PEWARNAAN BAKTERI BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil, pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk mirip buah anggur). Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah. (Anonymous, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi mnjadi baik (Nobi, 2008) teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data apakah gram positif atau gram negative, sehingga diperlukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaanya. 1.2 Tujuan ·
Memperoleh keterampilan pewaranaan bakteri secara gram
·
Dapat menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008) Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu: 1. Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008) Macam-macam pewwarnaa 1.
Pewarnaan negative
Bakteri tidak diwarnai tapi mewarnai latar belakang Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarna seperti spirochaeta 2.
Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru methilen atau air fukhsin) Bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel. 3.
Pewarnaan differensial
Menggunakan lebih dari satu macam zat wrna Tujuan untuk membedakan antar baktericontoh pewrnaan gram, perwarnaan bakteri tahan asam. 4.
Pewarnaan khusus
5.
Untuk mewarnai struktur khusus / tertentu dari bakteri menjadi kapsul dan spora. Serta flagell.
Cara Pewarnaan Negative Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative. Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1984 untuk membedakan antara pneomokokus dan bakteriislebsiella pneumonia (fizahazny, 2008) Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap. Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tip bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Fizahazny, 2008) Pewarnaan sederhana Adalah pewarnaan yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnaanpewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang akan digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromatofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacammacam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll), dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990) Pewarnaan negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tapi mewarnai latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Cirri-ciri gram negative: ·
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
· Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt dalam lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat. ·
Kurag rentan terhadap senyawa penisilin.
·
Tidak resisten terhadap gangguan fisik
Ciri-ciri bakteri gram positif: ·
Struktur dindingnya tebal
·
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
·
Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
·
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
·
Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
·
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu a.
Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu
b.
Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan
c.
Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d.
Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk: Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia, 2002).
BAB III METODELOGI 3.1 Cara Kerja 3.1.1 alat
3.1.2 Bahan
·
Mikroskop
aquades sterl
·
Kaca benda
·
Mangkuk pewarna
Alkohol 70%
·
Kawat penyangga
Larutan iodin
·
Pipet
·
Pinset
Larutan Safranin
·
Lampu spirtus
Alkohol 95%
·
Botol penyemprot
biakan murni bakteri
Kristal violet
3.2 Cara Kerja a. Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewtkan diatas nyala api lampu spirtus b. Meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut c. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tekanan aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan. d. Mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu meletakkan diatas kaca benda sediaan sehingga membentuk sudut 450
e. Menggeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering. f. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spirtus dengan cepat. g. Meletakkan sediaan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu meneteskan Kristal violet diatas sediaan tersebut. Menunggu sampai 1 menit. h. Mmembuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran i. Meneteskan larutan iodine diats sediaan itu, lalu menunggu selama 2 menitdengan air kran. k. Membuang alcohol 95% diatas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit. l. Membuang sisa alcohol kedalam mangkuk dan membilas sedian dengan air kran. m. Meneteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu membiarkannya selama 30 detik. n. Membuang kelebihan larutan safranin kedalam mangkuk, lalu bilas dengan air kran. o. Mengeringkan sediaan itu secara hati-hati dengan kertas penghisap lalu periksalah dibawah mikroskop. Bila teknik pewarnaannya berhasil dengan baik, maka sel-selnya bakteri yang bersifat gram positif akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negative akan berwarna merah dan merah muda.
BAB IV PEMBAHASAN Pewarnaan bakteri untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri, dengan car mewarnai selsel mikroba dengan zat warna khususnya, yaitu warna Kristal violet pada pengecatan digunakan bakteri Bacillus aereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yamg berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat wwarna yang umumnya digunakan adalah bersifat alkalin (Anonymous. 2008) Pengamatn gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan bakteri garam positif atau bakteri gggram negate. Pada pengecatan ini digunakan 3 jenis bakteri, yaitu: Bacillus aerus, salmonella typii, dan Eschercia colli. Pengecatan ini menggumakan 4 jenis larutan, yaitu: Kristal violet sebagai catwarna, larutan iodin sebagi pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai zat penetup. Berdasarkan percobaan dapat Baccilus aerus, dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berartibakteri dapat mengikat dengan kuat cat warna ungu dari Kristal violet. Pada saat gram positif ditambahkan dengan kristel violet, maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel. Dengan pemberian larutan iodin mak Kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian alcohol menyebabkan pori-pori di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Pada praktikum yang telah dilakukan dapat juga
diidentifikasi bahwa bakteri berbentuk basil dan memiliki bidang pandang mikroskopis. Bakteri ini ditemukan pada perbesaran 40x10 (Anonymous, 2010)
KESIMPULAN · Pewarnaan bakteri digunakan untuk memperlihatkan atau mempelajari kontras antar sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertsjsm bentuk sel-sel mikroba. · Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan gram positif dan gram negative. ·
Pada pengecatan, digunakan 4 larutan, yaitu: Kristal violet, iodine, alcohol. Dan safranin
· Bakteri yang bersifat gram positif dapat mengikat dengan kuat ungu dari krostal violet, sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat warna ungu dari Kristal violet biasa akan berwarna merah atau merah muda setelah diamati pad mikoskop.
DAFTAR PUSTAKA Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga Suriawiria. 200 Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT. Garaemedia Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan Rizky.2008.http://ngecat bakteri makulrizki.blogspot.com/2008/02/materi kuliah html. Diakses tanggal 24 Nopember 2010 Fizahazny. 2008.http// wordpress.com/ Pengantar Temtamg Bakterihtml. Diakses tanggal 25 Nopember 2010 Anonymous. 2008.http//.id Wikipedia. Org/wiki.pewarnaan, gram. Anonymous: // makalh dan skripsi. Blogspot.com/2010/26 pewarnaan. Html pewarnann
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gramnegatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka. Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung. Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram. 1.2 Perumusan Masalah Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentukbentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut
BAB II TINJAUAN PUSTAKA Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008). Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora
Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP A zX005A4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008). Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Pewarnaan Bakteri Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan
air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri
3.2.2 Pewarnaan Endospora Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara
sempurna dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit) bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.
PENGECATAN MIKROBA : PENGECATAN SEDERHANA, GRAM dan SPORA
TUJUAN Bab ini dirancang untuk memberi pengetahuan dan ketrampilan mahasiswa dalam hal : 1. Dasar kimiawi dan teoritis pewarnaan biologis 2. Teknik preparasi smear 3. Pewarnaan sederhana dan differensiasi ( gram dan kapsul )
PENDAHULUAN Visualisasi mikroorganisme yang masih hidup tidaklah mudah, tidak hanya karena ukurannya yang sangat kecil tetapi karena transparan dan pada umumnya tidak berwarnajika disuspensikan dalam medium cair. Untuk mempelajari sifat mereka dan untuk mendiferensiasikan mikroorganisme dalam grup yang spesifik untuk kepentingan diagnostik, pewarnaan bologis dan prosedur pewarnaan dengan bantuan mikroskop cahaya menjadihal utama dalam mikrobiologi. Secara kimiawi, pewarna (cat) merupakan senyawa organik dengan cincin benzena dengan golongan kromofor atau auksokrom. Benzena : Larutan organik tidak berwarna Kromogen :
+ Senyawa berwarna bukan cat Pewarna Kromofor : Golongan senyawa kimia yang + mewarana pada bezena Auksokrom: Senyawa kimia yang membawa sifat ionisasi dari kromogen (mampu membentuk garam) dan berikatan dengan serat atau jaringan
Pewarna asam pikrat dapat digunakan untuk menggambarkan definisi ini :
Kemampuan suatu pewarna untuk mengikat komponen makromolekul seluler seperti protein atau asam nukleat bergantung pada muatan elektrik pada bagian kromofor yang sesuai dengan komponen seluler yang terwarna.
Cat asam merupakan anionik, berarti pada ionisasi pewarna bagian kromofor yang menunjukkan muatan negatif sehingga mempunyai afinitas yang kuat untuk unsur positif sel. Protein memberi
muatan positif pada kmponen sel, akan berikatan dengan dan menerima warna yang bermuatan negatif., anionik, kromogen dari suatu pewarna negatif. Secara struktur asam pikrat merupakan contoh dari suatu pewarna asam yang menghasilkan kromogen anionik.
Cat basa merupakan kationik, karena ionisasi bagian kromgen menunjukkan muatan positif sehinggga mempunyai afinitas yang kuat untuk unsur negatif sel. Asam nukleat bermuatan negatif, komponen seluler akan mengikatdan menerima warna yang bermuatan positif, kationik dari pewarna basa. Secara struktural, Metilen biru adalah suatu pewarna basa yang menghasilkan kromogen kationik. Berikut ini adalah ringkasan dari pewarna asam dan basa :
Asam Garam sodium, pottasium, kalsium, atau ammonium dari asam berwarna terionisasi memberi muatan negatif pada kromogen pewarna
Basa Garam klorida atau sulfat basa berwarna terionisasi memberi muatan positif pada kromogen
Terdapat sejumlah teknik pewarnaan untuk visualisasi, diferensiasi, dan pemisahan bakteri dalam hal karakteristik morfologis dan stuktur seluler. Ringkasan prosedur yang digunakan secra umum dan tujuannya digariskan dibawah ini :
Semua prosedur pewarnaan mikrobiologis membutuhkan preparasi smear sebelum perlakuan pada tiap teknik spesifik pewarnaan yang tercantum dibawah ini. Tekniknya meskipun sulit, memerlukan ketelitian yang cukup untuk preparasinya. Peraturan dasar berikut harus diikuti secra cermat. 1. Preparasi pada slide : Kebersihan merupakan hal yang penting untuk preparasi smear mikroba. Lemak atau minyak dari jari pada slide harus dihilangkan dengan memcuci slide dengan sabun dan air atau bubuk gosok, diikuti dengan bilasan air dan bilas dengan alkohol 95%. Slide harus dikeringkan dan disimpan pada laplaboratorium sampai siap digunakan. 2. Preparasi smear : hindari terlalu tebal, ketebalan smear sangat penting. Smear yang baik hanya sekali, jika sudah kering, akan nampak lapisan putih yang tipis. Untuk pembuatan dari kultur broth atau kultur medium padat memerlukan teknik yang berbeda. a. Kultur Broth (cair) : Satu tau dua loop suspensi sel langsung letakkan pada slide dengan loop inokulasi sterildan oleskan merata pada area tertentu kira-kira seukuran koin. b. Kultur dari medium padat : kultur organisme pada medium padat cukup tebal, ketebalan pertumbuhan ada dipermukaan dan dianjurkan tidak langsung dipindahkan ke slide. Kultur ini harus diencerkan terlebih dahulu dengan meletakkan satu loop penuh air pada slide dimana kemudian sel akan diemulsikan. Pindahkan sel dari kultur yang diingikan menggunakan jarum inokulasi steril. Hanya ujung jarum yang disentuhkan pada kultur untuk menghindari pemindahan terlalu banyak sel. Suspensi dilakukan dengan meratakan sel dengan gerakan sirkuler pada tetes air dengan ujung jarum. Terakhir smear harus berupa area seukuran koin logam dan nampak semitransparan, rata, dan putih tipis. Sebelum melanjutkan prosedur, smear harus kering sempurna. 3. Fiksasi Panas : Jika slide tidak difiksasi, smear bakteri akan tercuci selama prosedur pewarnaan. Hal tersebut dihindari dengan fiksasi panas, selama melakukan fiksasi protein bakteri terkoagulasi dan menempel pada permukaan slide. Fiksasi panas dilakukan dengan melewatkan secara cepat smear yang dikering-udarakan dua atau tiga kali pada api bunsen.
A. PEWARNAAN SEDERHANA Bahan 1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus ) 2. Zat pewarna basa: kristal violet 3. Alkohol 90 % Alat
1. Mikroskop cahaya 2. Bunsen 3. Jarum Ose 4. Kaca Obyek 5. Kaca Cover B. PEWARNAAN GRAM Bahan 1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus ) 2. Zat pewarna asam : kristal violet, lugol dan safranin 3. Alkohol 95 % 4. Minyak emersi 5. Air 6. Kertas penyerap Alat 1. Mikroskop cahaya 2. Bunsen 3. Jarum Ose 4. Kaca Obyek 5. Kaca Cover C. PEWARNAAN SPORA Bahan 1. Kultur murni bakteri ( E. Coli, Bacillus subtilis,Staphilococcus aureus ) 2. Zat pewarna: malakit green 3. Alkohol 95 % 4. Minyak emersi
5. Air 6. Kertas penyerap Alat 1. Mikroskop cahaya 2. Bunsen 3. Jarum Ose 4. Kaca Obyek 5. Kaca Cover
PEMBAHASAN Pada umumnya sel bakteri bersifat tembus cahaya, ini akan mempersulit untuk dilihat atau diteliti sekalipun dibawah mikroskop. Hal tersebut disebabkan karena banyak mikrobe yang tidak mempunyai zat warna, seperti pada umumnya didapatkan pada bakteri. Berbeda dengan mikroalga yang jelasmempunyai butir – butir atau serat – serat warna dalam selnya. Bakteri yang masih hidup tidak nampak jelas bentuk maupun sifat morfologinya. Mikroorganisme sangat sulit diamati dengan mikroskop cahay, karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Dengan alasan inilah yang meyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga mikroorganisme tersebut terlihat kontras dengan sekelilingnya. Dalam proses pewarnaan dilakukan juga proses fiksasi yang berguna agar mikroorganisme mati dan melekatkan mikroba pada obyek glass. Metode pewarnaan mikroba : Pewarnaan Sederhana yaitu dengan hanya menggunakan satu zat warna.digunakan untuk mengetahui bentuk sel bakteri : kokus, batang, basil, vibrio, spiral) serta morfologi dan susunan selnya. Pewarna yang biasa digunakan yaitu : metilen blue, safranin, karbolfuksin, kristal violet. Pewarnaan Gram yaitu pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokkan bakteri kedalam bakteri gram positif atau bakteri gram negatif. Pewarna yang digunakan yaitu - Gram A : sebagai pewarna utama.contohnya : kristal violet. Zat ini menyebabkan bateri gram positif atau negatif berwarna ungu.
- Gram B : sebagai mordant yaitu mengikat pewarna utama.zatnya yaitu iodine yang berwarna coklat. - Gram C : alkohol. Pada bakteri gram positif karena dinding selnya tebal maka bakteri mengalami dehidrasi sehingga pori – pori menciut yang menyebabkan zat warna utama tidak keluar. Pada bakteri gram negatif karena dinding selnya tipis, tidak mengalami dehidrasi sehingga pori – porinya membuka yang menyebabkan zat warna utama keluar. - Gram D : sebagai pewarna tandingan yaitu hanya bisa masuk jika pewarna utama hilang. Zatnya berwarna merah. Dari hasil pewarnaan gram diperoleh hasil : · Bakteri gram positif berwarna ungu · Baktri gram negatif berwarna merah Pewarnaan Spora Lapisan bagian luar spora merupakan lapisan penahan yang baik terhadap bahan kimia, sehingga spora sulit diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan cara dipanskan. Pemanasan dimaksudkan agar lapisan luar spora mengembang sehingga zat warna dapat masuk. Zat warna yang digunakan yaitu larutan hijau malakit dan larutan safranin. Dalam hal ini safranin bukan pewarna tandingan. Safranin mewarnai sel vegetatif dari bakteri. Sebaiknya dalam percobaan malakit green digunakan dalam jumlah yang cukup banyak. Bakteri Staphylococcus aureus Teknik pewarnaan sederhana Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan pewarnaan sederhana dengan zat warna safranin pada bakteri Staphylococcus aureus, diperoleh suatu bentuk morfologi dari bakteri tersebut antara lain sebagai berikut: - bentuk sel bakteri bulat - membentuk suatu koloni yang bentuknya seperti anggur - warna sel merah b. Teknik pewarnaan gram Setelah melalui teknik pewarnaan gram, bakteri Staphylococcus aureus berwarna ungu. Hal ini berarti bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram +, dimana dinding selnya tebal sehingga mampu mempertahankan warna ungu yang berasal dari pewarna kristal violet meskipun telah dilakukan dekolorisasi dengan alcohol 95%. Bakteri Basillus sp Teknik pewarnaan gram
Seperti halnya bakteri Staphylococcus aureus, bakteri Basillus sp menunjukkan hasil yang sama, yaitu bakteri berwarna ungu (gram +). Warna ungu tersebut berasal dari kristal violet yang tetap dipertahankan oleh sel bakteri Basillus sp meskipun telah didekororisasi dengan alcohol 95%. Selain itu, adapun factor yang menyebabkan warna ungu, yaitu kandungan lipid pada dinding sel Staphylococcus aureus sedikit, dimana setelah didekolorisasi,pori-pori selnya menyusut, sehingga mampu mempertahankan kristtal violet. Teknik pewarnaan spora Pada hasil pengamatan, setelah pewarnaan spora pada Basillus sp dengan zat pewarna malakit green terlihat adanya spora yang berada di bagian tengah sel dan berwarna hijau transparan. Bakteri E. coli Teknik pewarnaan sederhana Dari hasil pengamatan, setelah dilakukan pewarnaan sederhana dengan zat warna metilen blue pada bakteri E.coli, diperoleh suatu bentuk morfologi dari bakteri tersebut antara lain sebagai berikut: - bentuk sel bakteri batang - warna sel ungu b. Teknik pewarnaan gram Setelah melalui teknik pewarnaan gram, bakteri E. coli berwarna merah. Hal ini berarti bahwa bakteri ini termasuk bakteri gram -, dimana dinding selnya tipis dan sehingga tidak mampu mempertahankan warna ungu yang berasal dari pewarna kristal violet. Serta pori-pori sel membesar saat didekolorisasi dengan alcohol 95% karena mengandung banyak lipid pada dinding selnya. KESIMPULAN Teknik Pewarnaan Mikroba Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Differensial Untuk mengetahui Pemisahan Dalam kelompok Visualisai struktur morfologi bakteri Pewarnaan Gram Pewarnaan flagel Pewarnaan Tahan asam Pewarnaan Kapsul Pewarnaan Spora Pewarnaan Inti DAFTAR PUSTAKA 1.Waluyo,Lud.Drs.M.Kes.2004.Mikrobiologi Umum.Universitas Muhammadiyah Press : Malang.
2.Schlegel,H.G. dan Schmidt, K.1994. Mikrobiologi Umum. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta.
Dasar Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri) Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu) Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora
Pada prokariota umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Struktur bakteri yang paling penting adalah dinding sel. Bakteri dapat digolongkan menjadi dua kelompok yaitu :
1. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang terdiri atas lapisan peptidoglikan yang tebal dan asam teichoic.
2. Bakteri Gram negatif memiliki lapisan luar, lipopolisakarida - terdiri atas membran dan lapisan peptidoglikan yang tipis terletak pada periplasma (di antara lapisan luar dan membran sitoplasmik).
Pada bakteri patogen (pembawa penyakit) biasanya terdapat kapsul atau lapisan lendir yang membantu pelekatan bakteri pada suatu permukaan dan biofilm formation. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas dan magnetosom.
Berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:
• Kokus (Coccus) adalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mempunyai beberapa variasi sebagai berikut:
o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal
o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua
o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujursangkar
o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus
o Staphylococcus, jika bergerombol
o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai
• Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:
o Monobasil, jika hanya berbentuk satu batang
o Diplobacillus, jika bergandengan dua-dua
o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai
• Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut: o Vibrio, (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran
o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran
Gambar Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif
(Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini
hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Pewarnaan gram menghasilkan 2 (dua) kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah. Adanya gram positif dan gram negatif disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecetan, yaitu :
- Pengecetan negatif
- Pengecetan sederhana
- Pengecetan gram
- Pengecetan ziehl nielsen
- Pengecetan kapsul
- Pengecetan spora
- Pengecatan flagella
(Ani Murniati, 2000. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi)
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan- pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.
(Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)
Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.
III. Alat dan Bahan Alat :
Tabung reaksi steril Mikroskop Rak tabung reaksi Kaca objek Pinset Kertas lensa Ose bundar dan lurus Kertas tissue Pipet ukur 5 dan 10 ml Bunsen Papan pembentuk agar miring Inkubator 370 C
Bahan :
Suspensi bakteri ; s.aereus,p. aeruginosa, E.coli. Potasium telurite Media Mac Conkey Agar (MCA),Vogel Jonsen Agar (VJA),Cetrimide Agar (CA),Simmon sitrat,dan Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Biakan agar miring bakteri Pereaksi pewarna gram
Oli imersi Aqudest
IV. Prosedur kerja ISOLASI, IDENTIFIKASI,DAN KONFIRMASI MIKROBA
Pertama-tama buatlah media MCA,VJA,dan CA dalam bentuk plat agar,tetapi media Simmon sitrat dan TSIA dalam bentuk agar miring.Kemudian masing-masing media diberi warna sebelum diinokulasi dengan bakteri lalu catat dan dokumentasikan,lalu pada media MCA,VJA,CA,Simmon sitrat,dan TSIA diinokulasikan pada masing-masing suspensi bakteri pada suhu 370 C selama 1 minggu seluruh kultur bakteri di inkubasi pada incubator,lalu lakukan pengamatan setiap hari yang mencakup:
- Warna media : Sebelum diinokulasi dengan bakteri bandingkan dengan warna media
• Secara Keseluruhan
• Di sekitar/sekeliling koloni bakteri
• Pada agar miring TSIA: gambarkan bila ada perbedaan warna sesuai dengan posisi media (di dasar,tengah,dan permukaan tabung).
- Ukuran dan warna koloni bakteri
- Adanya endapan hitam atau retakan pada media
PEWARNAAN GRAM
Bersihkanlah kaca objek dengan alcohol hingga bebas dari lemak,kemudian diflambir dan diberi tanda nama bakteri pada bagian bawah kaca objek,lalu buatlah preparat dari biakan bakteri yang akan diwarnai dengan cara :
- Dengan meletakkan satu tetes suspensi bakteri pada kaca objek,sebarkanlah hingga setipis mungkin dengan membentuk lingkaran dengan diameter 1 cm.
- Di atas api bunsen (fikasi) hangatkan hingga sampai kering
- Warni preparat yang sudah siap
Diamkan lah selama satu menit setelah preparat ditetesi dengan Kristal violet,lalu buang lah sisa zat warna dan bilas dengan lugol lalu tutup preparat dengan lugol biarkan selama 30 detik,setelah itu buanglah lugol,tetesi preparat sedikit demi sedikit dengan menggunakna alcohol 96% hingga bilasan terakhir tetap jernih,kemudian warnai dengan zat warna fuchsin selama 30 detik tetapi sebelumnya preparat di cuci dengan aquadest,setelah 30 detik bilas kembali dengan aquadest biarkan hingga kering,dengan menggunakan mikroskop pembesaran lensa objektif 100x dengan memakai oli imersi dan amati yang ada dibawah mikroskop,hingga bentuk bakteri di dapat lalu catat warna dan susunanya.
V. Data Pengamatan
1.Staphlococcus aereus
Gambar bakteri Staphlococcus aereus yang telah diwarnai
Waktu pengamatan Warna bakteri/ perbesaran Bentuk bakteri / perbesaran 22-10-09 pukul 10.24 Bakteri berwarna ungu menggunakan perbesaran 100x Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan. Menggunakan perbesaran 100x.
2. Escherichia coli
Gambar bakteri Escherichia coli yang telah diwarnai
Waktu pengamatan Warna bakteri/perbesaran Bentuk bakteri/perbesaran 22-10-09 pukul 11.52 Bakteri berwarna merah keunguan hampir merah muda dengan menggunakan perbesaran 100x Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang dengan menggunakan perbesaran 100x
VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan teknik pewarnaan gram yang ditujukan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Yang menjadi bakteri sebagai bahan uji pada praktikum kali ini adalah Staphlococcus aereus dan Escherichia coli .
Pewarnaan gram ini menggunakan 4 macam pewarna dengan fungsi yang berbeda. Proses perwarnaan itu sendiri dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). sxxxxxxxxxxxxx Proses pewarnaan bakteri diawali dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit. pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri sehingga pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan,setelah itu ditetesi dengan lugol dan tetesi dengan
preparat dengan alkohol 96%, tetes demi tetes. Hal ini dimaksudkan karena alkohol dapat membuat bakteri tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x agar dapat mengamati bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah.
Sesuai dengan tujuan pewarnaan gram tersebut praktikan mendapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan antara kedua bakteri tersebut setelah diwarnai, yaitu pada:
- Kriteria Warna Staphlococcus aereus
Ketika warna bakteri menjadi ungu setelah diwarnai, bakteri mengindikasikan bahwa bakteri Escherichia coli termasuk ke dalam golongan gram positif karena berdasarkan literatur, bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol.
- Kriteria warna Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli setelah diwarnai menunjukkan warna keunguan yang hampir menyerupai merah muda. Berdasarkan literatur hal ini menandakan bahwa bakteri Escherichia coli merupakan bakteri dengan gram negatif karena gram negatif tidak mempertahankan zat warna metil ungu. Pewarna penimbal setelah diberikan metil ungu membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda.
Karakter warna yang berbeda ini terjadi karena terdapatnya perbedaan struktur dinding sel masingmasing bakteri dan responnya terhadap sifat asam-basanya. Karena pada dasarnya pewarnaan ini melibatkan adanya ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.Pewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Sementara
Pewarnaan basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat.
Selain digunakan untuk mengelompokkan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif , percobaan ini juga ditujukkan untuk mengamati morfologi, baik bentuk maupun susunan sel. Berdasarkan hasil pengamatan, didapat bahwa :
- Staphlococcus aereus
Berbentuk bulat-bulat (coccus) yang berkoloni membentuk kumpulan anggur tetapi tidak beraturan, sesuai dengan karakteritik Staphlococcus aereus berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentuk seperti buah buah anggur sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.
- Escherichia coli
Berbentuk lonjong panjang (bacillus) yang terbentuk dengan jumlah cukup banyak dan intens tetapi terpisah-pisah seperti rantai yang panjang, sesuai dengan karakteritik Escherichia coli berdasarkan literatur yang berkarakter sebagai bakteri yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif (kenneath, 2008) Koloninya tersusun seperti rantai memanjang sama seperti yang terlihat di kaca preparat dengan pembesaran 100x.
VII. Kesimpulan
- Jadi, untuk mengelompokkan bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dapat dilakukan dengan teknik pewarnaan yang disebut pewarnaan gram. Dengan pewarnaan gram bakteri dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Teknik pewarnaan gram berproses pada kemampuan sel yang menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi dengan alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi
karena tetap mengikat warna ungu kristal violet sehigga pada tahap akhir bakteri gram positif berwarna ungu seperti contohnya Staphlococcus aereus sedangkan bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol sehingga pada tahap akhir pewarnaan terwarnai menjadi kemerahan karena bakteri gram negatif tidak mempertahankan zat warna ungu kristal violet seperti contohnya Escherichia coli.
- Dengan pewarnaan gram ini juga dapat membedakan bentuk-bentuk bakteri. Ada yang berbentuk bola (coccus) dan ada juga yang berbentuk batang/ silinder (bacillus).
- Dalam teknik pewarnaan gram ini dilakukan dengan melalui:
1. Pewarnaan primer menggunakan kristal violet.
2. Pengikatan warna dengan cara didiamkan.
3. Pencucian warna menggukan air.
4. Pewarna pengganti menggunakan larutan lugol.
VIII. Daftar Pustaka
1. - Pelczar J. Michael dan e.s.c Chan, 2006, dasar-dasar mikrobiologi, UIP : Jakarta
2. -http://otetatsuya.wordpress.com/2008/12/24/efek-antibakteri-ekstrak-jahe-zingiber-officinaleroxb-dalam-menghambat- pertumbuhan-koloni-bakteri-escherichia-coli-dan-bacillus-subtilis/ , diakses pada tanggal 25 oktober 2009
3. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20090426032325AA0leMk, diakses pada tanggal 25 oktober 2009
4. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 25 oktober 2009
5. - http://makul-rizki.blogspot.com/2008/02/materi-kuliah.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009
6. - http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/, diakses pada tanggal 27 oktober 2009
7. - http://www.e-dukasi.net/mapok/mp_full.php?id=255&fname=materi02.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009
8. - http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pewarnaan.html, diakses pada tanggal 27 oktober 2009
9. - http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080909204931AAhr4TS, diakses pada tanggal 27 oktober 2009
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp[1].
Berdasarkan hal tersebut di atas, maka dilakukanlah praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara pengecatan sederhana, pengecatan negatif maupun pengecatan gram serta mengetahui morfologi mikroorganisme.
B. Tujuan Adapun tujuan yang ingin dicapai pada praktikum kali ini adalah untuk dapat membedakan antara bakteri gram positif (+) dan bakteri gram (-) melalui beberapa macam pengecatan.
[1]Fauziah, Pengecatan Mikroba, http://id.answers.yahoo.com/dir/?link=list&sid=396545227 (05 Desember 2009).
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana selsel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan[1]. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies[2]. Karakteristik taksonomi penting bakteri adalah reaksi mereka terhadap pewarnaan gram. Pewarnaan gram menjadi penting karena reaksi gram berhubungan dengan sifat morfologi lain dalam bentuk hubungan filogenik. Organisme yang berpotensi gram positif mungkin hanya dapat dilihat dengan pewarnaan gram pada kondisi lingkungan yang sesuai dan pada biakan muda. Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram
positif akantetap mengikat senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru[3]. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai[4]. Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina[5]. Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang khas dibentuk oleh spesies ini disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora, sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang membentuknya[6]. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi[7]. Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. 2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. 3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. 4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. 6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik[8].
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: 1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. 2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan ±terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. 3. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. 4. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. 5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. 6. Tidak resisten terhadap gangguan fisik[9].
*1+Filzahazny, “Teknik Pewarnaan Mikrobiologi,” Blog Filzahazy. http:/wordpress.com/ Pengantatentang-bakteri.htm (05 Desember 2009).
[2]Dwidjosoeputro, Dasar-Dasar Mikrobiologi (Malang : PT Djambatan, 1989), h. 159.
[3]Hadioetomo, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek (Jakarta : Pt Gramedia, 1990), h. 99. *4+Rizki, “Pengecatan Bakteri,” Blog Rizki. http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/ 2008/02/materi- kuliah.html (05 Desember 2009).
[5]Margareth F. Wheeler, Mikrobiologi Dasar (Jilid I ; Jakarta : Erlangga, 1998), h. 120. *6+Yulneriwanti, “Mikrobiologi Dasar,” Blog Yulneriwanti. http://01-bakteri.html (05 Desember 2009).
[7] Ibid.
[8]Natsir Djide, Analisis Mikrobiologi Farmas, (Makassar : Universitas Hasanuddin, 2008), h. 126. *9+Jimmo, “Pembuatan Preparat Dan Pengecatannya,” Blog Jimmo. http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht (05 Desember 2009).
BAB III METODE PRAKTIKUM
A. Waktu dan Tempat Adapun waktu dan tempat pelaksanaan praktikum kali ini adalah : Hari/Tanggal : Kamis, 03 Desember 2009 Pukul
: 15.00 – 17.00 Wita
Tempat
: Laboratorium Biologi Lantai III Gedung B Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar Samata, Gowa.
B. Alat dan Bahan 1. Alat Adapun alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah kaca preparat, mikroskop, deck glass, ose bulat, bunsen, spoit, botol semprot, rak tabung dan baskom. 2. Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan nigrosin, larutan methylen blue, crystal violet (gram A), larutan mordan lugol’s iodium (gram B), larutan alkohol aceton (gram C), larutan safranin (gram D), alkohol 70%, aquadest, tissue, biakan Escherichia coli, dan biakan Staphylococcus aureus. C. Cara Kerja Adapun cara kerja yang dilakukan pada praktikum kali ini adalah : 1. Pengecatan negatif a. Membersihkan kaca preparat dengan alcohol 70% agar bebas lemak b. Mengambil satu ose biakan Escherichia coli, dan biakan Staphylococcus aureus dan meletakkan pada masing-masing bagian tengah dari kaca preparat lalu meneteskan larutan nigrosin 1-2 tetes, kemudian mencampur hingga merata c. Dengan menggunakan kaca preparat lain, lalu menyentuhkan sisi ojek gelas tersebut pada sampel hingga membantuk sudut 45o. Selanjutnya menarik kaca preparat ke arah yang berlawanan hingga membentuk lapisan tipis d. Mengeringkannya, lalu mengamati di bawah mikroskop dan menggambar hasil pengamatan 2. Pengecatan sederhana a. Membersihkan kaca preparat dengan alkohol 70% agar bebas lemak b. Mengambil secara aseptis 1 ose biakan (Escherichia coli, dan Staphylococcus aureus) dan meratakan di atas kaca preparat c. Mengeringkannya lalu melakukan fiksasi di bunsen d. Menetesinya dengan larutan Methylen blue atau Kristal violet 1-2 tetes e. Membiarkannya selama 2 menit, lalu mencuci dengan air mengalir sampai sisa-sisa cat tercuci seluruhnya f. Mengeringkan di udara dan mengamati hasilnya di bawah mikroskop, lalu menggambar hasil pengamatan. 3. Pengecatan gram a. Membersihkan kaca preparat dengan alcohol 70% agar bebas lemak b. Mengambil secara aseptis 1 ose biakan Escherichia coli dan biakan Staphylococcus aureus dan meratakan di atas kaca preparat seluas 1 cm2 c. Membiarkannya mongering di udara, lalu melakukan fikasasi di atas bunsen d. Meneteskan larutan gram A sebanyak 2-3 tetes dan membiarkannya selama 2 menit
e. Mencuci dengan air mengalir, lalu mengeringkan dengan tissue secara hati-hati f. Meneteskan larutan gram B sebanyak 2-3 tetes dan membiarkannya selama 1-2 menit g. Mencuci dengan air mengalir dan mengeringkannya h. Meneteskan larutan gram C 2-3 tetes, dan membiarkannya selama 30 detik i. Mencuci dengan air mengalir dan mengeringkannya j. Meneteskan larutan gram D 2-3 tetes, dan membiarkannya selama 1 menit, lalu mencuci dengan air mengalir dan mengeringkannya k. Mengamatinya di bawah mikroskop dan menggambar hasil pengamatan yang diperoleh.
DAFTAR PUSTAKA
Dwidjosoeputro. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : PT Djambatan, 1989.
Filzahazny. “Teknik Pewarnaan Mikrobiologi.” Blog Filzahazy. http:/wordpress. com/Pengantatentang-bakteri.htm (05 Desember 2009).
Hadioetomo. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : PT Gramedia, 1990.
Jimmo. “Pembuatan Preparat Dan Pengecatannya,” Blog Jimmo. http ://Pembuatan PReParAT dan PengeCaTAnnyA _ BLoG KiTa.mht (05 Desember 2009).
Margareth F. Wheeler. Mikrobiologi Dasar. Jilid I; Jakarta : Erlangga, 1998.
Natsir Djide. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Makassar : Universitas Hasanuddin, 2008.
Rizki. “Pengecatan Bakteri,” Blog Rizki. http ://ngecat bakterimakul-rizki.blogspot.com/ 2008/02/materi- kuliah.html (05 Desember 2009).
Yulneriwanti. “Mikrobiologi Dasar.” Blog Yulneriwanti. http://01-bakteri.html (05 Desember 2009).
.1. Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air. Supaya bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipalajari maka tingkat sel kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan (Wahyuningsih, 2008).
Tujuan dari pewarnaan antara lain adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel mikroorganisme (khususnya bakteri), untuk memperjelas ukuran jasad, untuk dapat mengamati struktur luar dan dalam sel mikroba, dan untuk dapat melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan, sehingga sifat fisik dan kimia jasad dapat diketahui. Berhasil atau tidaknya pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang akan diwarnai (umur biakan paling baik adalah 24 jam) (Kawuri dkk., 2007).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam (Wahyuningsih, 2008).
Contoh zat warna yang sering digunakan adalah methylen blue, kristal violet, karbol fuhsin, dan lainlain (Kawuri dkk., 2007).
1.2. Tujuan
Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan dalam pewarnaan bakteri Untuk dapat mengidentifikasi perbedaan bakteri gram positif dengan gram negatif yang telah diisolasi dan dilakukan pewarnaan. Untuk dapat mengidentifikasi perbedaan bentuk bakteri gram positif dan gram negatif setelah dilakukan pewarnaan. II. MATERI DAN METODE
Dalam praktikum pewarnaan bakteri ini, dilakukan pewarnaan Gram terhadap bakteri E.Coli dan Staphylococcus aureus dengan cara menteteskan sebuah kaca objek yang bersih dengan air steril pada bagian tengahnya. Selanjutnya diambil sedikit biakan bakteri dengan menggunakan ose yang telah dipijarkan pada nyala api bunsen. Kemudian dibuat apusan pada air yang telah diteteskan pada kaca objek, sehingga terbentuk suspensi bakteri yang tipis dan merata. Lalu kaca objek tersebut difiksasi di atas nyala api bunsen hingga kering dengan jarak sekitar 30 cm dari nyala api. Dalam memfiksasi ini tidak boleh terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel bakteri. Setelah difiksasi, sediaan kemudian diwarnai menggunakan pewarna kristal violet selama 1-2 menit, lalu dicuci dengan air mengalir. Sediaan langsung ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama 1 menit. Setelah itu sediaan dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus, dan biarkan beberpa saat dan kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Berrikutnya diwarnai lagi dengan pewarna safranin dan didiamkan selama 1-5 menit. Untuk ketiga kalinya, sediaan dicuci lagi dengan air mengalir kemudian dikeringkan diatas nyala api bunsen. Sediaan lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 x, namun sebelumnya sediaan diberi minyak emersi. Setelah itu, sediaan dicatat dan digambar di atas lembar pengamatan.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
III.1 HASIL
Dari praktikum diperoleh hasil yaitu bakteri E. Coli merupakan bakteri gram negatif (berwarna merah) dan Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif (berwarna violet). Hasil selengkapnya terlampir.
III.2 PEMBAHASAN
Untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi, maka dilakukan pewarnaan terhadap bakteri tersebut. Bakteri yang akan diamati adalah bakteri E. Coli dan Staphylococcus aureus dengan metode pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan Gram. Bentuk bakteri dilihat di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x10.
Pada bakteri Escherichia coli terlihat bentuk basil (batang) dan berwarna merah sehingga bakteri ini termasuk bakteri Gram negatif. Warna merah yang terjadi merupakan hasil penghapusan warna
dasar (Kristal violet) oleh alkohol, sehingga bakteri akan menyerap pewarna safranin yang dipakai sebagai pewarna kontras (pembanding) (Kawuri, 2007). Selain itu, warna merah yang timbul pada Escherichia coli, terjadi karena bakteri tersebut memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis (1-3 nm) sehingga ikatan antara kristal violet-lugol dengan lapisan peptidoglikan lebih sedikit terjadi dan bakteri lebih dominan terwarnai oleh pewarna safranin yang berwarna merah (Alcamo, 1996). Pada pengamatan Escherichia coli ini terlihat juga bakteri dengan bentuk berbeda. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya kontaminan pada saat pemindahan biakan ke kaca objek, selain itu pengambilan biakan bakteri terlalu banyak juga mengakibatkan bakteri akan tertimbun sehingga pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas karena sediaan menjadi terlalu tebal dan dapat terjadi kemungkinan karena biakan bakteri belum murni.
Pada bakteri Staphylococcus aureus terlihat berbentuk bulat (coccus) yang membentuk rantai dengan warna violet, sehingga bakteri ini termasuk bakteri Gram positif. Hal ini disebabkan karena warnanya tidak terhapuskan oleh pencucian alkohol dan pemberian alkohol ini membuat dinding sel bakteri terdehidrasi, pori – pori mengkerut, serta daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga sehingga sel bakteri ini tidak menyerap warna safranin yang merupakan warna kontras (Kawuri dkk., 2007). Warna violet (ungu) ini timbul disebabkan karena bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat lebih banyak kompleks zat warna sehingga warnanya menjadi violet (ungu) (Alcamo, 1996). Begitu pula pada pengamatan Staphylococcus aureus ini terlihat juga bakteri dengan bentuk berbeda. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya kontaminan pada saat pemindahan biakan ke kaca objek, selain itu pengambilan biakan bakteri terlalu banyak juga mengakibatkan bakteri akan tertimbun sehingga pemeriksaan bentuknya satu per satu menjadi tidak jelas karena sediaan menjadi terlalu tebal dan dapat terjadi kemungkinan karena biakan bakteri belum murni.
Tercuci tidaknya warna dasar pada saat pewarnaan bakteri tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna dari bakteri tersebut. Dinding sel bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Selain itu, pemberian alkohol pada praktikum pewarnaan bakteri, menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Wahyuningsih, 2008).
IV. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari percobaan yang telah dilakukan adalah:
Beberapa jenis metode pewarnaan sel bakteri antara lain adalah pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Perbedaan antar bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram yaitu pada bakteri Gram positif jika diwarnai memiliki ciri-ciri berwarna ungu karena mengikat pewarna dasar dan tidak terhapus oleh alkohol serta tidak menyerap pewarna pembanding (pewarna kontras). Sedangkan bakteri Gram negaif jika diwarnai memiliki ciri-ciri berwarna merah karena tidak mengikat pewarna dasar dan terhapus oleh alkohol serta mengikat pewarna pembanding. Pada praktikum ini bakteri E.coli termasuk golongan bakteri Gram negatif sedangkan Staphylococcus aureus termasuk golongan bakteri Gram positif Perbedaan bentuk sel bakteri gram positif dengan gram negatif setelah dilakukan pewarnaan adalah basil pada bakteri E.coli sedangkan coccus (bulat) membentuk untaian rantai pada bakteri Straphylococcus aureus.
DAFTAR PUSTAKA
Alcamo, I.E. 1996. Fundamental of Microbiology, 5th Edition. Addison Wesly Longman, Inc: New York
Kawuri, R., Y. Ramona dan I. B. G. Darmayasa. 2007. Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Biologi F. MIPA UNUD : Bukit Jimbaran
Kawuri, R., Y. Ramona dan I. B. G. Darmayasa. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Biologi F. MIPA UNUD : Bukit Jimbaran
Wahyuningsih. 2008. Pengecatan Gram.
Available at : http://www.scribd.com/document_downloads/direct/8965686?extension= pdf&ft=1270647473<=1270651083&uahk=OpR3SnsA1MlcJHNHygtN1WfbhQE Opened at : 16 April 2011
