammetric Investigations of Alizarin at Carbon Paste Electrode using Surfactants. International Journal of Electrochemical Science, 4: 1237 – 1247. Ratih, R. Ariyani, N. 2015. Produksi Mesenchymal Stem Cell (MSC) dari Sumsum Tulang Belakang Mencit. Jurnal Biotek Medisiana Indonesia. 4(1),pp. 33-41. Said . 2011. Perkembangan Hewan. Jakarta : Erlangga. Soeminto. 2002. Embriologi Vertebrata. UNSOED.
Purwokerto : Fakultas Biologi
Susanto, G. N. Fransisca. R. U., 2016. Struktur Skeleton Sirip Kaudal Kompleks Periophthalmus gracilis. Jurnal Biogenesis. 4(1),pp. 29-33.
