PEWARNAAN PEWARNAAN ALIZARI ALIZARIN N RED
Oleh: Nama NIM Rom Romo! o!"a "a! ! $elompo% A&i&'e!
: Firli Dwi Aprilia : B1A015142 : #I :4 : A!!i&a A(lia
LAPORAN PRA$)I$*M PER$EMBAN+AN ,EWAN $EMEN)ERIAN RI-E). )E$NOLO+I. DAN PENDIDI$AN )IN++I *NI#ER-I)A- /ENDERAL -OEDIRMAN FA$*L)A- BIOLO+I P*RWO$ER)O 201
I PENDA,*L*AN A La'ar Bela%a!"
Alizarin red adalah satu metode mikroteknik untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai dengan alizarin Red akan berwarna merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang. Pembentukan Sistem rangka dimulai pada inkubasi hari ke 5 ditandai dengan kondensasi mesenkim prekartilago. ondrifikasi dimulai pada hari ke ! sedangkan osifikasi dimulai pada hari ke " #Soeminto$ %&&&'. (enurut Setyawati #%&))'$ tulang dapat dibentuk dengan dua cara$ yaitu melalui mineralisasi langsung pada matriks yang disekresi oleh osteoblast #osifikasi intra membranosa' atau melalui penimbunan matriks tulang pada matriks tulang rawan sebelumnya #osifikasi endokondral'. *aik osifikasi intra membranosa atau osifikasi endokondral$ +aringan tulang yang pertama kali dibentuk adalah +aringan primer atau muda. Tulang primer adalah +aringan yang bersifat sementara dan tidak lama kemudian diganti oleh +enis tulang berlamela yang tetap$ disebut tulang sekunder. (atriks tulang mengandung unsur,unsur yang sama seperti +aringan,+aringan penyambung lainnya$ serat,serat dan bahan dasar. Pengendapan matriks ini oleh osteoblast disebut osifikasi. Pengendapan garam,garam kalsium dalam matriks ini disebut kalsifikasi #pengapuran'$ suatu proses yang ter+adi normal pada tulang tetapi dapat ter+adi patologis dalam +aringan penyambung lain$ seperti tulang rawan dan dinding pembuluh darah. kalsifikasi belum ter+adi dalam matriks tulang$ daerah itu disebut osteoid #-atim$ )"!'. (ineralisasi tulang bergantung pada koneksi yang diatur secara ketat antara akti/itas sel dan lingkungan ekstraselular #*ensimon$ %&)0'. 1+uhanda #)"!)' menyataka bahwa proses pertumbuhan dan perkembangan +aringan tulang sangat tergantung pada mineralisasi mariks ekstra sel. omponen matriks ekstra sel utama yang berperan dalam proses pengerasan tulang adalah garam kalsium. Tulang rawan secara bertahap mengalami osifikasi bersamaan dengan itu proses pengendapan zat kapur pada tulang rawan ter+adi. lasifikasi tulang rawan ter+adi ditandai dengan terikatnya kalsium pada matriks tulang$ sehingga tulang men+adi keras. (ineralisasi matriks sel sangat mempengaruhi proses pertumbuhan dan perkembangan +aringan tulang terutama garam kalsium yaitu 2a karbonat.
matriks tulang mengandung unsur,unsur yang sama seperti +aringan,+aringan penyambung lainnya$ serat,serat dan bahan dasar. Proses pengendapan zat kapur oleh osteoblast disebut dengankalsifikasi #Pattern$ )"3)'.
B )((a!
Tu+uan praktikum kali ini adalah membekali mahasiswa agar dapat menger+akan prosedur pewarnaan Alizarin dan menerangkan proses kalsifikasi tulang pada embrio.
II MA)ERI DAN ME)ODE A Ma'eri
Alat,alat yang digunakan dalam praktikum Alizarin Red adalah alat bedah$ gelas arlo+i atau petridish$ tempat spesimen #ukuran sesuai dengan ukuran embrio'. *ahan,bahan yang digunakan dalam praktikum Alizarin Red adalah ikan nilem (Osteochilus vittatus), larutan alkohol "54$ larutan pewarna alizarin red$ larutan pen+ernih A$ * dan 2$ larutan 6 )4 dan %4$ larutan gliserin murni dan akuades. B Me'o3e
(etode yang dilakukan dalam praktikum ini adalah7 Pewarnaan menggunakan ikan nilem #Osteochilus vittatus' ).
8kan nilem berukuran sedang dimasukin ke dalam tempat yang sesuai dengan ukuran tubuhnya . kemudian diberi akuades selama )& menit . eadaan ikan diamati.
%.
Setelah )& menit $ larutan diganti dengan alkohol "54 selama )% +am. eadaan ikan diamati.
.
Setelah )% +am $ ikan di cuci dengan akuades. 9ungsi akuades untuk membilas. kemudian dimasukkan larutan 6 )4 selama 3 +am. eadaan ikan diamati.
:.
Setelah 3 +am $ larutan diganti menggunakan pewarna Alizarin Red dibiarkan selama % +am . eadaan ikan diamati.
5.
Setelah % +am $ larutan diganti menggunakan & ml 6 %4 . eadaan ikan diamati. emudian setelah % +am di ganti larutan 6 %4 sebanyak &ml biarkan selama )) +am #proporsional'. eadaan ikan dimaati.
0.
;arutan diganti menggunakan pen+ernih A * dan 2 masing,masing selama )5 menit. eadaan ikan diamati.
3.
8kan nilem diberi gliserin untuk diawetkan.
III ,A-IL DAN PEMBA,A-AN A ,a&il
1
2
6
4
5
7
8
10
eterangan
7
).
!.
)ael 1 Da'a Wa%'( Pemeria! Lar('a! 3a! $o!3i&i Prepara' Romo!"a! : #I $elompo%
= ) % : 5 0 3 ! " )&
>A( &".&! &".)3 %).%) %).) &:. &0. &!. )".) )".:0 %&.&)
:4
;AR?TA= Akuades Alkohol "54 Akuades 6 )4 Alizarin red
=18S8 PR@PARAT (asih segar Agak keputihanpucat *erwarna pucat *ersih dan segar Preparat terlcelup larutan$ ada sebagian
6 %4 6 %4
kecil terlihat *erwarna ungu gelap Sisik ikan ada yang rontok$ tubuh ikan
Pen+ernih A
masih berwarna ungu gelap Sisik sudah banyak yang rontok$ tubuh
Pen+ernih *
masih gelap. Tubuh masih berwarna gelap. Sirip
Pen+ernih 2
terwarnai Sirip ikan mulai rusak $ badan ikan mulai transparan
)ael 2 Da'a Pe!"ama'a! )(la!" 9a!" )er%al&ii%a&i Romo!"a! : #I $elompo%
= )
:4
@;(P )
T?;A=< -A=< T@RWAR=A8 Sirip punggung$ sirip ekor$
T?;A=< -A=< T@R;86AT Tulang rusuk
sirip perut$ sirip dada$ tengkorak$ operculum. %
%
Semua sirip terwarnai$ tulang
Tulang rusuk$ tulang
rongga insang #operculum'
belakang
Sirip dada$ sirip perut$ dan
Tulang belakang
operculum :
:
perculum$ tengkorak$ tulang mata $ semua sirip #sirip abdominal$ sirip dorsal$ sirip pectoral$ sirip caudal dan sirip anal' dan tulang belakang
Tulang rusuk .
B Pemaha&a!
*erdasarkan hasil praktikum pewarnaaan alizarin red pada ikan nilem #Osteochilus vittatus) didapatkan hasil dari kelompok kami #:' yaitu tulang yang terwarnai yaitu operculum$ tengkorak$ tulang mata$ semua sirip #sirip abdominal$ dorsal$ pectoral$ caudal dan anal' dan tulang belakang sedangkan tulang yang terlihat yaitu tulang rusuk. 6asil dari rombongan B8 untuk kelompok ) yaitu tulang yang terwarnai diantaranya sirip punggung$ sirip ekor$ sirip perut$ sirip dada$ tengkorak dan operculum sedangkan tulang yang terlihat adalah tulang rusuk. elompok % didapatkan hasil tulang yang terwarnai adalah semua sirip dan operculum sedangkan tulang yang terlihat adalah tulang rusuk dan tulang belakang. elompok tulang yang terwarnai yaitu sirip dada$ sirip perut dan operculum 6asil pengamatan yang diperoleh masing,masing kelompok memperoleh hasil yang berbeda,beda dan ada tulang yang tidak terwarnai $ menurut aryadi #%&&' hal ini dimungkinkan karena konsentrasi alizarin rednya terlalu rendah sehingga warna kurang meresap. emungkinan lainnya adalah kandungan kalsium dari tulang dan lamanya waktu perendaman alizarin red. Prosedur pertama yang dilakukan dalam praktikum alizarin red yaitu ikan dimasukkan ke dalam alkohol "54 selama )% +am tulang belum terlihat dan ikan berwarna pucat. 9ungsi dari larutan alkohol "54 adalah sebagai larutan fiksatif$ yaitu larutan yang berfungsi mematikan sel tanpa merubah struktur dari sel tersebut. ;arutan alkohol "54 selan+utnya disedot dengan spuit$ dan diganti dengan akuades
selama )& menit$ hasilnya ikan tampak agak segar $ maksudnya warna ikan tidak sepucat saat pertama dimasukan kedalam alkohol "54. ;arutan alkohol diganti dengan akuades selama )& menit$ hasilnya ikan kembali tampak pucat. Selan+utnya larutan diganti dengan 6 )4 selama % +am$ hasilnya tubuh ikan men+adi transparan dan sisik dorsal tampak terbelah . ;arutan pen+ernih A$ *$ 2 berfungsi untuk mengurangi kelebihan pewarna yang masuk ke dalam +aringan otot sehingga otot men+adi tampak bersih transparan ;arutan pen+ernih 2 dapat digunakan sebagai pengawet karena mengandung gliserin dalam +umlah banyak. ;arutan diganti dengan menggunakan gliserin murni yang berfungsi sebagai fiksatif atau pengawet sehingga ikan tidak akan hancur. #Sukra$ %&&&'. *erdasarkan hasil tersebut di atas$ dapat diketahui bahwa belum semua tulang dapat terwarnai oleh larutan Alizarin Red$ hal ini dikarenakan proses kalsifikasi tulang ter+adi pada waktunya masing,masing sehingga tidak terkalsifikasi secara bersamaan. *egitu pula dengan tulang dasar cranial dan seluruh tulang cranial menun+ukan perubahan warna +ika dilakukan pewarnaan Alizarin Red. Perubahan kenampakan warnanya berbedaCbeda dari merah sampai merah tua tergantung pada pertumbuhannya #Anat$ )"0"'. Perbedaan,perbedaan dalam perkembangan ter+adi karena beberapa dari tulang,tulang ikan diendapkan dalam mesenkim yang belum terdiferensiasi. Sedangkan$ pada bagian,bagian lain dari tubuh ter+adi pembentukan tulang yang didahului oleh sistem tulang rawan penumpu yang sementara #1+uhanda$ )"!'. Praktikum kali ini diperoleh hasil sesuai dengan standard karena hasilnya hampir semua tulang yang terwarnai dari beberapa kelompok. Pada kelompok hasil preprat hancur $tidak utuh atau tinggal tulangnya sa+a$ ini disebabkan beberapa hal menurut Soeminto #%&&&' yaitu$ pada saat perendaman di larutan 6 terlalu lama yang mengakibatkan kulit dan daging ikan terkelupas dari tubuh ikan. ebanyakan pada ikan nilem hanya tinggal tulangnya sa+a ini dimungkinkan dalam perlakuan ikan terlalu lama direndam dengan alkohol sehingga dagingnya men+adi lunak. Perendaman dengan 6 pun kemungkinan terlalu lama sehingga daging yang seharusnya transparan +ustru men+adi hancur. 6 berfungsi mentransparankan preparat hal ini disebabkan karena zat warna ini terikat pada matriks tulang hewan u+i. (ilton #)"30' menyatakan Alizarin red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang atau untuk mendeteksi proses osifikasi pada tulang,
tulang yang diwarnai oleh alizarin red akan berwarna merah tua$ yang menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua yang terbentuk disebabklan karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang. >aringan tulang baik tulang rawan maupun tulang keras mempunyai endapan garam,garam kalsium yang bila diwarnai dengan zat pewarna yang disebut alizarin red akan berwarna orange atau kemerah,merahan. Proses pertumbuhan dan perkembangan +aringan tulang yang sangat tergantung pada mineralisasi matrik ekstrasel. 9aktor,faktor yang mempengaruhi kalsifikasi yaitu komponen matrik ekstrasel utama yang berperandalam proses pengerasan tulang yaitu garam kalsium umumnya tulang yang terbentuk secara intramembran mengalami osifikasi lebih cepat dibandingkan dengan tulang yang terbentuk secar a endokondral #>asin$ )"!"' (enurut Puchtler #)"0"'$ ;arutan pewarna alizarin red$ menimbulkan proses pewarnaan skeleton men+adi merah tua atau ungu yang menandakan bahwa tulang yang telah terwarnai dengan warna tersebut telah ter+adi adanya proses kalsifikasi pada hewan u+i yang digunakan tersebut. 9aktor,faktor yang mempengaruhi pewarnaan alizarin red$ yaitu 7 ).
(akanan berpengaruh dalam proses kalsifikasi. 6al ini khususnya berlaku terhadap cukupnya persediaan dan tersedianya mineral,mineral seperti kalsium dan fosfor$ yang merupakan komponen,komponenan organik utama dari tulang.
%.
6ormon paratiroid$ kalsitonin$ dan /itamin 1 yang bertanggung+awab terhadap tingkat kadar kalsium darah yang normal$ yang akan mempengaruhi proses kalsifikasi. alsitonin adalah hormon yang berasal dari sel,sel parafolikul rikelen +artiroid. 6ormon tersebut mempunyai aksi dalam menurunkan kadar kalsium darah dan menghambat presorpsi tulang sehingga mempengaruhi proses kalsifikasi #>asin$)"!"'. (akanan +uga berpengaruh dalam proses kalsifikasi. 6al ini khususnya terhadap
cukupnya persediaan dan tersedianya mineral,mineralsepert ikalsium dan fosfor$ yang merupakan komponen,komponen anorganik utama dari tulang. ekurangan kalsium atau fosfor dalam makanan mengakibatkan pelanggaran dan kerapuhan tulang. Situasi dimana kalsium cukup tetapi /itamin 1 kurang$ ter+adilah gangguan dalam penyerapan mineral dan mineralisasi pada tulang yang sedang tumbuh #diantaranya tahap kalsifikasi' men+adi terhambat #-atim$ )"!'. omponen utama larutan pewarna alizarin red adalah garam kalsium.
Pewarnaini dilarutkan dalam 5&4 asam asetat$ ditambah larurtan gliserin PA$ alkohol hidrat )4 dan akuosa 0& ml. ;arutan pewarna dilarutkan dengan 6 %4. Proses kalsifikasi dapat diamati dengan metode pewarnaan alizarin red +aringan mengalami kalsifikasi #pengapuran' apabila mineral diendapkan dalam bentuk hidroksi,apatit dalam pembentukan sel dan matriks # >essop$)"!!'.
I# $E-IMP*LAN DAN -ARAN A $e&imp(la!
*erdasarkan hasil dan pembahasan di atas maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut7 ).
Alizarin red adalah satu metode mikroteknik untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Tulang yang diwarnai dengan alizarin Red akan berwarna merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.
%.
6asil dari praktikum alizarin red kelompok : tulang yang terwarnai yaitu operculum$ tengkorak$ tulang mata$ semua sirip #sirip abdominal$ dorsal$ pectoral$ caudal dan anal' dan tulang belakang sedangkan tulang yang terlihat yaitu tulang rusuk.
B -ara!
Sebaiknya dalam praktikum ini preparat ikan yang digunakan dengan tempatnya disesuaikan agar mudah diamati dan +elas kalfikasinya $ serta untuk larutan yang digunakan sebaiknya +angan dibungkus menggunakan plastik agar mengurangi resiko tumpah atau bocor.
DAF)AR REFEREN-I Anat, J.1969. The in Vivo Staining of Bone with Alizarin Red. Hal 533-545. Bensimon, A. B., J. Cardeira, G. Dionísio, A. Huysseune, . !. Can"ela and #. $. %i&en. '(16. )e*isi+n in i*o tainin %it/ Ali0arin )ed a aluale A22roa"/ to Analyse eras/ eletal inerali0a+on Durin De*elo2ment and )eenera+on. Journal BMC Developmental Biology . 16' D78 1(.116:s1'61-(16-(1('-4. D;u/anda, <. 191. m!riologi "er!andingan . Bandun C Armi"o. D;u/anda, <. 193. m!riologi "er!andingan . Bandun C Armi"o. Jasin, . 199. Si#tema$%a &ewan 'nverte!rata dan Verte!rata . uraaya inar
Jaya.
Jesso2, = . . 19. Theory and "ro!lem of (oology . ina2ore B > J7 $ntre2rise !td.
#te
?aryadi, B, d. '((. "em!erian Ra#io )al#ium dan *o#for Terhadap +#i,%a#i m!rio "uyuh. Benulu @=8B.
Tulang
ilton, H. 196. Analy#i# of Verte!rate Stru-ture *ourth di$on. Jo/n %iley and ons. Canada 8n". #a&ern, B. . 191. arly m!riology of The Chi-% . =e Del/i ".Gra-Hill Com2any.
#ulis/in
#u"/tler, Holde., usan =. eloan and ary .
ura, . '(((. /awa#an 'lmu "engetahuan m!rio . Jaarta De2artemen #endidian =asional. a+m, %. 193. m!riology . Bandun
