LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PEWARNAAN SEL BAKTERI
Oleh: Nama
: I Gede Dwija Bawa Temaja
Nim
: 0808505031
Kelompok
: II
Tanggal Praktikum : 5 April 2010 Asisten
: Ni Komang Sri Indrawati
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2010 I. PENDAHULUAN
1.1 Dasar Teori Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Ramona dkk, 2007). Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Ramona dkk, 2007). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Ramona dkk, 2007). Beberapa jenis pewarnaan antara lain adalah pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Pewarna basa akan mewarnai dinding sel bakeri yang relatif negatif, contohnya metiline blue dan kristal violet. Sedanglan pada pewarnaan tidak langsung, yang terwarnai adalah lingkungan sekitar sel, tetapi tidak mewarnai sel karena daya mewarnai pada zat ini berada pada ion negatif dan tidak bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri (Ramona dkk, 2007). 1.2 Tujuan 1. Untuk mengetahui tujuan pewarnaan sel bakteri. 2. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan dalam pewarnaan sel bakteri. 3. Untuk mengetahui bentuk sel bakteri hasil isolasi setelah dilakukan pewarnaan. 4. Untuk mengetahui perbedaan warna antara bakteri gram positif dan gram negatif.
II. MATERI DAN METODE
Dalam praktikum kali ini, bakteri yang digunakan dalam pewarnaan adalah isolat bakteri Streptococcus pyogene, E.coli, dan dari jenis Bacillus Pada pewarnaan secara langsung dengan pewarna basa, sebuah kaca objek bebas lemak ditetesi setetes air steril pada bagian tengahnya. Dengan mengguunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sedkit biakan yang telah diisolasi. Selanjutnya dibuat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada kaca objek dengan cara menggesek-gesekkan jarum ose yang berisi biakan bakteri sehingga didapatkan suatu campuran yang tipis dan merata. Difiksasi diatas nyala api Bunsen dengan jarak sekitar 30 cm dari nyala api. Dalam memfiksasi ini tidak boleh terlalu panas karena dapat merusak bentuk sel. Seteleh itu diteteskan metiline blue dan didiamkan selama 30-60 detik. Selanjutnya dicuci dengan air air mengalir dan dikeringkan dengan meletakkannya diatas kertas tissue. Sediaan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan diolesi minyak emersi terlebih dahulu yang bertujuan untuk memperjelas bentuk sel. Bentuk dan warna sel bakteri dicatat dan digambar. Pada pewarnaan secara tidak langsung, satu tetes tinta cina diteteskan pada pinggiran kaca objek. Lalu dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sedikit biakan bakteri dan disuspensikan pada tetesan tinta cina pada permukaan kaca objek. Suspense bakteri dalam tinta cina tersebut selanjutnya diratakan dengan menggunakan kaca objek lainnya dan dibiarkan kering pada suhu kamar. Setelah kering lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan memakai minya emersi. Bentuk dan warna sel bakteri dicatat serta digambar. Untuk pewarnaan gram, terlebih dahulu dibuat apusan bakteri pada kaca objek yang kering dan bersih. Kemudian difiksasi diatas nyala api Bunsen atau di udara barulah dilakukan pewarnaan dengan larutan kristal violet selama 1-1,5 menit. Selanjutnya dicuci dengan air suling dan ditetesi dengan larutan garam iodine, dibiarkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus yang biasanay selama 30 detik. Cuci kembali dengan air dan kemudian diwarnai dengan safranin atau karbol fuhsin selama 5 – 15 menit. Cuci lagi dengan air, kelebihan air dibuang dengan menggunakan kertas hisap tanpa menggosok sediaan. Selanjutnya dikeringkan di udara atau diatas nyala api Bunsen. Diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x memakai minyak emersi. Hasil pengamatan kemudian dicatat dan digambar.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Hasil Pengamatan
Klp
I
Bakteri
Bacillus
Pengamatan
Keterangan
P. tidak langsung
P. langsung
P. gram
100x10
100x10
100x10
•
•
II
Streptococcus pyogenes
40x10
100x10
40x10
•
• III
Bacillus
40x10
40x10
40x10
•
•
Bakteri bentuk batang Bakteri gram(-) Bakteri bentuk bulat berantai Bakteri gram(+) Bakteri bentuk batang Bakteri gram(+)
IV
Streptococcus pyogenes
100x10
100x10
100x10
•
• V
E. coli
40x10
40x10
40x10
•
•
Bakteri bentuk bulat berantai Bakteri gram(+) Bakteri bentuk batang Bakteri gram(-)
VI
E. coli
40x10
40x10
100x10
•
•
Bakteri bentuk batang Bakteri gram(-)
3.2 Pembahasan Pada praktikum pewarnaan bakteri kali ini, sampel yang digunakan adalah isolat Streptococcus pyogenes, E.coli, dan dari jenis Bacillus. Untuk pewarnaan bakteri secara langsung, digunakan satu larutan pewarna yaitu larutan metiline blue. Adapun hasil yang
didapatkan adalah bakteri Streptococcus pyogenes dengan pembesaran 100x10 berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai (streptococcus) dengan warna ungu violet, bakteri E.coli dengan pembesaran 40x10 berbentuk batang dengan warna ungu violet, dan bakteri jenis Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 berbentuk batang (basil) dengan warna ungu violet. Akan tetapi pada pengamatan Streptococcus pyogenes terlihat juga bakteri dengan bentuk berbeda yang merupakan kontaminan. Adanya kontaminan ini kemungkinan disebabkan pada saat pemindahan isolat ke kaca objek terjadi kontaminasi karena kurangnya pemanasan jarum ose pada saatpengambilan biakan sehingga masih ada bakteri lain dari udara yang ikut dalam apusan atau telah terkontaminasinya isolat bakteri yang digunakan. Adapun hasil dari pengamatan ini telah sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa bentuk bakteri Streptococcus pyogenes adalah berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai, bakteri E.coli berbentuk batang, dan bakteri dari jenis Bacillus berbentuk batang (basil) (Ramona dkk, 2007). Terwarnainya bakteri oleh pewarna basa disebabkan karena bakteri kaya akan asam amino dan mengandung muatan negatif seperti kelompok fosfat. Sifat ini bereaksi dengan zat warna yang bermuatan positif (Jawetz et al, 2005). Sitoplasma bakteri bakteri umumnya bermuatan negatif sementara pewarna memiliki muatan positif sehingga pewarna akan terikat oleh sitoplasma dan akhirnya sel menjadi terwarnai (Alcamo, 1996). Dalam pewarnaan bakteri ini dilakukan fiksasi yang bertujuan untuk memperkuat perlekatan warna dan bakteri pada kaca preparat (Pelczar, 2005). Fiksasi tidak boleh dilakukan terlalu lama sebab dapat mengakibatkan perubahan bentuk struktur bakteri yang diamati dari bentuk normalnya. Hal ini disebabkan karena semakin lamanya fiksasi, maka suhu yang dihasilkan dari fiksasi tersebut akan semakin tinggi sehingga bentuk bakteri akan mengalami lisisnya cairan dan menyebabkan bentuk yang diamati nantinya akan berbeda dari bentuk aslinya (Entjang, 2003). Pada pewarnaan tidak langsung digunakan suatu larutan pewarna yaitu nigrosin atau tinta cina. Dari hasil pengamatan didapatkan hasil pada bakteri Streptococcus pyogenes dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 terlihat berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai berwarna kuning coklat dengan warna lingkungan hitam atau gelap. Hal ini terjadi karena adanya minyak emersi yang ditambahkan, akan tetapi warna aslinya adalah bening. Pada bakteri E.coli dan Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 terlihat bernbentuk batang (basil) berwarna bening dengan warna lingkungan hitam atau gelap. Lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu
muatan negatif, maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo, 1996). Selain itu disebutkan juga pada pustaka bahwa bakteri merupakan organisme mikroselular yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin) yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan luarnya saja (Entjang, 2003). Pada pewarnaan gram didapatkan hasil bahwa bakteri Streptococcus pyogenes dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai dengan warna ungu. Warna ini menunjukkan bakteri Streptococcus pyogenes termasuk golongan bakteri gram positif. Hal ini disebabkan karena bakteri menyerap zat warna dasar yaitu kristal violet dan warnanya tidak terhapuskan oleh pencucian alkohol, sehingga sel bakteri ini tidak menyerap warna sfranin yang merupakan warna kontras (Ramona dkk, 2007). Warna violet (ungu) ini timbul karena bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat lebih banyak kompleks zat warna sehingga warnanya menjadi violet (ungu) (Alcamo, 1996).
Pada pengamatan bakteri E.coli
dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 didapatkan hasil bahwa bakteri ini berbentuk batang (basil) dengan warna merah muda. Warna ini menunjukkan bakteri E.coli termasuk golongan bakteri gram negatif. Hal ini disebabkan karena bakteri ini setelah diwarnai oleh pewarna dasar yaitu kristal violet menyerap warna dasar, setelah dicuci dengan alkohol maka warna dasarnya akan terhapus dan menyerap pewarna safranin atau karbol fushin yang digunakan sebagai pewarna kontras sehingga akan berwarna merah (Ramona dkk, 2007). Warna merah ini timbul karena bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga ikatan antara kristal violet-iodine dengan lapisan peptidoglikan lebih sedikit terjadi dan bakteri lebih dominan terwarnai oleh pewarna safranin yang berwarna merah (Alcamo, 1996). Pada pengamatan bakteri jenis Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 didapatkan hasil yang berbeda dimana terdapat Bacillus yang berbentuk batang dengan warna ungu dan Bacillus yang berbentuk batang dengan warna merah. Perbedaan hasil ini disebabkan karena kemungkinan pada saat pewarnaan dengan safranin terlalu banyak dilakukan penambahan safranin sehingga warnanya ikut terserap. Berdasarkan warna yang diperoleh menunjukkan bahwa dua bakteri jenis bacillus yang diamati merupakan golongan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bacillus yang termasuk golongan gram positif karena bakteri ini setelah diwarnai dengan pewarna dasar kristal violet dan
dicuci alkohol tetap berwarna ungu dan tidak menyerap pewarna kontras (Ramona dkk, 2007). Hal ini disebabkan karena bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat kompleks yang lebih banyak dan warnanya akan menjadi violet (Alcamo, 1996). Untuk hasil bacillus bakteri gram negatif terjadi karena penambahan safranin yang berlebihan sehingga warna safranin ikut terserap, karena menurut pustaka disebutkan bahwa bacillus merupakan golongan bakteri gram positif (Waluyo, 2004). Dalam pewarnaan gram dilakukan juga penambahan iodine yang merupakan proses fiksasi warna untuk mempertahankan struktur dalam dan luar sel tetap pada posisinya. Fiksasi juga berperan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat mengganggu bentuk sel dan menguatkan struktur mikroba. Mikroba umumnya dibunuh dan dilekatkan kuat pada kaca objek selama fiksasi (Prescott et al, 1993).
IV. KESIMPULAN 1. Tujuan dilakukan pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui.
2. Metode-metode yang dapat digunakan dalam pewarnaan sel bakteri adalah pewarnaan langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Tetapi dalam praktikum, tidak dilakukan metode pewarnaan endospora. 3. Bentuk bakteri hasil isolasi yang terlihat adalah coccus yang membentuk untaian rantai
(streptococcus) pada Streptococcus pyogenes, basil untuk bakteri E.coli dan bacillus 4. Bakteri gram positif mempunyai ciri berwarna ungu karena mengikat warna pada
pewarna dasar dan tidak terhapus oleh pencucian dengan alkohol serta tidak menyerap pewarna kontras sedangkan bakteri gram negatif mempunyai ciri berwarna merah karena menyerap pewarna dasar dan terhapuskan oleh pencucian dengan alkohol serta menyerap pewarna kontras. Pada praktikum ini bakteri Streptococcus pyogenes termasuk golongan bakteri gram positif, E.coli termasuk golongan bakteri gram negatif, dan bacillus termasuk golongan bakteri gram positif. DAFTAR PUSTAKA Alcamo, I.E. 1996. Fundamental of Microbiology, 5th Edition. Addison Wesly Longman, Inc: New York Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Citra Aditya Bakti. Bandung. Jawetz, E., J.L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Pelczar, M.J, E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta. Prescott, Lansing M., John P. Harley, Donald A. Klein. 1993. Microbiology 2nd Edition USA: WMC Brown Publisher. Ramona, Y., R. Kawuri, I.B.G. Darmayasa. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Program Studi Farmasi FMIPA UNUD. Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Udayana. Bukit Jimbaran. Waluyo. L.2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang
