PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DALAM TABLET DENGAN MENGGUNAKAN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY(HPLC) CHROMATOGRAPHY(HPLC) I.TUJUAN Menentukn k!" Menentukn k!" #"$et%&' !'% t'et !enn %et&!e n'*$*$ HPLC II. +.,
DASAR TEORI P"$et%&' Parasetamol (C8H9 NO NO2) atau asetaminofen berupa serbuk hablur, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit. Menandun tidak kuran dari 98,!" dan tidak lebih dari #!#,! " C8H9 NO NO2, dihitun terhadap $at anhidrat. %elarutann&a larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida # N serta mudah larut dalam etanol. 'M parasetamol adalah ##,#. Parasetamol memiliki khasiat sebaai analetikum dan antipiretikum (*epkes +, #99). Parase Parasetam tamol ol adalah adalah sen&asen&a-aa &an &an memili memiliki ki sifat sifat polar polar dan uus uus kromof kromofor or &an &an dimilik dimilikin& in&aa men&ebabkan sen&a-a ini dapat men&erap sinar /. %arakteristik sen&a-a ini memunkinkan analisis denan teknik HP0C menunakan kolom nonpolar seperti C1#8 dan fasa erak polar seperti methanol air. Parasetam Parasetamol ol diabsorbs diabsorbsii 3epat 3epat dan sempurna sempurna melalui saluran saluran 3erna. 3erna. %onsentrasi tertini plasma di3apai dalam -aktu 4 5am dan masa paruh plasma antara #16 5am. Obat Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. *alam plasma, plasma, 2" parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol diunakan sebaai analesi3 dan antipiretik. 7ambar +umus truktur Parasetamol
bsorban bsorbansi si paraseta parasetamol mol pada λma: 2; nm dalam larutan asam adalah sebesar 8a sedankan dalam larutan alkali atau basa absorbansin&a sebesar <#a pada λma: 2< nm. (Moffat et al ., ., 2!!). +.+ +.+
H*H*- Pe" Pe"&" &"% %n/ n/ee L*0u L*0u*! *! C-"& C-"&% %t& t&" "# #-1 -1 HPLC HPLC High performance liquid chromatography (HPLC) atau &an serin disebut kromatorafi 3air kiner5a tini tini (%C%=) (%C%=) adalah 5enis kromatora kromatorafi fi &an penunaan penunaann&a n&a palin luas. Prinsip Prinsip ker5a dari HP0C HP0C adalah adalah memisahkan suatu sen&a-a berdasarkan kepolarann&a &an dimana terdapat dua fase &aitu fase diam dan fase erak. Pemisahan baian dari suatu sampel &an kemudian dilakukan suatu analisis kuantitatif dan kualitatif. HP0C dilakukan denan menin5eksi sebaian ke3il dari sampel 3airan ke dalam aliran 3airan bererak (disebut fasa erak) &an mele-ati kolom denan partikel dari fasa diam. eperti haln&a kromatorafi as, pemisahan 3ampuran kedalam komponenn&a berantun pada -aktu retensi dari setiap komponen dalam kolom. kolom. %adar %adar komponen komponen &an terpisahk terpisahkan an berantun berantun pada perbandin perbandinan an fasa erak erak dan fasa diam n&a. 'erbaai teknik pemisahan HP0C denan mem>ariasikan fasa diam dan erak telah dilakukan. %eunaan umum HP0C adalah untuk pemisahan dan pemurnian sen&a-a obat serta untuk analisis kuantitatif sen&a-a obat dalam sediaan farmasetika. *isampin itu, HP0C 5ua diunakan untuk identifikasi kualitatif sen&a-a obat berdasarkan pada parameter -aktu retensi sen&a-a obat standar serta sen&a-a obat dalam sampel. %eunaan HP0C antara lain? 1 ntu ntuk k pemi pemisa saha han n se5u se5uml mlah ah sen& sen&aa-aa ora orani nik, k, anor anora ani nik, k, maup maupun un sen& sen&aa-aa biol biolo ois is 1 nalisis ketidakmurnian (impurities) 1 nali nalisi siss sen& sen&aa-a1 a1se sen& n&aa-aa tida tidak k muda mudah h men menua uap p (non (non >ola >olati tile le)) 1 Pene Penent ntua uan n mole moleku kul1 l1mo mole leku kull netr netral al,, ioni ionik, k, maup maupun un $-it $-itte terr ion ion 1 solasi dan pemurnian sen&a-a 1 Pemis misahan ahan sen& sen&aa-a1 a1ssen& en&a-a a-a &an &an str struk uktu turrn&a n&a ha hampir pir sa sama 1 Pemisahan sen& sen&aa-a1sen&a-a dala dalam m 5um 5umlah lah &an &an se sekelumit (trace element ), ), dalam 5umlah ban&ak, dan dalam skala proses proses industri. +.2
P"%ete" HPLC Parameter &an dapat diunakan untuk menetahui kualitas suatu kromatoram adalah +esolusi (+ s), @aktor +etensi (k), @aktor selektifitas (A), Bfisiensi dan 5umlah lempen teoritis (N). 1 +esolusi (+s ) Hal &an terpentin dari HP0C adalah menoptimasi resolusi dalam -aktu &an minimum. Nilai resolu resolusi si &an &an meleb melebihi ihi #, dianta diantara ra dua pun3ak pun3ak akan akan membe memberik rikan an nilai nilai pemisa pemisahan han &an &an baik. baik. +esolu +esolusi si dipenaruhi oleh beberapa parameter diantaran&a? Selectivity, Effieciency, dan Retention.
1
@aktor +etensi (k) @aktor retensi adalah -aktu &an diperlukan untuk memba-a keluar suatu komponen dari dalam kolom kromatorafi. Nilai k &an tini menindikasikan sampel memerlukan -aktu dalam berinteraksi denan fase diam terlebih dahulu hina keluar dari kolom saat tepat dalam konsentrasi maksimum.
A
1
@aktor selektifitas (
)
elektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam menenali sen&a-a1sen&a-a dalam 3ampuran untuk mendapat selektifitas &an maksimum diperlukan interaksi &an sesuai (partisi, adsorpsi, sie e!clusion, atau ion e!change ). pabila kedua sen&a-a memiliki k atau nilai A # kedua sen&a-a tidak dapat dipisahkan. akibat -aktu retensin&a identik. ar ter5adi pemisahan &an baik maka nilai selekti>itas (A) harus lebih besar daripada #, semakin besar nilai A maka pemisahann&a akan semakin baik. Nilai A dapat diubah1ubah denan 3ara, menubah fasa erak (misaln&a denan memperbesar polaritas), menubah fasa diam, menubah temperatur karena pada umumn&a kenaikan temperatur akan memperke3il -aktu retensi, dan menubah bentuk komponen 1 Bfisiensi Bfisiensi kolom merupakan kemampuan kolom meneluarkan hasil &an diininkan denan memuaskan dan dalam -aktu &an sinkat. Hasil &an idel kolom &an efisien akan menhasilkan pun3ak &an ta5am. Bfisiensi sanat dipenaruhi oleh kapasitas dari kolom. 1 0empen teoritis (N) Merupakan parameter &an menhitun efisiensi kromatorafi. Men&atakan 5umlah peristi-a partisi &an dialami oleh analit pada setiap saat &an diba-a oleh fase erak selama elusi. *imana semakin besar hara N akan memberikan pun3ak &an lebih efisien. +.3
In$t"u%en
7ambar #. kema lat HP0C a.
Pompa ( Pump) =u5uan penunaan pompa atau sistem penhantaran fase erak adalah untuk men5amin proses penhantaran fase erak berlansun se3ara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari anuan. @ase erak dalam %C%= adalah suatu 3airan &an bererak melalui kolom. da dua tipe pompa &an diunakan, &aitu kiner5a konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement ). Pemindahan konstan dapat dibai men5adi dua, &aitu? pompa re3ipro3atin dan pompa s&rine. Pompa re3ipro3atin menhasilkan suatu aliran &an berden&ut teratur (pulsatin), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menhasilkan aris dasar ("ase line) detektor &an stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. %euntunan utaman&a ialah ukuran reser>oir tidak terbatas. Pompa s&rine memberikan aliran &an tidak berden&ut, tetapi reser>oirn&a terbatas.
b.
n5ektor ( #n$ector ) da tia tipe dasar in5ektor &an dapat diunakan? Stop%&lo'? liran dihentikan, in5eksi dilakukan pada kiner5a atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilan5utkan lai. =eknik ini bisa diunakan karena difusi di dalam 3airan ke3il dan resolusi tidak dipenaruhi. eptum? eptum &an diunakan pada %C%= sama denan &an diunakan pada %romatorafi 7as. n5ektor ini dapat diunakan pada kiner5a sampai ! 1olume lebih besar dari #! D0 dan dilakukan denan 3ara otomatis (denan menunakan adaptor &an sesuai, >olume &an lebih
•
•
•
ke3il dapat diin5eksikan se3ara manual). Pada posisi load , sampel diisi kedalam loop pada kiner5a atmosfer, bila valve difunsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom. &arat in5ektor ? • *apat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit munkin • Mudah diunakan • %eberulann tini • *apat beker5a -alaupun ada tekanan balik 3.
#)
2) d. #)
2)
6)
;)
III.
%olom (Column) %olom adalah 5antun kromatorafi. 'erhasil atau aaln&a suatu analisis terantun pada pemilihan kolom dan kondisi per3obaan &an sesuai. %olom dapat diklasifikasikan men5adi dua kelompok, &aitu ? %olom analitik? *iameter dalam 2 1 mm. Pan5an kolom terantun pada 5enis material penisi kolom. ntuk kemasan pellicular , pan5an &an diunakan adalah ! 1 #!! 3m. ntuk kemasan poros mikropartikulat, #! 1 6! 3m. *e-asa ini ada &an 3m. %olom preparatif? umumn&a memiliki diameter mm atau lebih besar dan pan5an kolom 2 1#!! 3m *etektor *etektor dapat dibai men5adi beberapa ma3am, &aitu sebaai berikut? *etektor spektrofotometri /1/is *etektor 5enis ini merupakan detektor &an palin ban&ak diunakan dan sanat beruna untuk analisis di bidan farmasi karena keban&akan sen&a-a obat mempun&ai struktur &an dapat men&erap sinar /1/is. *etektor ini didasarkan pada adan&a pen&erapan radiasi / dan sinar tampak pada kisaran pan5an elomban #9!18!! nm oleh spesies solut &an mempun&ai struktur atau uus kromoforik. el detektor umumn&a berupa tabun denan diameter # mm dan pan5an 3elah optikn&a #! mm, serta diatur sedemikian rupa sehina mampu menhilankan penaruh indeks bias &an dapat menubah absorbansi &an terukur. *etektor ndeks 'ias *etektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu detektor uni>ersal &an memberi tanap pada setiap $at terlarut, asalkan indeks biasn&a 5auh berbeda denan indeks bias fase erak. %elemahan utaman&a adalah bah-a indeks bias ini peka terhadap suhu. %arena itu suhu fase erak, kolom, dan detektor harus dikendalikan denan seksama, bila penukuran &an 3ermat dilakukan pada kepekaan tini. *etektor Blektrokimia 'an&ak molekul oranik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau direduksi se3ara elektrokimia pada elektrode &an 3o3ok. rus &an dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk menhasilkan tenaa &an sesuai. Meskipun detektor elektrokimia 3ukup peka, namun ada pula kelemahann&a. dan&a timbrunan listrik dan on3anan arus 5ua harus diperhatikan. *etektor Photodiode%rray (P*) *etektor P* merupakan detektor /1/is denan berbaai keistime-aan. *etektor ini mampu memberikan kumpulan kromatoram se3ara simultan pada pan5an elomban &an berbeda dalam sekali proses ( single run). elama proses ber5alan, suatu kromatoram pada pan5an elomban &an diininkan (biasan&a antara #9!1;!!) dapat ditampilkan. *enan demikian, P* memberikan ban&ak lebih ban&ak informasi komposisi sampel disbandin denan dete3tor /1/is. *enan detektor ini, 5ua diperoleh spe3trum / tiap pun3ak &an terpisah sehina dapat di5adikan sebaai alat &an pentin untuk memilih pan5an elomban maksimal untuk sistem %C%= &an diunakan. *an akhirn&a denan detektor ini pula, dapat dilakukan u5i kemurnian pun3ak denan membandinkan antara spe3tra analit denan spe3tra sen&a-a &an sudah diketahui. pektrum dan kromatoram &an dihasilkan pada detektor P* ini dapat ditampilkan sebaai plot 6 dimensi absorbansi, pan5an elomban, dan -aktu sehina data ini dapat dimanipulasi dan diplotkan kembali pada la&ar (monitor) lalu dibandinkan denan data 6 dimensi sen&a-a lain dari perpustakaan data &an ada di sistem komputern&a sehina bisa diunakan untuk tu5uan identifikasi (7and5ar dan +ohman, 2!!<).
ALAT DAN BAHAN 2.,. A't a. =imbanan analitik b. 'atan penaduk 3. endok tanduk d. 'eaker lass
e. f. . h. i. $* k. l. m. n. o* p.
Brlenme&er 0abu ukur Pipet ukur Mortir dan stamper 'otol >ial +ul" filler Pipet tetes %ertas perkamen Membran filter lat ultrasonik Syringe HP0C denan kolom reversed phase C#8
2.+. B-n a. =ablet sampel (Pamol) b. erbuk baku parasetamol 3. Metanol dan air (>) I4. 3.,
CARA KERJA Penk&n!*$*n K&'&% HPLC
0arutan pen3u3i kolom (metanol dan air (>)) difiltrasi melalui membran
Metanol dan air (>) difiltrasi.
*iin5eksikan metanol dan air (>) seban&ak #! µ0 ke alat melalui selan pelarut denan ke3epatan alir # m0menit. 3.+
Pe%utn L"utn St&k P"$et%&' ,55 67%L
*itimban parasetamol menunakan "eaer glass seban&ak ! m.
*ilarutkan denan sedikit metanol dan air (>), dimasukkan ke dalam labu ukur ! m0.
*itambahkan metanol dan air (>) sampai tanda batas, diko3ok hina homoen.
*ipipet seban&ak # m0, dimasukan kedalam labu ukur #! m0.
*itambahkan metanol dan air (>) sampai tanda batas.
*iko3ok hina homoen. 3.2
Pe%utn Se"* L"utn Stn!" P"$et%&' 8 67%L9 ,5 67%L9 ,8 67%L9 +5 67%L9 +8 67%L
0arutan stok parasetamol #!! Em0dipipet !, m0F # m0F #, m0F 2 m0F 2, m0 dimasukan ke dalam labu ukur #! m0.
*itambahkan metanol dan air (>) hina tanda batas.
*iko3ok hina homoen. 3.3
Pe%utn L"utn S%#e' , %7%L
*ierus tablet parasetamol seban&ak 6 buah menunakan stamper dan mortir.
*itimban serbuk menandun seban&ak #!! m parasetamol.
*imasukan ke dalam "eaer glass, setelah itu serbuk ini dilarutkan denan metanol dan air (>), dimasukan kedalam labu ukur #!! m0.
*itambahkan pelarut hina tanda batas kemudian diko3ok hina homoen.
*itambahkan metanol dan air (>) ke dalam labu ukur sampai tanda batas.
*iko3ok hina homoen. 3.3., Penen/e"n L"utn S%#e' , %7%L %en:!* ,55 67%L
*ipipet larutan parasetamol # mm0 seban&ak #! m0, dimasukkan ke dalam labu ukur #!! m0.
*itambahkan metanol dan air (>) hina tanda batas.
*iko3ok hina homoen. 3.3.+ Penen/e"n L"utn S%#e' ,55 6 %en:!* ,8 67%L
*ipipet larutan sampel #!! Em0 seban&ak #, m0, dimasukan ke dalam labu ukur #! m0.
*itambahkan metanol dan air (>) sampai tanda batas.
*iko3ok hina homoen.
*iulani seban&ak 2 kali. 3.8
Pe%utn Ku"; K'*"$*
*iin5eksikan larutan seri parasetamol konsentrasi terendah diin5eksikan ke membran (difiltrasi) seban&ak 2! µ0 pada in5ektor HP0C.
0arutan seri di1 scan pada pan5an elomban 2!! nm16!! nm.
*itentukan pan5an elomban maksimumn&a.
0arutan standar lain diukur pada pan5an elomban maksimum.
*ibuat kur>a kalibrasi standar parasetamol dan persamaan reresi linier & b: a, & C dan : kadar sampel (Em0).
3.<
Penet#n K!" P"$et%&'
etiap larutan sampel parasetamol di1degassing dan difiltrasi.
*iin5eksikan seban&ak 2! µ0 larutan sampel pada in5ektor HP0C.
0arutan dis3an pada pan5an elomban maksimum parasetamol &an sudah diperoleh sebelumn&a.
Masin1masin C &an akan didapat di3atat sebaai bahan penetapan kadar denan 3ara mensubstitusikan nilai C ke dalam kur>a kalibrasi parasetamol &an sudah diperoleh sebelumn&a.
*itentukan nilai perolehan kembali kadar parasetamol terhadap kadar pada kemasan sampel.
4.
HASIL PENGAMATAN 8., B&&t M$*n=M$*n T'et 8.,., S%#e' =ablet 'obot =ablet # !,<2; ram =ablet 2 !,<222 ram =ablet 6 !,<2 ram 'obot total 2,#<;#ram
8.+ Dt AUC !n >ktu "eten$* 'ahan tandar # ( Eml) tandar 2 (#! Eml) tandar 6 (# Eml) tandar ; (2! Eml) tandar (2Eml) ampel
C 6968 #2#;!#! #<6;6;; 26622 2
Gaktu +etensi #,9 #,8# #,<9 #,8 #,8# #,<#
8.2 S#ekt"u% 8.2., Stn!" , (8 67%')
8.2.+ Stn!" + (,5 67%')
8.2.2 Stn!" 2 (,8 67%')
8.2.3 Stn!" 3 (+5 67%')
8.2.8 Stn!" 8 (+867%')
8.2.< S%#e'
4I.
ANALISIS DATA <., L"utn Stn!"
'ahan tandar # ( Eml) tandar 2 (#! Eml) tandar 6 (# Eml) tandar ; (2! Eml) tandar (2Eml) ampel
C 6968 #2#;!#! #<6;6;; 26622 2
Gaktu +etensi #,9 #,8# #,<9 #,8 #,8# #,<#
3000000 f(x) = 105129.3x + 148751.5 R² = 1
2500000 2000000 1500000
Linear ()
1000000 500000 0 0
5
10 15 20 25 30
*ari data diatas, dapat ditentukan persamaan reresi linear dari larutan standar seri konsentrasi. +eresi linear &an diperoleh? & #!#29,6: #;8<#, +I !,99< Perhitunan kadar sampel? *iketahui ? & #!#29,6: #;8<#, C #<6<6! *itan&a ? %onsentrasi ......Dm0(:) Ja-ab? & #!#29,6: #;8<#, #<6<6! #!#29,6: #;8<#, #!#29,6: #88!8, : #,## Dm0 <.+ Pe"-*tunn K&n;e"$* S%#e' !n K!" P"/et%&' !'% S%#e' *iketahui ? %adar sampel #,## Dm0 %adar sampel primer # mm0 /olume sampel primer #!! m0 %adar sampel sekunder # D m0 *itan&a ? kadar sampel ......m Ja-ab ? − %on>ersi dari kadar sampel (Eml) sebandin #!!! Eml
#(,## E2m0 #(E2ml −
!#!!! µ 2ml
=
#!!<,6 E2ml
=
#,!!<6 m2ml
%on>ersi sebandin #!! m sampel #,!!<6 mml × #!! ml #!!,<6 m %adar sampel #,## Dm0 setara #!!,<6 m %adar para3etamol dalam sampel #!!,<6 m
<.2 Pe"-*tunn K!" P"/et%&' !'% T'et *iketahui ? %andunan parasetamol # tablet &an diambil (k a) #!! m %andunan para3etamol diperoleh (k s) #!!,<6 m %andunan parasetamol 6 tablet se3ara teoritis #!! m %andunan parasetamol # tablet se3ara teoritis !! m *itan&a ? %andunan parasetamol # tablet dari analisis ...K
Ja-ab
?
k s k a
×
#(!! m
%andunan parasetamol 6 tablet
#!!,<6 m #!!mg
×
#(!!mg
##!,9 m #(#!,9( mg 6 %andunan parasetamol # tablet !6, m 4II.
PEMBAHASAN Prinsip dari metode HP0C pada umumn&a sama denan metode kromatorafi, &aitu didasarkan pada perbedaan ke3epatan mirasi solut &an dipenaruhi oleh perbedaan afinitas solut terhadap fase erak dan fase diam (7and5ar dan +ohman, 2!!<). Metode HP0C ideal untuk analisis beraam obat dalam sediaan dan 3airan bioloi, karena sederhana, dan kepekaann&a tini (Munson, #98;). ebelum dilakukan penin5eksian sampel, terlebih dahulu dilakukan penin5eksian larutan standar eksternal parasetamol denan kosentrasi Em0F #! Em0F # Em0F 2! Em0F 2 Em0. 'erdasarkan hasil penamatan terhadap nilai C, diperoleh data &an menun5ukan bah-a pada larutan standar parasetamol Em0 diperoleh nilai C sebesar 6968 denan -aktu retensi #,9. Pada larutan standar parasetamol #! Em0 diperoleh nilai C sebesar #2#;!#! denan -aktu retensi #,8#. Pada larutan standar parasetamol # Em0 diperoleh nilai C sebesar #<6;6;; denan -aktu retensi #,<9. Pada larutan standar parasetamol 2! Em0 diperoleh nilai C sebesar 26622 denan -aktu retensi #,8. Pada larutan standar parasetamol 2 Em0 diperoleh nilai C sebesar 2a kalibrasi sebaai berikut ? 3000000 f(x) = 105129.3x + 148751.5 R² = 1
2500000 2000000 1500000 1000000
Linear ()
500000 0 0
5
10 15 20 25 30
*ari semua larutan standar &an diukur diperoleh persamaan reresi denan menunakan kelima larutan standar &aitu konsentrasi diperoleh nilai korelasi (+ 2) &an 3ukup tini &aitu sebesar !,99<. Persamaan reresi & #!#29,6 #;8<#, denan & C dan : kadar sampel (Eml). Persamaan ini sudah memenuhi parameter linieritas sehina denan persamaan linier ini, maka dapat diunakan untuk menentukan kadar parasetamol sampel. etelah diperoleh persamaan reresi linier dari larutan standar eksternal parasetamol. elan5utn&a dilakukan penin5eksian sampel. Blusi dari masin1masin berkisar antara #,82 menit. Penin5eksian sampel dilakukan seban&ak 6 kali untuk memperoleh keseksamaan atau kesalahan &an minimal.
5i kualiatif adan&a parasetamol dalam tablet dilakukan denan men3o3okan batas spektrum &an diperoleh denan spektrum standar parasetamol a-al. 'erikut spektrum dari ketia sampel &an diin5eksikan ?
7ambar 2. pektrum sampel e3ara kuantitatif berdasarkan perhitunan diperoleh kadar sampel rata1rata dari 6 kali pen&untikan adalah #!<,!8 m. %adar &an diperoleh dari hasil analsis adalah 6,;# m denan perolehan kembali sebesar #!<,!8". Hasil &an diperoleh melebihi #!! " dari kadar sebenarn&a. Hal ini kemunkinan karena ketidaktepatan pemipetan pada saat pembuatan larutan sampel.
4III. KESIMPULAN
%eunaan umum HP0C adalah untuk pemisahan dan pemurnian sen&a-a obat serta untuk analisis kuantitatif sen&a-a obat dalam sediaan farmasetika. Parameter &an dapat diunakan untuk menetahui kualitas suatu kromatoram adalah +esolusi (+ s), @aktor +etensi (k), @aktor selektifitas (A), Bfisiensi dan 5umlah lempen teoritis (N). %adar parasetamol &an diperoleh 6,;# m denan perolehan kembali sebesar #!<,!8".