Terbentuknya warna transparan ini dikarenakan sel bakteri tidak mampu menyerap warna. ( Darkuni,2001). Pnemonia adalah proses infeksi akut yang mengenai jaringan paru-paru (alveoli). Pnemoniae yang disebabkan oleh Klebsiella pnemonia dapat berupa pnemoia komuniti (community acquired pnemonia). Klabsiella pnemoniae merupakan organisme opurtunis yang ditemukan pada lapisan mukosa mamalia, terutama paru-paru. Bakteri ini menimbulkan gejala berupa pendarahan dan penebalan lapisan mukosa organ (Dewi,2013). Kapsula bukan organ yang penting untuk kehidupan sel bakteri. Hal ini terbukti bahwa sel bakteri yang tidak dapat membentuk kapsula mampu tumbuh dengan normal dalam medium. Kapsula berfungsi dal am penyesuaian diri dengan lingkungannya. Misalnya berperan dalam mencegah terhadap kekeringan, mencegah atau menghambat terjadinya pencantelan bakteriofag, bersifat antifagosit sehingga kapsul memberikan sifat virulen bagi bakteri. Kapsula juga berfungsi untuk alat mencantelkan diri pada permukaan seperti yang dilakukan oleh Streptococcus muans (Darkuni, 2008). Jika bakteri tersebut kehilangan kapsulnya sama sekali maka ia akan dapat kehilangan virulensinya dan dengan demikian akan kehilangan kemampuannya untuk menyebabkan infeksi. Bakteri-bakteri berkapsula juga menyebabkan adanya gangguan seperti lendir dalam beberapa proses industri (Pelczar,2007). Pewarnaan kapsul dilakukan dengan pewarnaan asam dan pewarnaan basa.Kapsul dibentuk oleh organisme seperti Klebsiella pneumoniae. Kebanyakan kapsul terdiri dari polisakarida, namun ada juga yang terdiri dari polipeptida. Beberapa kapsul memiliki batas yang jelas dan ada yang tidak. Kapsul melindungi bakteri dari aksi fagositosis leukosit dan memungkinkan patogen untuk menyerang tubuh. Jika patogen kehilangan kemampuan untuk membentuk kapsul, dapat menjadi avirulen. Kapsul bakteri bersifat non-ionik, sehingga baik pewarnaan asam maupun basa tidak akan menempel pada permukaan mereka. Oleh karena itu, cara terbaik untuk memvisualisasikan mereka adalah dengan mewarnai latar belakang menggunakan zat asam dan
pewarnaan selnya dengan menggunakan zat warna basa. Untuk melakukan hal tersebut,digunakan tinta India dan Gram kristal violet. Ini meninggalkan kapsul (Smith,2010) Permukaan bakteri mengandung berbagai struktur yang mampu mengaktifkan pertahanan sendiri dan akibatnya merangsang respon imun inang. Kapsul bakteri adalah salah satu struktur eksternal yang ada pada permukaan bakteri yang tersusun atas gula dan atau protein., kapsul terlibat dalam berbagai proses biologis, seperti pencegahan pengeringan, ketahanan terhadap kekebalan inang spesifik dan spesifik (JM Tomás and S Merino,2010). Nigrosin dan tinta cina adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang dibuat dengan memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida. Industri utamanya adalah sebagai pewarna untuk lak, pernis, dan tinta penanda pena. Didalam biologi, nigrosin dan tinta cina digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri. Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi sebelumnya oleh panas atau alcohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat. Selain itu pewarnaan negatif dengan zat warna ini dapat mengungkapkan beberapa mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa (Dwidjoseputro.1998). Kapsul cukup tebal sehingga sulit diwarnai, oleh karena itu diperlukan suatu pewarnaan khusus. Salah satu cara pewa rnaan kapsula menurut Raebiger yaitu dengan menggunakan pewarna larutan formol-gentian violet Raebiger atau kristal violet. Satu lagi cara untuk perwarnaan kapsula bakteri adalah dengan pewarnaan negatif (pewarnaan tidak langsung ). Pada pewarnaan negatif latarbelakangnya diwarnai zat warna negatif sedangkan bakterinya diwarnai dengan zat warna basa. Kapsula tidak menyerap warna sehingga terlihat
lapisan
terang
berwarna (Waluyo, 2007).
yang
tembus
dengan
latar
belakang
yang
IV.
Alat dan Bahan 4.1. Alat 1.
Botol semprot
6. Korek
2. Bak pewarna
7. Mikroskop
3. Kaca preparat
8. Ose
4. Kapas
9. Spirtus
5. Kertas saring
4.2. Bahan 1. Alkohol 70% 2. Air suling 3. Emerge oil 4. Suspensi bakteri Klebsiela sp. 5. Tinta cina 6. Zat warna air fuksin V.
Prosedur 5.1. Pewarnaan Negatif Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Sediakan 2 kaca preparat dan direndam didalam larutan alcohol 70%, kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kapas. Lalu nyalakan spirtus dengan korek api dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah. Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi campuran suspensi bakteri ( Klebsiela sp.) dibuka didekat api dan suspensi bakteri diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan mulut tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di oleskan secara merata diujung salah satu kaca preparat dan satu tetes tinta cina (1:1) didekat ujung kanan kaca objek. Kemudian campurkan keduanya dengan menggunakan kaca preparat kedua sampai homogen. Setelah itu, letakkan kaca preparat kedua pada kaca preparat pertama dengan membentuk sudut
0
45
, lalu
tarik kaca preparat kedua sepanjang kaca preparat pertama dengan menyeretnya ke arah kiri. Kemudian biarkan kaca preparat tersebut mongering dengan sendirinya. Lalu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop.
5.2. Pewarnaan Burri-Gins Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Sediakan 2 kaca preparat dan direndam didalam larutan alcohol 70%, kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kapas. Lalu nyalakan spirtus dengan korek api dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah. Kemudian ose didinginkan di dekat api. Setelah itu, tabung reaksi yang berisi campuran suspensi bakteri ( Klebsiela sp.) dibuka didekat api dan suspensi bakteri diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan mulut tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di oleskan secara merata diujung salah satu kaca preparat dan satu tetes tinta cina (1:1) didekat ujung kanan kaca objek. Kemudian campurkan keduanya dengan menggunakan kaca preparat kedua sampai homogen. Setelah itu, letakkan kaca preparat kedua pada kaca preparat pertama dengan membentuk sudut
0
45
, lalu
tarik kaca preparat kedua sepanjang kaca preparat pertama dengan menyeretnya ke arah kiri. Kemudian fiksasi kaca preparat tersebut dengan melakukannya sebanyak 3 kali di atas api. Setelah itu, digenangi dengan pewarna air fuksin selama 5 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan menggunakan kertas saring. Setelah itu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop.
VI.
Data Pengamatan
Pewarnaan Negatif
VII.
Pewarnaan Burri-Gins
Pembahasan Pada praktikum kali ini praktikan melakukan praktikum pewarnaan negatif dan pewarnaan kapsul bakteri yaitu pewarnaan Burry-Gins. Tujuan dari praktikum ini adalah dapat mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna-pewarna sederhana dengan menggunakan prosedur pewarnaan negative, dapat mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul (pewarnaan Burri-Gins) dan dapat memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut. Adapun prinsip yang mendasari praktikum ini yaitu pewarnaan negatif, tolak menolak muatan, dan kapsul bakteri. Bakteri yang diamati pada pewarnaan negatif dan kapsul adalah bakteri Klebsiella pneumoniae, bakteri ini merupakan bakteri berbentuk batang. Menurut literatur bakteri Klebsiella pneumoniae merupakan salah satu bakteri gram negatif, bakteri yang non-motil (tidak melakukan pergerakan secara sel), merupakan bakteri fakultatif anaerob dan bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa. Klebsiella pneumoniae dapat menyebabkan pnemonia (Elfidasari, dewi, 2013). Pada dasarnya pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri, tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi gelap, zat warna tidak akan
mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga bakteri tampak transparan dengan latar belakang hitam. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka tidak terjadi penyusutan sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam dapat terjadi karena senyawa pewarnaan berwarna negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel bakteri. Oleh karena itu dinding sel menjadi tidak berwarna. Contoh pewarna yang biasa digunakan yaitu tinta cina, larutan nigrosin, asam pikrat dan eosin (Hadiotomo,1990). Pertama-tama, menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Sediakan 2 kaca preparat dan direndam didalam larutan alcohol 70%, kaca preparat dikeringkan dengan menggunakan kapas. Alkohol adalah antiseptik yang kuat. Alkohol dapat membunuh kuman dari jenis bakteri, jamur, protozoa dan virus. Alkohol membunuh kuman dengan cara menggumpalan protein dalam selnya (salma, 2011). Lalu nyalakan spirtus dengan korek api dan ose di fiksasi diatas api hingga kawat ose berubah menjadi merah. Kemudian ose didinginkan di dekat api. Ini bertujuan untuk membunuh bakteri yang menempel pada ose yang dapat mengganggu hasil pengamatan. Ose yang digunakan harus dingin sebab jika masih panas dapat menyebabkan pecahnya dinding sel bakteri sehingga bakteri sulit untuk diamati. Ose didinginkan tetap dekat dengan api untuk mencegah ose terkontaminasi dari udara (Pelczar, 2007). Setelah itu, tabung reaksi yang berisi campuran suspensi bakteri ( Klebsiela sp.) dibuka didekat api dan suspensi bakteri diambil dengan menggunakan ose. Kemudian penutup tabung dan mulut tabung difiksasi dan tabung ditutup kembali. Lalu olesan bakteri di oleskan secara merata diujung salah satu kaca preparat dan satu tetes tinta cina (1:1) didekat ujung kanan kaca objek. Kemudian campurkan keduanya dengan menggunakan kaca preparat
kedua sampai homogen. Ose yang digunakan haruslah steril, untuk mensterilkan ose digunakan fiksasi. Tinta cina berfungsi untuk mewarnai permukaan sel yang bermuatan negatif. Sehingga jika dilihat dari mikroskop akan terlihat bentuk bakteri dengan latar belakang berwarna gelap. Penambahan tinta cina tidak boleh terlalu banyak karena kaca preparat akan menjadi hitam dan akan menutupi bakteri tetapi tidak boleh juga te rlalu sedikit karena pewarnaan yang tidak merata menyulitkan dalam pengamatan bakteri (Waluyo, 2008). Setelah itu, letakkan kaca preparat kedua pada kaca preparat pertama dengan membentuk sudut
0
45
, lalu tarik kaca preparat kedua sepanjang kaca
preparat pertama dengan menyeretnya ke arah kiri. Kemudian biarkan kaca preparat tersebut mengering dengan sendirinya tanpa melakukan fiksasi. Hal ini dilakukan karena pada saat pengamatan bakteri yang diinginkan tetap utuh dan tidak berubah, jika melakukan fiksasi makan panas pada saat fiksasi akan menyebabkan bentuk sel dan ukurannya berubah dan tidak tetap (Hadiotomo, 1990). Lalu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop. Minyak emersi adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri
atau
Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100 misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air (Icuk, Sugianto, 2014). Hasil Pengamatan adalah bentuk bakteri Klebsiella pneumonia yaitu Basil transparan dengan latar belakang gelap. Hasil pengamatan yang diperoleh sesuai dengan literature yang ada bahwa bakteri Klebsiella pneumonia bersifat gram negatif, berbentuk batang pendek, fakultatif aerob, tidak mampu membuat spora, tidak bergerak dan mempunyai kapsul .
Pada pewarnaan kapsul, pengerjaannya tidak jauh berbeda dengan pewarnaan negatif. Perbedaannya hanyalah pada pewarnaan ini dilakukan fiksasi dan penambahan zat warna. Setelah olesan preparat diberikan tinta cina dan diratakan, kaca preparat kemudian difiksasi. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan meletakkan sel bakteri pada objek gelas tanpa merusak struktur selnya. Selain itu,tujuan fiksasi juga untuk melekatkan suspense bakteri,karena dalam pewarnaan kapsul akan diberikan pewarna tanding karbol fuksin untuk mewarnai sel bakteri. Fiksasi yang dilakukan cukup 3 kali di atas api, hal ini bertujuan agar kapsul bakteri yang diamati tidak pecah. Setelah dilakukannya fiksasi, diberi zat warna yaitu air fuksin pada kaca preparat. Zat warna diberi seperlunya saja karena bila berlebih justru dapat merusak preparat bakteri. Hal ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobakteria karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang ditemukan di dinding sel mikroba. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiotomo, 1990). Lalu zat warna dibiarkan selama 5 menit yang bertujuan agar zat warna dapat berpenetrasi secara optimal ke dalam dinding sel bakteri (Prescott, 2002). Setelah itu, zat warna yang berlebih dibuang dan dibilas dengan air suling, lalu dikeringkan dengan menggunakan kertas saring. Pembilasan harus dilakukan secara hati-hati karena pada saat pembilasan bakteri bias terbawa oleh air. Setelah itu ditetesi dengan sedikit minyak imersi pada kaca preparat. Kemudian preparat olesan bakteri diamati dibawah mikroskop. Minyak emersi adalah minyak yang dipakai untuk olesan pada mikroskop yang fungsinya untuk memperjelas objek dan melindungi mikroskop itu sendiri
atau
Imersi minyak merupakan teknik yang digunakan pada saat kita akan mengamati preparat mikroskopik dengan perbesaran yang besar (10x100
misalnya). Minyak imersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air atau udara sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas menggunakan minyak imersi dibandingkan menggunakan air (Icuk, Sugianto, 2014). Setelah diamati dibawah mikroskop. Hasil Pengamatan yaitu bakteri berbentuk batang,dengan warna badan sel bakteri adalah merah dan kapsul tampak bening disekitar badan bakteri. Tetapi, dalam praktikum kali ini praktikan tidak bisa menemukan bakteri sesuai literature. Hal ini disebabkan karena pada saat pencucian yang terlalu keras sehingga bakteri terbawa oleh air atau pada saat penotolan dengan kertas saring yang tidak hati-hati, pada saat fiksasi terlalu lama sehingga bakteri susah untuk diamati.
VIII.
Simpulan 1. Dapat mengamati morfologi bakteri yang sukar diwarnai oleh pewarna pewarna sederhana,dengan menggunakan prosedur pewarnaan negative. Suspensi Bakterinya
: Klebsiella pneumonia
Zat Warna
: Tinta Cina
Bentuk morfologi
: bacil
Warna sel
: Bening dengan latar hitam
2. Dapat mengamati kapsul bakteri dengan menggunakan prosedur pewarnaan kapsul ( Pewarnaan Burri-Gins). Suspensi Bakterinya
: Klebsiella pneumonia
Zat Warna
: Tinta Cina dan Karbol fuksin
Bentuk morfologi
: bacil
Warna sel
: Sel bakteri berwarna merah,kapsulnya
berwarana bening
dengan latar hitam
3. Dapat memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut
DAFTAR PUSTAKA
Darkuni, Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi dan Mikologi). Malang: UM Press. Dwidjoseputro. 1998. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Elfidasari, Dewi. 2013. Deteksi Bakteri Klebsiella pneumonia pada Beberapa Jenis Rokok Konsumsi Masyarakat. Available online at http://jurnal.uai.ac.id/index.php/SST/article/download/97/pdf_12 [diakses 23 Maret 2015 ) Hadiotomo, Sri Ratna. 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Jakarta : Gramedia. Icuk, Sugianto. 2014. Available online at http://brainly.co.id/tugas/56829 [diakses 23 Maret 2015] Prescott, H. K., 2002. Microbiology. New York : Mc Graw Hill. Pelczar ,M.J . 2007 . Dasar-Dasar Mikrobiologi . Jakarta : UI Press. Salma. 2011. Mengenal antiseptik. http://majalahkesehatan.com/mengenalantiseptik/ [diakses 23 Maret 2015] Smith, 2010. Capsule Stain. Available online at http://www.austincc.edu/microbugz/capsule_stain.php (diakses 23 Maret 2015). Susilo, Joko . 2013 . DETEKSI BAKTERI Klebsiella pneumoniae PADA SPUTUM DENGAN METODE IMUNOSITOKIMIA MENGGUNAKAN ANTI OUTER MEMBRANE PROTEIN BERAT MOLEKUL 40 KDA Klebsiella pneumoniae SEBAGAI ANTIBODI. Available online at jkb.ub.ac.id/index.php/jkb/article/download/233/225 [diakses 23 Maret 2015] Tomás, JM and S Merino . 2010 . Bacterial Capsules and Evasion of Immune Responses . Available online at http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0000957.html [diakses 23 Maret 2015]
Waluyo, Lud. 2008. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. Malang : Universitas Muhamadiah Malang. W, Pertiwi, Sartono TR, Sumarno, Adi S. J Respir Indones. 2009 . Sensitivitas dan Spesifisitas metode Dot Blot menggunakan Antigen Outer Membrane Protein Klebsiella pneumoniae yang Direspon Secretory-Immunoglobulin A Sputum Penderita Terinfeksi Klebsiella pneumoniae . Available online at http://jurnalrespirologi.org/sensitivitas-dan-spesifisitas-metode-dotblot-
menggunakan-antigen-outer-membrane-protein-klebsiella-
pneumoniae-yang-
direspon-secretory-immunoglobulin-a-sputum-
penderita-terinfeksi-klebsiella-pneumonia/ [diakses 23 Maret 2015]
