PENENTUAN AKTIVITAS ENZIM LIPASE
A. TUJUAN PRAKTIKUM Mahasiswa dapat melakukan penentuan aktivitas enzim lipase yang terdapat pada kacang – kacangan B. WAKTU DAN TEMPAT Hari / tanggal
: kamis / 13 september 2018
Waktu
: 07.00 – 09.40 WIB
Tempat
: laboratorium biokimia FMIPA UNP
C. DASAR TEORI Minyak dan lemak tidak mengalami hidrolisis didalam mulut dan lambung manusia, namun terjadi di dalam usus halus karena usus halus mengandung enzim lipase. Enzim lipase berfungsi untuk menghidrolisis lemak dan lemak menjadi lipid yang lebih sederhana ( tri, di, dan mono gliserida ). Agar proses hidrolisis berlangsung sempurna, maka perlu diketahui kondisi optimum enzim seperti pH , suhu, dan waktu optimum. Pada percobaan ini akan dipelajari aktifitas enzim lipase pada perubahan waktu kontak dan suhu terhadap hidrolisis lipid. Aktivitas lipase ini dihitung berdasarkan kemampuan enzim ini untuk menghidrolisa minyak menjdi asam lemak dan gliserol yang setara dengan jumlah mmol KOH 0,5 N pada kondisi reaksi tertentu tertentu (tim biokimia, 2018 : 11). Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme yang terjadi pada organisasi hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang menunjang berbagai proses industri. Hal ini disebabkan enzim mempunyai efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak menimbulkan produk samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik a mobilisasi (Lehninger, 1995). Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas y ang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang pro duksi enzim secara maksimal adalah pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979). Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat. Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan non pangan.
Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester pada lemak dan g liserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih, 2004). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi (Dosanjh dan Kaur, 2002). Pemanfaatan enzim lipase di dalam industri pangan maupun non pangan semakin meningkat. Pada industri pangan, lipase banyak digunakan dalam industri susu (hidrolisis lemak susu), industri roti dan kue (meningkatkan aroma dan memperpanjang umur simpan), industri bir (meningkatkan aroma dan mempercepat fermentasi), industri bumbu (meningkatkan kualitas/tekstur), serta pengolahan daging dan ikan (meningkatkan aroma dan mengubah lemak). Sedangkan pada industri non pangan, lipase digunakan pada industri kimia dan obat-obatan (transesterifikasi minyak alami), industri oleokimia (hidrolisis lemak/minyak), industri detergen (melarutkan spot minyak/lemak), industri obat-obatan (mempermudah daya cerna minyak/lemak dalam pangan), kedokteran (analisis tr igliserida dalam darah), industri kosmetik (mengubah lemak), dan industri kulit (mengubah lemak dalam jaringan lemak). Pemanfaatan lipase pada industri lemak dan m inyak untuk mengubah bentuk fisik dan k imia minyak dan lemak alami menjadi produk yang bernilai tambah lebih tinggi (sumarsi, 2004). Lipase diklasifikasikan sebagai enzim hidrolase yang menghidrolisis trigliserida menjadi asam lemak bebas, gliserida parsial (monogliserida), digliserida dan gliserida (Macrae, 1983). Aplikasi lipase untuk hidrolisis, interesterifikasi dan esterifikasi telah menjadi objek penelitian, dengan perhatian utama pada aplikasi m inyak dan lemak. Lipase dapat digunakan dengan baik sebagai biokatalis dalam proses biologis (Dosanjh and Kaur, 2002). Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak rantai panjang. Pada penyiapan sampel dilakukan penambahan asam oleat. Asam ini berfungsi sebagai emulgator dari substrat karena asam oleat sendiri memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofi lnya akan berikatan dengan enzim. Hal ini sesuai dengan sifat enzim lipase yang memang larut dalam air. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Sayangnya enzim ini sedikit sulit untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah.
Aktivitas enzim ini dapat diukur dengan dua metoda, Pada metoda perubahan pH tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai regresi dan juga nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap. Metode ini mengukur langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan kedalam larutan lewat perubahan pH. Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah asam. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka aktifitas lipase dalam memprosuksi asam lemak telah berhenti. Perubahan pH yang tidak signifikan inilah yang membuat galat pengukuran menjadi besar (mitsuda, 1989).
D. ALAT DAN BAHAN Alat :
Erlenmeyer 100 ml
2 buah
Buret 50 ml lengkap
1 set
Tabung reaksi
12 buah
Rak tabung reaksi
1 set
Water batch
1 set
Batang pengaduk
1 buah
Lumpang
1 set
Gelas kimia 50 ml
1 buah
Gelas piala 250 ml
1 buah
Pipet takar 10 ml
1 buah
Pipet tetes
1 buah
Penjepit tabung reaksi
1 buah
Botol semprot
1 buah
Gelas ukur 25 ml
1 buah
bahan :
Kacang tanah 50% (B/V)
Minyak
sampel jenuh gum arab
buffer fospat Ph 6,8
larutan KOH 0,5 N
indikator phenol ptalein
reagen biuret
aquades
E. PROSEDUR KERJA
(ekstraksi crude lipase ) Kacan
50 ml aquades
digerus hingga menjadi pasta pasta
panaskan dengan menggunakan pelarut air pasta encer di sentrifuse pada 300 rpm selama 20 menit cream air residu dibuang uji dengan rwagen biuret (pembuatan 37,5 gum arab
emulsi minyak) 37,5 minyak 75 mlaquades
(Blender kurang lebih 15 menit ) (penentuan
aktifitas enzim lipase terhadap waktu) Sediakan 12 gelas kimia (masing- masing beri label) Tambahkan kedalam masing- masing tabung sesuai skema berikut 5 ml buffer posfat ph 6,8
5 ml enzim amilase
5 ml emulsi minyak
Tabung
Prosedur Inkubasikan 370C
Dipanaskan suhu 1000C
(menit)
(menit)
1 a, b
5
-
2 a, b
10
-
3 a, b
15
-
4 a, b
20
-
5 a, b
25
-
6 a, b
-
15
Titrasi dengan KOH 0,5 N dengan indikator pp F.
TABEL PENGAMATAN Tabung
Waktu inkubasi (menit)
Volume KOH (ml)
1a
5
0,7
1b
5
0,4
2a
10
0,8
2b
10
0,7
3a
15
0,9
3b
15
1
4a
20
1
4b
20
1,1
5a
25
1,1
5b
25
1,1
6a
15
1,2
6b
15
1,4
G. PERHITUNGAN
1. Tabung 1
5. Tabung
V KOH = o,7 ml + 0,4 ml / 2 = 0,55 ml Mmol KOH = 0,5 M x 0,55 ML
V KOH = 1,1 ml + 1,1 ml / 2 = 1, 1 ml mmol KOH = 0,5 M x 1,1 ml
= 0,275 mmol 2. Tabung 2
6. Tabung 6
V KOH = 0,8 ml + 0,7 ml/ 2 = 0,75 ml Mmol KOH = 0,5 M x 0,75ml = 0,375 mmol 3. Tabung 3 V KOH = 0,9 ml + 1 ml/ 2 = 0,95 ml Mmol KOH = 0,5 M x 0,95ml = 0,475 mmol 4. Tabung 4 V KOH = 1 ml + 1,1 ml/ 2 = 1, 05 ml Mmol KOH = 0,5 M x 1,05ml = 0,525 mmol
H. PEMBAHASAN
= 0,55 mmol
V KOH = 1,2 ml + 1,4 ml / 2 = 1,3 ml mmol KOH = 0,5 M x 1,3 = 0,65 mmol
Pada praktikum kali ini, percobaan yang dilakukan tentang penentuan aktivitas enzim lipase. Dimana percobaan ini bertujuan untuk melakukan penentuan aktivitas enzim lipase yang terdapat pada kacang- kacangan. Pada percobaan pertama hal yang dilakukan yaitu ekstraksi crude lipase. Bahan yang digunakan adalah kacang tanah, dari kacang tanah inilah enzim lipase dihasilkan. Dimana kacang tanah dihaluskan dan ditambahkan air hingga berbentuk pasta. Pasta kacang ini kemudian disentrifuge untuk memisahkan komponennya. Setelah disentrifuge terdapat 3 lapisan pada pasta tadi, dimana lapisan paling atas yang berupa cream adalah enzim lipasenya, lapisan kedua adalah air, dan lapisan ketiga adalah residu. Ketiga lapisan ini dipisahkan dengan pipet tetes. Residu yang telah dipisahkan di uji dengan reagen biuret untuk melihat apakah masih terdapat enzim lipase dalam kacang tersebut. Uji positif dari dari residu yang ditambahkan reagen biuret ini adalah warna ungu. Setelah ditambahkan reagen biuret, residu yang tadi berwarna putih menjadi warnah hijau lumut. Hal ini menunjukkan hasil negatif, artinya pada kacang tanah berhasil disentrifuge. Selanjutnya dilakukan pembuatan emulsi minyak. Bahan yang digunakan adalah minyak yang ditambahkan gum arab dan air. Emulsi minyak ini akan digunakan untuk pengujian aktivitas enzim lipase, dimana miyak akan dihidrolisis menjadi asam lemak dan gliserol. Penambahan gum arab berfungsi sebagai pengemulsi minyak. Setelah enzim lipase dan emulsi minyak disiapkan, barulah kita mulai melakukan pengujian aktivitas enzim lipase terhadap waktu. 5 ml emulsi minyak ditambahkan buffet fospat ph 6,8 kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C. Penambahan buffer fospat bertujuan untuk mempertahankan kondisi enzim agar nantinya tidak terjadi perubahan ph dan mencegah terjadinya denaturasi atau inakativasi enzim. Selain itu inkubasi dilakukan pada suhu 37 0C karena enzim bekerja optimal pada suhu tersebut. Waktu inkubasi juga difariasikan yaitu 5 menit, 10 menit, 15 menit, 20 menit dan 25 menit. Variasi waktu ini bertujuan agar kita dapat melihat perbedaan aktivasi enzimnya. Setelah dilakukan pengujian inkubasi pada suhu 37 0C dengan waktu yang berbeda, juga dilakukan pemanasan enzim lipase yang telah ditambahkan emulsi minyak dan buffer fospat pada suhu 1000C. Dari pengujian ini kita dapat melihat pengaruh suhu pada aktivitas enzim lipase. Tabung yang telah ditambahkan enzim lipase dan diinkubasi dengan variasi waktu berbeda kemudian di titrasi dengan KOH 0,5 N yang terlebih dahulu ditambahkan indikator pp. Hal yang sama dilakukan juga pada tabung yang dipanaskan pada suhu 100 0C. Indikator pp berguna agar kita dapat melihat perubahan warna hingga tercapainya titik akhir titrasi. KOH (Dalam ml) yang dibutuhkan pada enzim lipase yang telah diinkubasi selama 5, 10, 15, 20 dan 25 menit berturut turut yaitu 0,55 ml; 0,75 ml; 0,95 ml; 1,05 ml; 1,1 ml ; 1,3 ml. Sedangkan pada enzim lipase yang dipanaskan hingga 100 0C KOH yang dibutuhkan sebanyak.
Dari volume KOH yang terpakai ini dapat ditentukan mol KOH dari aktivitas enzim lipase, dimana jumlah mol KOH sama dengan aktivitas enzim lipase. Dari hasil perhitungan didapatkan aktivitasenzim lipase selama 5, 10, 15, 20, dan 25 menit berturut- turut adalah 0,275 :0,375 ; 0,475 ; 0,525 dn 0, 55. Sedangkan pada suhu 1000C aktivitas enzim lipase yaitu 0, 65. Dari data tersebut didapatkan bahwa aktivitas enzim lipase terus meningkat hingga waktu mencapai 20 menit, aktivitas enzim berlangsung konstan hingga waktu 25 menit. Ini artinya pada waktu tersebut aktivitas enzim bekerja maksimum. Hal ini sesuai dengan teori karena pada suhu 1000C aktivitas enzim lipase menurun karena enzim mengalami denaturasi protein yang dapat merubah konformasi struktur molekul hingga enzim kehilangan sifat alamianya karena enzim bekerja di atas suhu optimumnya.
I.
JAWABAN PERTANYAAN 1. Pada percobaan ini, apa yang merupakan substrat? Jelaskan jawaban anda! Jawab : yang merupakan substrat adalah minyak. Karena pada percobaan ini kita menguji aktivitas enzim lipase, dimana enzim l ipase akan menghidrolisis minyak menjadi asam lemak dan gliserol 2. Jelaskan grafik yang diperoleh dari hasil percobaan! 3. Apa guna penambahan buffer fospt 6,8 pda percobaan ini Jawab : untuk mempertahankan kondisi enzim a gar tidak terjadi perubahan ph dan mencegah terjadinya denaturasi atau inaktivasi enzim. 4. Apa guna indikator pp Jawab : untuk melihat perubahan warna pada saat titrasi dan untuk menentukan titik akhir titrasi yang ditandai dengan munculnya warna pink.
J.
KESIMPULAN 1. Dalam percobaan ini salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah suhu dan waktu inkubasi 2. Aktivitas enzim lipase pada suhu 37 0C terus meningkat hingga waktu ingkubasi 20 menit sampai 25 menit yang berlangsung konstan.
DAFTAR PUSTAKA
Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12. Punjab University. Chandigarh. Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia I. Erlangga. Jakarta.
S. Mitsuda, S. Nabeshima, H. Hirhora, Appl. Microbiol. Biotechnol.1989, 31, 334 ± 337. Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya.
Tim biokimia. 2018. Penuntun Praktikum Biokimia. Padang : FMIPA UNP
Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York.
