High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Oleh: Andhina Rizkya Satriani Dian Ade Putrawan Emma Zahra Isnaningsih I Gede Jate Swara
[G1C 011 002] [G1C 011 [G1C 011 [G1C 011 [G1C 011
• High-Performance Liquid Chromatography (atau disebut juga High-Pressure Liquid Chromatography), HPLC, merupakan teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan campuran dari senyawa-senyawa pada kimia analitik dan biokimia dengan tujuan mengidentifikasi, mengukur, atau memurnikan komponen-komponen individual dari campuran (Wikipedia).
• HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 mikrometer; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan tinggi (Khopkar, 2010).
• Keterangan: 1. Wadah pelarut 2. Degasser pelarut 3. Katup gradien 4. Wadah pencampuran 5. Pompa bertekanan tinggi 6. Katup dalam posisi injeksi 6’. Katup dalam posisi load 7. Loop injeksi sampel 8. Kolom pengaman
9. Kolom analisis 10. Detektor (misalnya: IR, UV) 11. Pengolahan data 12. Wadah sisa atau fraksi
A. Prinsip Kerja HPLC • Dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. • Di dalam kolom, terjadi pemisahan komponen-komponen campuran karena perbedaan kekuatan interaksi antara solutsolut terhadap fasa diam. • Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
B. Diagram Alur HPLC Wadah Pelarut
Degasser Pelarut
Pompa Bertekanan Tinggi
Kolom
Loop
Tempat Injeksi Sampel
Detektor (ex: IR, UV)
Komputer
Kromatogram
B. Diagram Alur HPLC
(Contoh kromatogram dari campuran kompleks parfum)
C. Instrumen HPLC
C. Instrumen HPLC • Komponen-komponen HPLC: – Eluen (Pelarut atau Fase Gerak) Tempat pelarut biasanya menggunakan suatu botol yang tahan terhadap pelarut-pelarut organik dan larutan yang digunakan untuk HPLC haruslah terbebas dari partikel-partikel lain yang dapat menggangu.
– Sistem Pemompa Untuk memompa eluen.
– Penginjeksi Sampel Proses injeksi pada awalnya menggunakan syringe melalui sebuah katup elastomer. Syringe yang digunakan memiliki kemampuan melawan tekanan 1500 psi.
C. Instrumen HPLC – Kolom HPLC Kolom HPLC secara umum dibuat dari bahan tabung stainless steel. Kolom untuk analisis HPLC memiliki ukuran panjang kolom berkisar dari 10 – 30 cm. Diameter dalam kolom 4 – 10 mm dengan ukuran partikel 5 – 10 μm.
– Detektor Merupakan pengolah data.
D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC • Kelebihan HPLC: – Kerja lebih mudah dengan automasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data. – Volume sampel kecil (dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya). – Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya pisah tinggi. – Merupakan metode analitis: cepat, peka, akurat, tepat, reproducible, preparatif. – Dapat digunakan untuk sampel organik dan anorganik, bersifat volatile dan non volatil, stabil dan tidak stabil secara termal.
D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC – Pilihan fase gerak dan fase diamnya luas. – Dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan analisis. – Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi. – Kolom dapat digunakan kembali. – Waktu analisa cukup singkat. – HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil. – Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
D. Kelebihan dan Kekurangan HPLC • Kekurangan HPLC: – Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu. – Hanya bisa digunakan untuk asam organik. – Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit dan gradient elusi. – Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas. – Sering ada larutan standar yang tertinggal di injektor. – Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 3 mikrometer dan 5 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
E. Aplikasi dan Kegunaan HPLC • HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya. • HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. • HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.
E. Aplikasi dan Kegunaan HPLC • Banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. • Dapat memisahkan dan menganalisis vitamin-vitamin yang larut dalam air. • Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. • Untuk analisis anion nitrat (NO3-)
Referensi Anonim. High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Diakses di: http://indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/high-performance-liquidchromatography.html pada tanggal 13 Mei 2013. Anonim. Kelebihan dan Kekurangan HPLC. Diakses di: http://cha2inchemistry09.blogspot.com/2011/05/kelebihan-dan-kekurangan-metode.html pada tanggal 13 Mei 2013. Kealey, D. dan Haines, P. J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry. New York: BIOS Scientific Publishers Limited. Khopkar, S. M. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press. Lindsay, S. 1992. High Performance Liquid Chrotomagraphy. New York: John Wiley & Sons. Meyer, F. R. 2004. Practical High-Performance Liquid Chromatography. New York: John Wiley & Sons.
Referensi Settle, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. New Jersey: Prentice Hall PTR. Snyder, L. R. Kirkland, S. J. dan Glajch, J. L. 1997. Practical HPLC Method Development. New York: John Wiley & Sons. Underwood, A.L dan R.A. Day Jr. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta : Penerbit Erlangga. Wikipedia. High-Performance Liquid Chromatography. Diakses di: http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography pada tanggal 13 Mei 2013.
