LAPORAN PRAKTIKUM KI3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK PERCOBAAN 04 PENENTUAN AKTIVITAS HIDROLISIS LIPASE
Nama
: Aviv Sigit Cahyono
NIM
: 10513035
Kelompok
: Kelompok I
Tanggal Percobaan
: 15 Maret 2017
Tanggal Pengumpulan : 22 Maret 2017 Asisten
: Mieki
LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2017
Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase I Tujuan - Menentukan nilai aktivitas unit lipase dan nilai aktivitas total lipase II
Teori Dasar Enzim merupakan molekul biokatalisis yang banyak memberikan manfaat dan banyak digunakan pada reaksi yang terjadi pada makhluk hidup. Enzim sendiri dapat diklasifikasikan kedalam beberapa kelompok, antara lain: Hidrolase, Isomerase, Ligase atau Polimerase, Liase, Oxidoreductase, dan Transferase. Hidrolase merupakan kelompok enzim yang berguna untuk menghidrolisis substrat dari suatu enzim, salah contohnya adalah enzim lipase. Isomerase merupakan kelompok enzim yang digunakan untuk menyusun kembali suatu senyawa kedalam bentuk isomernya. Enzim ligase atau polymerase yang secara keseluruhan kelompok enzim ini berguna untuk menggabungkan 2 senyawa atau lebih. Kemudian enzim ligase merupakan enzim untuk memecah suatu senyawa yang kompleks menjadi lebih sederhana tanpa menggunakan air. Oxidoreduktase merupakan kelompok enzim yang berguna untuk mengkatalisis reaksi yang merupakan reaksi redoks. Enzim terakhir adalah transferase, merupakan kelompok enzim yang berguna untuk memindahkan suatu gugus dari molekul ke molekul yang lain. Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak rantai panjang. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Enzim lipase ini dapat memecah ikatan ester pada lemak sehingga menjadi asam lemak dan gliserol (Poedjiadi dan Supriyanti, 2007). Penentuan aktivitas hidrolisis dari ekstrak kasar lipase dilakukan dengan menggunakan substrat pNP-palmitat. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai enzim yang dapat melepaskan 1 μ mol pNP pr menit.
III
Data Pengamatan a Pembuatan Kurva Standar pNP
b
Konsentrasi
Absorbansi
0 1 2 3 4 5 6 7
0 0,085 0,152 0,219 0,304 0,376 0,427 0,474
Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase
Blanko (A) 0 0
Sampel (B) 0,188 0,209 Rata-rata
Kontrol (C) 0,134 0,191
Delta Absorbansi 0,054 0,018 0,036
Gambar 1. Larutan Penentuan Kurva Standar pNP
IV
Pengolahan Data a Pembuatan Kurva Standar pNP
Kurva Standar pNP 0.5
f(x) = 0.07x + 0.01 R² = 0.99
0.4 0.3
Absorbansi 0.2 0.1 0 0
1
2
3
4
[pNP]
5
6
7
8
b
Penentuan Aktivitas Hidrolisis Lipase A= A sampel − Akontrol A
A
1
2
¿ 0,188−0,134=0,054
¿ 0,209−0,191=0,018
Absorbansi rata-rata =
A 1+ A 2 2
=
0,054+0,018 2
= 0,036
Berdasarkan persamaan yang diperoleh dari grafik A, yaitu: y = 0,0689x + 0,0136 dimana y merupakan nilai absorbansi dan x merupakan nilai [pNP] maka nilai [pNP] produk : 0,036=0,0689 x +0,0136 x=
0,036−0,0136 = 0,3251 0,0689
Unit aktivitas =
μ g/mL
[ produk ] x Vtotal Mr x 15 menit
μg x 1,2mL mL g 139,11 x 15 menit mol 0,3251
Unit aktivitas =
μmol Unit aktivitas = 0,0001869 menit
Unit
Digunakan 300
V
μ L = 0,3 mL
Aktivitas Total =
Unit aktivitas mL protein
Aktivitas Total =
0,0001869Unit 0,3 mL
Aktivitas Total =
6,23 x 10−4
Unit mL
Pembahasan Pada percobaan ini, dilakukan penentuan aktivitas hidrolisis lipase. Enzim lipase adalah enzim yang bekerja untuk menghidrolisis lemak dan minyak. Berdasarkan fungsi fisiologisnya enzim lipase mempunyai peranan penting menghidrolisis lemak dan minyak menjadi asam lemak dan gliserol yang dibutuhkan dalam proses metabolisme. Lipase merupakan kelas enzim hidrolase karena fungsinya untuk hidrolisis pNPP (para Nitro Phenol Palmitat) menjadi pNP (para Nitro Phenol) dan asam palmitat. Reaksi hidrolisis para Nitro Phenol Palmitat adalah sebagai berikut:
Enzim lipase memiliki sisi pusat aktif yang terdiri dari residu yaitu serin-histidinaspartat/glutamat yang dikenal dengan catalytic triads. Pada lipase, residu nukleofilik hampir selalu serin, sedangkan residu katalitik asam selau aspartat atau glutamat. Pada proses hidrolisis, lipase berikatan dengan gugus asil dari gliserida, sehingga membentuk kompleks lipase-asil. Gugus asil tersebut kemudian ditransfer ke gugus OH dari molekul air. Penentuan aktivitas hidrolisis dari ekstrak kasar lipase dilakukan dengan menggunakan substrat pNP-palmitat. Aktivitas enzim diukur berdasarkan perubahan absorbansi pada panjang gelombang 405 nm dengan menggunakan standar pNP. pNP-palmitat pada percobaan ini berfungsi sebagai substrat reaksi yang akan di hidrolisis oleh enzim lipase membentuk suatu produk, yakni: pNP dan asam palmitat. Etanol berfungsi sebagai pelarut substrat untuk membentuk kompleks lipase-asil. Sedangkan asetonitril juga sebagai pelarut substrat. Lipase merupakan enzim yang larut dalam air dan substratnya mengandung asam lemak, dimana asam lemak akan lebih larut dalam pelarut organik. Sehingga dengan digunakan etanol dan asetonitril yang dapat menjadi jembatan atau penghubung agar keduanya dapat larut. Lipase bekerja diantarmuka, yakni: mengkatalisis proses hidrolisis ikatan ester dari triasilgliserol pada daerah antarmuka minyak dan air. Sifat ini yang membedakan lipase dari kelas esterase yang hanya bekerja pada substrat larut air. Sedangkan lipase adalah enzim yang memecah ikatan ester pada lemak sehingga terjadi asam lemak dan gliserol. Adanya karakteristik interfacial activation menyebabkan terbentuknya lapisan antarmuka disekitar lingkungan lipase yang akan meningkatkan aktivitasnya. Peningkatan aktivitas lipase secara signifikan terjadi apabila substrat telah membentuk emulsi. Hal ini menunjukkan bahwa aktivitas lipase sangat bergantung adanya daerah antarmuka, sehingga lipase didefinisikan sebagai kaboksilesterase yang bereaksi terhadap substrat yang membentuk emulsi. Pada percobaan ini peran pNP-palmitat sebagai substrat dapat digantikan oleh substrat lain yang bias digunakan untuk menentukan aktivitas dari enzim lipase, misalnya olive oil. Agar lipase dapat bekerja dengan maksimum maka digunakan buffer glisin-NaOH yang dapat mempertahankan pH kerja enzim dan substrat agar tetap dalam rentang pH 9. Penentuan aktivitas hidrolisis lipase dimana sampel (B) dan kontrol (C) yang digunakan sebagai faktor koreksi. Pada kontrol (C) ditambahkan enzim kasar yang sudah dididihkan terlebih dahulu pada suhu 100 oC selama 30 menit. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan sifat katalitik dari enzim lipase dan agar dapat dilakukan pengukuran sampel dan membandingkan dari reaksi yang aktif enzim dan non aktif enzim. Dari percobaan yang telah dilakukan diperoleh nilai absorbansi untuk kontrol (C) memiliki nilai absorbansi yang lebih kecil dibandingkan dengan aktif enzim pada sampel (B). Hal ini menunjukkan non aktif enzim pada kontrol (C), dimana enzim lipase tidak membantu atau tidak terlibat dalam pembentukan pNP karena hilangnya sifat katalitik enzim. Kemudian dilakukan sentrifugasi yang bertujuan untuk mengendapkan berbagai protein yang ada di dalam
campuran atau pengotor yang tidak diinginkan agar tidak mempengaruhi pengukuran yang akan dilakukan. Pengukuran ini dilakukan pada panjang gelombang 405 nm karena pada panjang gelombang tersebut larutan menghasilkan nilai serapan maksimum. Aktivitas merupakan jumlah produk 1 μ mol pNP yang terbentuk persatuan waktu (menit). Dari aktivitas ini maka akan diperoleh nilai aktivitas unit dan aktivitas total. Berdasarkan hasil percobaan diperoleh nilai aktivitas unit lipase adalah 0,0001869
μmol menit . Sedangkan aktivitas total lipase adalah
−4
6,23 x 10
Unit mL . Aktivitas
enzim lipase dalam menghidrolisis pNP-palmitat memiliki aktivitas yang sangat kecil. Hal ini disebabkan pada saat pemanasan yang terlalu tinggi menyebabkan enzim dan substrat yang digunakan mengalami kerusakan sehingga tidak dapat bereaksi sempurna dan kurangnya ketelitian saat pengambilan jumlah larutan yang ditambahkan sehingga terjadi kesalahan dalam pengukuran yang dilakukan. VI
Kesimpulan Berdasakan hasil percobaan, nilai aktivitas unit lipase sebesar
0,0001869
μmol menit .
−4 Unit Sedangkan nilai aktivitas total lipase sebesar 6,23 x 10 mL .
VII
Daftar Pustaka Lehninger, A.L. 2008. Principles of Biochemistry, 5th ed. Worth Publisher, Inc. New York. Hal. 220-222. Poedjiadi, A., Supriyanti, F.M.T. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta Stryer, W. 2007. Biochemistry, 6th ed. W.H Freeman & Company. Halaman 302-357.
