LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN SEDERHANA
Rabu, 4 Maret 2015 Kelompok II Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB
Nama
NPM
Iman Firmansyah
260110130044
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PADJADJARAN 2015
Nilai
TTD
PEWARNAAN SEDERHANA
I . Tujuan Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna. II. Prinsip 1. Teknik Aseptis Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur mikroorganisme yang diinginkan ( Siswaya, 2014 ). 2. Pewarnaan Sederhana Mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Zat warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau safranin ( Sutedjo, 1991 ). 3. Ikatan Ion Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna ( Volk & Wheeler, 1984 ). III. Teori Dasar Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di suspensikan. Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah di identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan. Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan (Dwidjoseputro, 2005).
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005). Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung, menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005). Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel - sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif) ( Pelczar, 2007 ). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifatsifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya ( Pelczar, 2007 ).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macamyaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial ( Pelczar, 2007 ). Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri ( Volk & Wheeler, 1984 ). Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna terdapatpada ion positif (zat pewarna+ Cl- ) dan pada pewarna asam, warna akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+ ). Hubungan antara bakteri dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion positif zat pewarna basa, Kristalviolet, safranin dan metilinblue adalah beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang berwarna ( Volk & Wheeler, 1984 ).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Waluyo, 2004). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif ( Hadiutomo, 1990 ). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994). Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (streptococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
IV. Alat dan Bahan 1. Alat : a. Bak Pewarna. b. Buku Gambar c. Cawan Petri d. Kaca Objek. e. Kapas. f. Kertas Saring. g. Korek api h. Mikroskop Majemuk. i. Ose. j. Pembakar Spirtus. k. Pensil warna Merah, Biru, Ungu l. Spidol 2. Bahan : a. Air Suling dalam Botol Semprot. b. Alkohol 70%. c. Desinfektan. d. Emersi Oil. e. Sampel Air Liur. f. Zat Warna Karbol Fuksin. g. Zat Warna Metilen Biru. 3. Gambar alat :
V . Prosedur Sampel air liur di letakkan kedalam cawan petri.Kaca objek di sterilisasi dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan, kemudian dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek disterilisasi, di lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit. Lingkari bagian bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan pembakar spirtus sampai ose berpijar. Ose didinginkan dengan cara didekatkan dengan pembakar spirtus.
Dibuat olesan bakteri dari air liur di atas kaca obyek yang bersih serta bebas lemak dengan menggunakan ose yang sudah di fiksasi. Setelah pengolesan, kaca objek di lewatkan di atas api pembakar spirtus sampai sampel di atas kaca objek berubah warna menjadi pucat (keputih – putihan). Kemudian letakkan kaca objek di atas bak warna, genangi olesan tersebut dengan salah satu warna (Metilen biru, Karbol fuksin). Biarkan olesan terwarnai selama 2 menit untuk metilen biru, 5 menit untuk karbol fuksin. Tuangkan zat warna berlebih dari preparat, lalu bilas dengan aquades sampai air bilasan berwarna pucat. Keringkan kaca objek dengan kertas saring. Teteskan sedikit emersi oil pada kaca objek, lalu periksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 40X dan 100X. Amati dan gambar hasilnya. VI. Data Pengamatan
No 1
Keterangan Sampel air liur dengan pewarna karbol fuksin pada pembesaran mikroskop 40X. Bakteri berbentuk coccus.
Hasil
2.
Sampel air liur dengan pewarna karbol fuksin pada pembesaran mikroskop 100X. Bakteri berbentuk coccus.
3.
Sampel air liur dengan pewarna metilen biru pada pembesaran mikroskop 100X. Bakteri berbentuk basil.
VII. Pembahasan Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen, sehingga tidak berwarna dan hampir tidak terlihat karena tidak kontras dengan media dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop. Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macan tipe morfologi bakteri seperti coccus, bacillus, dan sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya menggunakan satu macam zat warna saja.
Hal pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan cara di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang resisten dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi, kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan pengolesan bakteri kaca objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini pengolesan di lakukan dengan sampel air liur menggunakan pewarna karbol fuksin dan metilen biru. Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu sampel air lieur, setelah itu di fiksasi di atas api dengan cara di lewat – lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi dalam tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan untuk disimpan jika belum sempat dicat. Kaca objek yang sudah dioleskan bakteri kemudian di simpan di atas bak warna lalu di teteskan pewarna karbol fuksin dan diamkan selama 5 menit supaya warna menyerap masuk ke sel bakteri. Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Setelah 5 menit olesan bakteri yang telah terwarnai di bilas dengan aquades. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan.
Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas saring, tidak ditiup-tiup karena dikhawatirkan ada bakteri lain yang menempel pada objek glass. Kemudian olesan di tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air, sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop pada pembesaran 40X dan 100X. Dari hasil pengamatan mikroskop sampel air liur yang menggunakan pewarna karbol fuksin didapatkan morfologi bakteri berbentuk coccus (bulat). Kemudian percobaan selanjutnya menggunakan pewarna metilen biru, step – step yang digunakan sama seperti percobaan yang menggunakan pewarna karbol fuksin hanya yang berbeda dari segi pemberian warna. Metilen biru adalah pewarna yang biasa di pakai dalam pewarnaan umum. Biasanya hanya untuk membedakan sel bakteri dengan latar belakangnya. Metilen biru memberi warna biru cerah yang bisa bergradasi dari biru muda sampai biru agak tua seperti pada hasil pengamatan. Dari hasil pengamatan mikroskop sampel air liur yang menggunakan pewarna metilen biru di dapatkan morfologi bakteri berbentuk basil (batang). Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnanya. Pewarna karbol fuksin dan metilen biru termasuk kedalam pewarnaan basa. Pewarnaan asam yaitu pewarnaan yang menggunakan satu
macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk selnya saja. Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan terlihat. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna - pewarna sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Kromofor merupakan bagian yang berperan dalam memberikan warna. VIII. Simpulan Dapat mengamati ukuran, bentuk dan struktur – struktur tertentu dari bakteri, yang menggunakan satu macam zat warna dengan hasil morfologi bakteri berbentuk coccus yang menggunakan zat warna karbol fuksin dan bentuk basil yang menggunakan zat warna metilen biru.
DAFTAR PUSTAKA Dwidjoseputro, D.2005.Dasar - Dasar Mikrobiologi.Malang: Penerbit Djambatan. Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga. Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali. Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press. Siswaya,Yoanne.2014.Teknik Kultur Secara Aseptik. Tersedia online di http://www.academia.edu/6138539/Praktikum_2 [Diakses pada tanggal 8 Maret 2015] Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta. Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta : Erlangga Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.
