RESUME PERCOBAAN MESELSON-STAHL, MESELSON-STAHL, REPLIKASI “ROLLING “ROLLING CIRCLE”, CIRCLE”, DAN
Disusun untuk memenuhi tugas Mata kuliah Genetika I Yang dibina oleh Prof. Dr Hj. Siti Zubaidah, M. Pd
Oleh Kelompok 13/ off G : Ferni Lia Agustina (150342601904) (150342601904) Maghfiroh Gesty Maharani (150342600207) (150342600207)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI Februari 2017
RESUME Terdapat beberapa kemungkinan mekanisme replikasi DNA, ada 3 hipotesis berbeda : 1. Semikonservatif 2. Konservatif, heliks ganda yang baru terbentuk dari dua untai heliks tunggal yang sama-sama baru.. 3. Dispersif, potongan DNA yang melakukan replikasi. P otongan-potongan itu terpecah menjadi dua dan tiap kelompok potongan melengkapi dirinya dengan segmn-se gmen baru sehingga diperoleh susunan berseling antara segmen DNA lama dan baru. Adanya 3 macam hipotesis ini maka M.S. Messelson dan F.W sta hl mempublikasikan bahwa replikasi DNA berjalan sesuai denga teori semi konservatif. Percobaan dilakukan dengan menggunakan bakteri E. coli. Meselson dan Stahl menumbuhkan E. coli selama bergenerasi pada medium yang mengandung isotop 15 N sebagai pengganti isotop normalnya yaitu 14 Nyang lebih ringan. Purin dan pirimidin mengandung nitrogen, sehingga nantinya semua purin dan pirimidin dari bakteri yang dibiakkan ini mengandung isotop 15 N. Dengan demikian massa jenis bakteri 15 N akan lebih besar dari massa jenis bakteri 14 N. 1. Saat dilakukan percobaan ini telah diketahui adanya prosedur teknik pemisahan molekul berdasarakan massa jenisnya yang dikenal dengan sebutan equilibrium density centrifugation. 2. Untuk mengetahui teori mana yang berlaku dalam replikasi DNA, maka Meselson dan Stahl dapat mengetahuinya dari pencatatan perubahan komponen massa jenus DNA sel yang ditumbuhkan pada medium 15 N dan kemudian di pindahkan ke medium 14 N. Massa jenis DNA kurang lebih sama dengan massa jenis larutan garam. Dengan sentrif ugasi kecepatan tinggi dan waktu tertentu maka dapat dipisahkan antara molekul dengan massa jenis tinggi dan molekul dengan massa jenis rendah secara bergradien dari bagian atas tabung sampai ke bagian bawahnya. 3. Setelah membiakkan bakteri bakteri dalam medium dengan isotop 15 N, maka Meselson dan Stahl memindahkan bakteri untuk dibiakkan di medium dengan isotop 14 N. Berikut adalah gambar langkah-langkah percobaan yang dilakukan oleh Meselson dan Stahl. 4. Setelah dibiakkan dalam waktu tertentu maka sebagian bakteri dianalisis dengan teknik CsCl equilibrium density centrifugation. Analisis dilakukan pada berbagai generasi. Hasil analisis
yang didapat seperti ditunjukkan oleh gambar berikut ini.
Sebelum perlakuan maka diuji dulu untuk memastikan DNA parental yang dipakai adalah DNA yang mengandung isotop 15 N.Kontrol 1, DNA bakteri yang dibiakkan di medium isotop 14
N yang semuanya masa jenisnya ringan. Kontrol 2 campuran antara bakteri yang dibiakkan
di isotop 14 N dan 15 N yang terpisah membentuk dua lapisan yang berbeda. 1. Pada generasi pertama, setelah bakteri yang dibiakkan pada isotop 15 N dipidahkan ke 14 N, diperoleh hasil DNA yang massa jenisnya terletak antara massa jenis DNA bakteri yang dibiakkan di medium isotop 15 N dan isotop 14 N (DNA hibrid). Hasil ini memenuhi teori semikonservatif dan teori dispersif. 2. Pada generasi kedua,diperoleh bakteri dengan DNA hibrid dan DNA ringan (mengandung
14
N) yang setara. Hasil ii memenuhi teori semikonservatif. 3.
Pada generasi ketiga diperoleh hasil seperempat DNA hibrid dan tiga perempatnya DNA ringan. Berdasarkan hasil percobaan Meselson-Stahl ini, maka sec ara kuat diperoleh kesimpulan bahawa replikasi DNA adalah semi konservatif. Replikasi semikonservatif ini terjadi pula pada organisme lain selain bakteri yaitu kelompok tumbuhan tinggi dan hewan.
Replikasi “Rolling Circle”
Bakteriophag merupakan perwakilan dari virus yang kecil, keduanya bakteri dan eukariotik. Informasi genetik berada pada untai tunggal yang berbentuk sirkular. Ketika virus menginfeksi sel inang, pusat untaian tunggal beserta keturunannya telah disintesis . Ada 3 tahap dalam replikasi rantai tunggal DNA pada bakteriophag X174 : (1) Untaian positif induk → RF induk, (2) RF induk → RFs anakan, dan (3) RFs anakan → untaian positif anakan. Seperti pada gambar :
Tahap I. Konversi kromosom untai tunggal menjadi induk untai ganda . (a-e) dari untai tunggal menjadi induk untai ganda (RF), (b) Sintesis untai (-) komplemen diinisiasi oleh sintesis primer RNA pendek, reaksi dikatalis oleh primosom yeng membutuhkan complek paling tidak 6 protein yang berbeda, komplemen ini disebut primosom. (c) DNA polimerase III mengkataklisis covalen tambahan dari DNA sampai unung 3’ dari RNA primer. Sintesis untai (-) komplemen itu terjadi secara terus menerus sampai cetakan untai positif habis. Primosom bergerak di sekitar untai cetakan silkuler, setelah berhenti sebentar kemudian menginisiasi sintesis fragmen okazaki yang baru. (d) Pemotongan primer RNA pada celah celah diantara fragmen-fragmen okazaki tersebut dii si oleh aktivitas DNA polimerase I. DNA ligase kemudian mengkatalisis ikatan kovalen diantara 3’OH dan 5’OP untuk menghasilkan induk untai ganda (RF).
Tahap II, Rolling circle Replication dari induk RF untuk menghasilkan kumpulan anakan RFs (e). (f) induk untai (+) RF dipotong pada bagian ori dengan menggunakan
enzim nuklease dari ФX174 protein gen A. lubang protein gen A pada induk RF terletak hanya pada ori dan tidak akan memotong molekul DNA sama sekali. (f-h) selama peristiwa protein gen A menjadi ikatan kovalennya bertambah pada group 5’ pada untai (+). Hal ini menyisakan sambungan menuju 5’ sampai untai positif anakan disintesis dengan sempurna. (g) Ujung 5’ pada untai positif dipindahkan dari untai (-) dan DNA ditambahkan pada 3’OH membentuk lingkaran. (g-h) Protein gen A menyisakan ikatan pada garpu replikasi untuk pergerakannya di sekitar untai negatif (-). (h-i) Sekali untai positif (+) baru disintesis protein gen A membelah daerah permulaan dan secara simultan menyambung ujung 3’ dan 5’ untuk membentuk untai positif silkular menjadi lebih rapat. (i-l ) Sintesis untai negatif (-) komplemen terjadi secara tidak terus menerus seperti pada tahap I dengan menggunakan untaian positif sebagai cetakan. Fragmen-fragmen okazaki diinis iasi oleh RNA primer namun RNA primer tersebut tidak tampak pada diagram. (i-f-l) Induk RF terus bereplikasi dengan cara rolling circle sampai populasi anakan RFs sebanyak 60.
Tahap III, sintesis kromosom anakan untai tunggal . (l-p) Rolling circle replication dari anakan RFs terjadi hanya pada induk RFs pada tahap 2, kecuali jika untai negatif tidak disintesis, sebagai penggantinya untai positif dibungkus dalam virion. (n-p) dari sintesis RF (tahap 2) menjadi anakan untai positif pada tahap 3 dihasil kan dari sintesis gabungan lapisan protein virus yang terdapat pada untai positif, yang mencegahnya dari cetakan yang sesuai bagi untai negatif. (q) Pematangan anakan virus akan sempurna pada siklus hidup bakteorifag ФX174. Sekitar 500 anakan virus dihasilkan per sel yang terinfeksi Bukti-bukti terjadinya Rolling circle replication ditemukan pada (1) DNA virus
untai tunggal seperti ФX174, (2) Replikasi behubungan dengan transfer kromosom selama
fase “mating” (konjugasi) pada bakteri (Tamarin, 2001), dan (3) replikasi pada molekul DNA ekstra kromosom yang membawa gen-gen rRNA selama oogenesis pada ampibi.
Maghfiroh Gesty Maharani (150342600207) Pertanyaan 1 1. Bagaimana hubungan antara konsep DNA yang disampaikan oleh Watson -Crick dengan percobaan yang dilakukan oleh Meselson-Stahl ? Jawaban 1 : Percobaan Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA adalah doublehelix dengan dasar-pasangan yang saling melengkapi, dan mereka mengemukakan bahwa hal tersebut bisa memberikan dasar bagi mekanisme sederhana untuk duplikasi DNA. Mereka mengemukakan bahwa mekanisme double-helix bisa mendqapatkan tiruan, setiap untai akan memandu sintesis komplementer strand yang baru. Parental digunakan sebagai template dan menentukan urutan basa dalam untai yang baru disintesis. Mekanisme replikasi DNA yang mungkin disebut replikasi semikonservatif karena molekul parental setengahnya tetap dipertahankan dan berfungsi sebagai template untuk sintesis baru untai komplementer, yang kemudian percobaan dibuktikan oleh Meselson-Stahl, sehingga kesimpulan kedua percobaan te rsebut saling berkaitan dan saling mendukung. Pertanyaan 2 2. Mengapa hasil percobaan Meselson-Stahl menunjukkan replikasi DNA yang semikonservatif, bukan konservatif atau dipersif? Bagaimana menganalisisnya? Jawaban 2 : Karena hasil percobaan Meselson-Stahl ditemukan DNA dengan kepadatan menengah yang disebut “hybrid”. Setelah dua generasi pertumbuhan dalam medium yang mengandung 14 N, setengah dari DNA adalah hybrid dan setengahnya ringan. Setelah tiga generasi pertumbuhan dalam medium yang mengandung 14 N, hasilnya satu hybrid dan tiga ringan. Hasil ini sesuai dengan replikasi DNA semikonservatif. Sedangkan replikasi konservatif tidak akan menghasilkan molekul DNA dengan kepadatan hybrid, setelah satu generasi replikasi konservatif DNA berat dalam medium ringan, setengah dari DNA masih akan berat dan setengah lainnya akan menjadi ringan. Jika replikasi yang dispersif , seharusnya hasilnya adalah DNA
dengan kerapatan tunggal, lebih rendah daripada kerapatan DNA hybrid dan lebih tinggi dari kerapatan DNA ringan 14 N.
