Pemurnian Lipase Dari Bakteri

Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknologi-II 2008 Universitas Lampung, 17-18 November 2008

PEMURNIAN ENZIM LIPASE DARI BAKTERI LOKAL DAN APLIKASINYA DALAM REAKSI ESTERIFIKASI Nurhasanah dan Dian Herasari Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung Jl. S. Brojonegoro No. 1 Bandar Lampung e-mail : [email protected]

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian mengenai pemurnian enzim lipase dari bakteri lokal yang diisolasi dari air laut Pelabuhan Panjang. Proses pemurnian enzim enzim dilakukan secara bertingkat bertingkat dari ekstrak kasar, pemurnian pemurnian dengan amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kromatografi kolom. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa proses pemurnian enzim dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom meningkatkan aktivitas spesifik dari 0,059 U/mg untuk ekstrak kasar enzim menjadi 2,011 U/mg untuk fraksi amonium sulfat, 4,86 U/mg untuk dialisis dan 4,96 U/mg untuk hasil kromatografi kolom dengan tingkat kemurnian 84,07 kali. Enzim lipase hasil pemurnian memiliki karakteristik aktivitas optimum pada pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit dengan nilai K M = 0,07 mg substrat/ml dan V maks = 1,506 µmol minyak /ml enzim.menit. Enzim lipase yang didapat digunakan untuk mengkatalisis reaksi esterifikasi asam laurat dengan alkohol. Dari hasil pengamatan yang dilakukan aktivitas esterifikasi enzim lipase juga mengalami peningkatan seiring dengan bertambahnya kemurnian enzim yaitu dari 2,38 mmol/ml enzim.menit untuk ekstrak kasar, menjadi 3,81 mmol/ml enzim.menit untuk fraksi amonium sulfat, sulfat, selanjutnya meningkat kembali kembali menjadi 4,29 mmol/ml enzim.menit enzim.menit untuk dialisis dan 5,24 mmol/ml enzim.menit untuk hasil kromatografi kolom. Key word : pemurnian, lipase, bakteri isolat lokal, esterifikasi

1. PENDAHULUAN

Enzim adalah golongan protein yang disintesis oleh sel hidup dan mempunyai fungsi penting sebagai katalisator dalam setiap reaksi metabolisme yang terjadi pada organisasi hidup. Enzim juga merupakan biokatalisator yang menunjang berbagai proses industri. Hal ini disebabkan enzim mempunyai efisiensi dan efektifitas yang tinggi, reaksinya tidak menimbulkan produk samping, serta dapat digunakan berulangkali dengan teknik amobilisasi (Lehninger, 1995) Untuk memproduksi enzim dalam jumlah besar dan mempunyai aktivitas yang tinggi, perlu diperhatikan faktor-faktor penting seperti kondisi pertumbuhan, cara isolasi, serta jenis substrat yang digunakan. Kondisi pertumbuhan yang menunjang produksi enzim secara maksimal adalah pH, suhu inkubasi, waktu inkubasi, dan komposisi media pertumbuhan harus mengandung sumber energi, sumber karbon, sumber nitrogen dan mineral (Wang, 1979).

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-267


Pengunaan enzim dalam bioteknologi modern semakin berkembang secara cepat. Banyak industri-industri yang telah memanfaatkan kerja enzim, meliputi industri pangan dan non pangan. Salah satu jenis enzim yang mempunyai peran penting dan tidak ada bandingan dalam pertumbuhan bioteknologi adalah enzim lipase. Enzim ini memiliki sifat khusus dapat memecahkan ikatan ester pada lemak dan gliserol. Selain itu, lipase mempunyai kemampuan mengkatalis reaksi organik baik didalam media berair maupun dalam media non air (Sumarsih, 2004). Enzim lipase sangat berperan dalam pemisahan asam lemak dan pelarutan noda minyak pada alat industri agar minyak dapat dilarutkan dalam air. Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh enzim lipase diantaranya adalah reaksi hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi,dan interesterifikasi (Dosanjh dan Kaur, 2002). Disamping dari tanaman dan hewan, dewasa ini lipase mulai diproduksi dari berbagai mikroorganisme. Keuntungan memproduksi enzim dari mikroorganisme menurut Suhartono (1989) adalah produksi enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruangan yang relatif terbatas. Bakteri merupakan salah satu mikroorganisme mikroorganisme yang dapat menghasilkan menghasilkan enzim lipase, karena bakteri memiliki kemampuan hidup di berbagai lingkungan yang terdapat kandungan makanan atau nutrisi yang kompleks. Bakteri isolat lokal yang digunakan pada penelitian ini terbukti mampu menghasilkan enzim lipase. Bakteri ini diperoleh dari air laut Pelabuhan Panjang, Telukbetung Selatan, Bandar Lampung. Lampung. Bakteri ini memiliki pertumbuhan optimum yaitu pada temperatur 35ºC, waktu inkubasi 24 jam, pH 8, dan dengan komposisi media fermentasi 10% minyak zaitun, 1% pepton, dan 5% gum arab. Dalam penelitian ini dilakukan pemurnian enzim lipase dan diuji aktivitasnya serta ditentukan karakternya.

Enzim lipase yang didapat selanjutnya diaplikasikan untuk

mengkatalisis reaksi esterifikasi asam laurat dengan alkohol.

2. METODE PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan di laboratorium biokimia, laboratorium instrumentasi dan laboratorium mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung, Bandar Lampung. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf model S-90N, Laminar Air Flow, sentrifuga, inkubator, shaker inkubator, neraca analitik, penangas air, lemari pendingin, kolom kromatografi, buret, kantong selofan, membran selulosa, oven, waterbath, vakum, vortex dan alat-alat gelas lainnya. Bahan-bahan kimia yang digunakan digunakan adalah bakteri isolat lokal yang telah diisolasi dari air laut Pelabuhan Panjang, Nutrien Agar (NA), pepton, gum arab, minyak zaitun, aquades, membran selulosa, (NH 4)2SO4, larutan campuran aseton dan etanol (1:1), Fenolftalein 1%,

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-268


larutan NaOH 0,05N dan 0,1N, sephadex G-100, buffer fosfat pH 8, Na 2CO3, CuSO4.5H2O, NaK Tartarat, Reagen Folin Ciocalteau, cupric asetat 5% pH 6-6,2, larutan BSA, asam laurat, lauril alkohol dan heksan.

2.1 Produksi enzim

Produksi enzim lipase dilakukan dengan cara yaitu, 100 ml inokulum dimasukkan pada erlenmeyer 1000 ml yang berisi media fermentasi kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan pH 8 dan suhu 35ºC. Setelah itu dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Filtrat hasil sentrifugasi disebut ekstrak enzim kasar. Ekstrak kasar tersebut kemudian dipisahkan dari endapannya kemudian ditentukan volume, kadar protein dengan Metode Lowry, aktivitasnya dengan Metode titrimetri, dan uji esterifikasi.

2.2 Pemurnian Enzim a. Fraksinasi Amonium Sulfat

Proses pemurnian sampel ekstrak kasar enzim lipase diawali dengan fraksinasi bertingkat menggunakan garam ammonium sulfat dengan tingkat kejenuhan (0-20%), (20-40%), (40-60%), (60-80%) dan 80-100%). 80-100%).

Fraksinasi dengan amonium sulfat dilakukan dengan cara

menambahkan amonium sulfat sedikit demi sedikit pada larutan ekstrak kasar enzim sambil diaduk dengan pengaduk magnet. Pengadukan diusahakan sedemikian rupa sehingga tidak menimbulkan busa selama kurang kurang lebih 20 menit. Setiap endapan protein enzim yang didapat dipisahkan dari filtratnya dengan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 15 menit kemudian dilarutkan dalam larutan buffer fosfat pH 8 dengan konsentrasi 0,05 M lalu diuji

aktivitasnya

menggunakan

Metode

titrimetri

dan

ditentukan

kadar

proteinnya

menggunakan Metode Lowry. Fraksi yang memberi aktivitas tertinggi diuji aktivitas esterifikasinya.

b. Dialisis

Endapan enzim hasil fraksinasi bertingkat yang memiliki aktivitas tertinggi dilarutkan ke dalam buffer fosfat pH 8; 0,05 M selanjutnya dimasukkan kedalam kantong selofan, kemudian didialisis menggunakan buffer fosfat pH 8; 0,05 M selama ± 48 jam pada suhu 4ºC.

c.

Kromatografi Kolom

Perlakuan enzim selanjutnya adalah pemurnian berdasarkan ukuran dengan kolom kromatografi filtrasi gel menggunakan sephadex G-100 sebagai fase diam. Sampel diteteskan pada bagian atas kolom gel sephadex G-100 yang berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 8 yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel enzim yang

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-269


memiliki bobot molekul lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah proses kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah sebesar 15 ml. Eluen yang telah ditampung pada wadah kemudian diukur kadar protein dan

aktivitas enzimnya.

Fraksi yang memberikan

aktivitas tinggi dikumpulkan dan dikarakterisasi serta ditentukan aktivitas esterifikasinya.

2.2 Karakterisasi enzim lipase a. Penentuan temperatur optimum

Untuk mengetahui suhu optimum dari enzim yang telah dimurnikan dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan menggunakan variasi suhu i nkubasi enzim (30,35, 40, 45 dan 50) C. °

b. Penentuan pH optimum

Untuk mengetahui pH optimum dari enzim yang telah dimurnikan, dilakukanpengukuran aktivitas enzim dengan menggunakan variasi nilai pH (6, 7, 8, 9 dan 10)

c.

Penentuan waktu inkubasi optimum

Untuk mengetahui waktu inkubasi optimum dari enzim yang telah dimurnikan, dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan menggunakan variasi waktu (5, 10, 15, 20, 25, 30) menit.

d.

Penentuan nilai Km dan Vm

Enzim yang telah dimurnikan ditentukan nilai Km dan Vm dengan menggunakan pengukuran aktivitas enzim pada konsentrasi substratnya (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4)%. Dari data aktivitas enzim dan konsentrasi substrat ditentukan nilai Km dan Vm.

2.3 Uji aktivitas enzim lipase

Untuk menentukan aktivitas enzim menggunakan metode titrimetri yaitu, sebanyak 2 ml minyak zaitun dalam erlenmeyer 100 ml, ditambah 1 ml buffer fosfat 0,05 M (pH 8), dan 1 ml larutan enzim. Campuran substrat enzim ini kemudian dikocok menggunakan shaker inkubator pada 30 C selama 1 jam. Setelah 1 jam substrat enzim diinaktifkan dengan menggunakan °

campuran

aseton : etanol (1:1) sebanyak 1 ml. ml. Campuran tersebut ditambahkan 5 tetes

fenolftalein 1% sebagai indikator dan dititrasi dengan menggunakan larutan NaOH 0,05 N. Titrasi dihentikan setelah campuran berubah menjadi merah muda. Pengukuran aktivitas dilakukan secara duplo.

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-270


Untuk penentuan standar dilakukan dengan komposisi campuran yang sama, t etapi pada saat dimasukkan larutan enzim dengan segera ditambahkan campuran aseton : etanol untuk menginaktifkan enzim. Kemudian dititrasi dengan prosedur yang sama dengan analisis sampel.

2.4

Penentuan Kadar Protein

Sebanyak 0,1 ml larutan enzim ditambahkan 0,9 ml aquades direaksikan dengan 5 ml larutan C. Larutan didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar, kemudian ditambahkan reagen Folin-Ciocelteau sebanyak 0,5 ml. Larutan dibiarkan selama 30 menit pada suhu kamar. Warna

yang terbentuk dibaca serapannya pada panjang gelombang 740 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan kurva standar Bovin serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0-800 ppm.

2.5

Uji Aktivitas Esterifikasi

Pengukuran aktivitas esterifikasi dilakukan menggunakan Metode Hariyadi (1995) dalam Efendi (2001) yaitu dengan cara mengesterkan 0,2 M asam laurat dan 0,2 M lauril alkohol didalam tabung reaksi bertutup, masing-masing sebanyak 5 ml. Selanjutnya di inkubasi pada suhu 50°C selama 15 menit. Setelah suhu konstan, ditambahkan enzim sebanyak 0,1 ml kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 50°C. Selama reaksi esterifikasi berlangsung dilakukan pengadukan dengan stirer agar reaksi berjalan lebih baik. Untuk mempertahankan suhu yang konstan, esterifikasi dilakukan menggunakan circulated water bath. Media pemanas yang digunakan adalah aliran air yang terus berputar secara kontinyu (Nuraida, 2000 dan Suhendra, 2004). Setelah reaksi esterifikasi selesai, hasil reaksi segera disaring dengan membran selulosa 0,45 μm untuk memisahkan enzim. Filtrat yang telah terpisah dari enzim, dianalisis kandungan asam lemak bebas (ALB). Untuk pengukuran asam lemak bebas menggunakan Metode Lowry dan Tinsley yang dimodifikasi. Filtrat yang diperoleh diambil sebanyak 0,4 ml dan dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 4,6 ml heksan. Setelah itu dihomogenkan menggunakan vortex 30 detik yang dilanjutkan dengan penambahan 1 ml cupric asetat pH 6-6,2 sebagai pewarna. Kemudian dihomogenkan kembali selama 2 menit dan diinkubasikan selama 15 menit. Lapisan atas filtrat diambil dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 715 nm. (kurva standar dibuat dengan menggunakan asam laurat 0-100 mmol).

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-271


3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1

Produksi dan Pemurnian Enzim Lipase dari Bakteri Isolat Lokal Lokal

Produksi enzim enzim lipase dari bakteri isolat lokal

diawali dengan penanaman bakteri

dalam media fermentasi yang terdiri dari komposisi gum arab 5%, pepton 1%, , minyak zaitun 10% dengan kondisi optimum pertumbuhan bakteri sebagai berikut: waktu inkubasi 24 jam, suhu 35°C, pH 8 (Anissa, 2006). Penanaman media fermentasi menggunakan kondisi optimum dilakukan untuk memperoleh enzim lipase dengan jumlah yang cukup besar. Setelah diinkubasi dalam media fermentasi selama 24 jam, enzim lipase dipisahkan dengan menggunakan alat sentrifuga dengan kecepatan 3500 rpm, 30 menit dan suhu 4 oC untuk mendapatkan ekstrak kasar enzim lipase.

Dari proses ini diperoleh ekstrak kasar enzim

sebanyak 985 mL dengan aktivitas unit rata-rata enzim hasil pengukuran duplo 0,21 U/ml, kadar protein 3,55 mg/ml, aktivitas spesifik 0,059 U/mg. Setelah didapat ekstrak kasar dilanjutkan dengan proses pemurnian enzim secara fraksinasi bertingkat menggunakan garam amonium sulfat. Fraksi tertinggi adalah fraksi ke V (80-100)% jenuh dengan aktivitas unit 3,5 U/ml, kadar protein 1,74 mg/ml dan aktivitas spesifik 2,011 U/mg. Fraksi tertinggi yang diperoleh ini ini selanjutnya didialisis menggunakan menggunakan bufer fosfat pH 8; 0,025 M. Enzim lipase hasil hasil dialisis fraksi fraksi ke V menunjukkan 2,04 U/ml, kadar protein 0,42 mg/ml.dan aktivitas spesifik 4,86 4,86 U/mg. Hasil ini memperlihatkan bahwa telah terjadi kenaikan sebesar 82,37 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan perolehan 31,48 %. Enzim lipase yang telah didialisis selanjutnya dimurnikan kembali dengan sephadex G100 secara kromatografi kolom, diperoleh 22 fraksi dimana fraksi 19 adalah fraksi tertinggi dengan aktivitas unit 2,83 U/ml, kadar protein 0,57 mg/ml dan aktivitas spesifik 4,96 U/mg. Dari 3 tahap pemurnian (fraksinasi, dialisis, dan kromatografi kolom) terlihat bahwa aktivitas spesifik meningkat yang disebabkan oleh peningkatan kemurnian enzim. Aktivitas spesifik enzim dipengaruhi oleh kadar protein, semakin tinggi aktivitas spesifik suatu enzim maka semakin tinggi kemurnian enzim tersebut. Hal ini menunjukkan terjadinya pemisahan protein lain yang bukan enzim. Dengan meningkatnya aktivitas spesifik pada tiap tahap pemurnian, menunjukkan bahwa proses pemurnian yang dilakukan cukup baik.

3.2

Karakterisasi Enzim

Fraksi yang digunakan untuk tahap karakterisasi enzim adalah fraksi yang mempunyai aktivitas unit tertinggi. Selanjutnya dilakukan karakterisasi enzim yang meliputi pH, temperatur, waktu inkubasi, Km dan Vm. 1. pH Optimum

Untuk menentukan pH optimum enzim hasil isolasi, variasi pH yang digunakan adalah 6, 7, 8, 9, dan 10 hasilnya tertera pada Gambar 1. Dari gambar tersebut terlihat bahwa aktivitas lipase ISBN : 978-979-1165-74-7

III-272


bervariasi dengan adanya perubahan pH. Hal ini umumnya terjadi karena adanya perubahan struktur sekunder dan tersier dari enzim. Pada pH yang optimum muatan gugus samping asam amino berada pada keadaan yang sesuai sehingga enzim sangat efisien dalam mempercepat reaksi biokimia yang sangat spesifik. Aktivitas optimum lipase dicapai pada pH 8. Hal ini disebabkan karena pada kondisi pH 8 gugus pemberi dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada keadaan yang diinginkan sehingga aktivitas katalitiknya ti nggi. ) l 0.2 m / U ( 0.15 t i n U 0.1 s a t i 0.05 v i t k 00 A 5

6

7

8

9

10

11

Gambar 1. Penentuan Optimum pH pH Optimum 2. Temperatur Optimum Gambar 1. Penentuan pH Optimum

Pada penentuan temperatur optimum, suhu yang digunakan adalah 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, dan 50°C. Dari hasil pengujian yang dilakukan temperatur optimum lipase adalah 45°C seperti yang tertera pada Gambar 2. Pada temperatur kurang dari 45°C enzim cukup stabil, tetapi hidrolisis substrat minyak zaitun oleh enzim tidak berjalan secara maksimal. Dengan meningkatnya temperatur, energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi bertambah sehingga molekul yang bereaksi semakin banyak dan produk yang dihasilkan semakin besar. Diatas temperatur optimum, aktivitas enzim menurun tajam hal ini terjadi karena enzim mengalami denaturasi protein yang dapat merubah konformasi struktur molekul sehingga enzim kehilangan sifat alamiahnya. Pada temperatur tinggi, tinggi, substrat juga dapat mengalami perubahan perubahan konformasi sehingga gugus reaktifnya mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim (Suhartono, 1989). Sedangkan pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah. Hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi tersebut dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik dari molekul enzim atau molekul substrat.

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-273


) 0.25 l m / 0.2 U ( t i 0.15 n U s 0.1 a t i v 0.05 i t k A 0

25

30

35

40

45

50

55

Tempe ratur ( C) C)

Gambar 2. Penentuan Temperatur Optimum

3.

Waktu Inkubasi optimum

Selain pH dan temperatur, waktu inkubasi juga mempengaruhi pembentukan produk. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan dengan pengujian enzim lipase pada berbagai waktu inkubasi, yaitu : 5, 10, 15, 20, 25, dan 30 menit. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase dapat dilihat pada Gambar 3. ) l m0,6 / U ( t i 0,4 n U s 0,2 a t i v 0 i t k A 0

5

10

15

20

25

30

35

Waktu (menit)

Gambar 3. Penentuan waktu inkubasi optimum Gambar 3. Pengaruh waktu inkubasi terhadap aktivitas enzim lipase

Berdasarkan pada Gambar 3, aktivitas lipase optimum pada waktu inkubasi 10 menit. Pada waktu inkubasi diatas 10 menit, enzim mulai mengalami penurunan aktivitas lipase. Hal ini dapat disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan oleh setiap enzim untuk bereaksi dengan substrat. Selain itu dengan panas 45°C enzim lipase tidak dapat terlalu lama bereaksi dengan substrat sehingga lipase mulai mengalami denaturasi.

4. Nilai Km dan Vm

Kecepatan reaksi enzim akan meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi substrat sampai pada suatu harga yang memberikan kecepatan reaksi tetap. Pada keadaan tersebut, kecepatan reaksi enzim mencapai maksimum karena reaksi enzim dengan substratnya ISBN : 978-979-1165-74-7

III-274


menjadi jenuh dan tidak dapat bereaksi lebih cepat. Harga K M dari suatu enzim berfungsi untuk mengetahui konsentrasi dari substrat yang menghasilkan setengah laju reaksi maksimum. Dari Gambar 4 dapat dilihat bahwa mula-mula aktivitas unit meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat, akan tetapi setelah tercapai aktivitas optimum terjadi penurunan aktivitas. Hal ini dikarenakan pada konsentrasi substrat optimum enzim berada pada keadaan “jenuh dengan substrat”. Selain itu, dapat juga disebabkan pengendalian umpan balik, dimana jika produk yang dihasilkan berlebih maka produk tersebut menjadi inhibisi bagi kerja enzim. ) 12 l m10 / U ( t 8 i n U 6 s a 4 t i v i t 2 k A 0

0

1

2

3

4

5

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas li pase Konsentrasi Substrat (%)

Gambar 4. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim lipase

Harga K M dihitung dengan mengukur aktivitas enzim lipase dalam berbagai konsentrasi substrat dengan pH, temperatur, dan waktu inkubasi optimum. Pada penelitian ini digunakan pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit. Harga K M enzim hasil isolasi adalah 0,07 mg substr substrat/ at/ml ml dan Vmaks sebesa sebesarr 1,506 1,506 µmol µmol miny minyak/ ak/ml ml enzim. enzim.men menit. it.

3.3 Uji Aktivitas Esterifikasi

Penentuan aktivitas esterifikasi dilakukan dengan mencampurkan asam laurat dan lauril alkohol sehingga akan dihasilkan ester dan air. Selain itu dalam penelitian ini juga digunakan pelarut heksana. Heksana merupakan pelarut organik non polar yang sering dan cocok digunakan dalam reaksi esterifikasi yang yang dikatalis oleh lipase. Selain itu menurut Basri et al.,(1995) aktivitas esterifikasi yang tinggi dari enzim lipase diperoleh dengan menggunakan

pelarut organik yang bersifat non polar karena pada pelarut hidrofobik, air cenderung akan berpartisi ke dalam molekul enzim sehingga akan meningkatkan kelarutan dan kestabilan enzim. Sementara itu aktivitasnya akan rendah pada penggunaan pelarut organik yang bersifat polar karena pelarut tersebut akan menarik sebagian air esensial dari molekul enzim. Dalam penelitian ini pengujian aktivitas esterifikasi dilakukan pada ekstrak kasar enzim, fraksi tertinggi ( Fraksi V) dari fraksinasi amonium sulfat, enzim hasil dialisis, dan ISBN : 978-979-1165-74-7

III-275


enzim hasil kromatografi kolom. Dari hasil penelitian diperoleh data bahwa aktivitas esterifikasi meningkat dari ekstrak kasar enzim sampai tahap pemurnian kromatografi kolom seperti yang terlihat pada Tabel 1. Dari Tabel 1 dapat dilihat bahwa aktivitas esterifikasi dari ekstrak kasar sampai dengan kromatografi kolom semakin meningkat. Hal ini dapat disebabkan semakin meningkat kemurnian enzim lipase maka makin meningkat juga aktivitas esterifikasi enzim lipase.

Tabel 1. Hasil Uji Aktivitas Esterifikasi Lipase Tahap

Aktivitas Esterifikasi (mmol/ml enzim.menit)

Ekstrak Kasar Enzim

2,38

Fraksi V (80-100)%

3,81

Dialisis

4,29

Kromatografi Kolom

5,24

Adanya protein lain yang bukan enzim dapat menghambat sehingga kerja enzim tidak maksimal dalam proses esterifikasi. Maka ketika dilakukan pemurnian, enzim telah terpisah dari protein lain yang bukan enzim sehingga dapat memaksimalkan proses esterifikasi.

4. KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa : 1. Proses pemurnian enzim dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi kolom meningkatkan aktivitas spesifik dari 0,059 U/mg untuk ekstrak kasar enzim menjadi 4,96 U/mg untuk hasil kromatografi kolom dengan tingkat kemurnian 84,07 kali. 2. Enzim lipase hasil karakterisasi mencapai aktivitas optimum pada pH 8, temperatur 45°C, dan waktu inkubasi 10 menit. Nilai K M enzim lipase hasil isolasi adalah 0,07 mg substrat/ml dan Vmaks = 1,506 µmol minyak/ml enzim.menit. 3. Aktivitas esterifikasi dari enzim hasil ekstrak kasar, fraksi amonium sulfat, dialisis dan kromatografi kolom meningkat dengan nilai berturut-turut ( 2,38; 3,81; 4,29; dan 5,24) mmol/ml enzim.menit 4. Enzim lipase yang didapat dari bakteri isolat lokal dapat digunakan pada reaksi esterifikasi asam laurat dan lauril alkohol.

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-276


UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Dirjen DIKTI yang telah mendanai penelitian ini sehingga penelitian dapat terlaksana dengan baik. Penulis juga menyampaikan ucapan terimakasih kepada saudari Neno Dwi Hariyanti, S.Si dan saudari Eka Yuliana, S.Si yang turut membantu pengerjaan dan pengolahan data dalam penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Annisa, Y. 2006. Studi Penentuan Aktivitas Enzim Lipase dari Bakteri Proteus vulgaris Galur Lokal PP-1 dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS dan Metode Titrimetri. Skripsi Sarjana Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung. Bandar Lampung. Basri, M., Ampon, K., Wan Yunus, W.M.Z., Razak, C.N.A., dan Saleh, A.B 1995. Enzymic Synthesis of Fatty Esters by Hydropobic Lipase Derivates Immobilized on Organic Polymer Beads. JAOCS 72(4):407-411.

Dosanjh, N.S., dan Kaur, J. 2002. Immobilization, Stability and esterification Studies of A Lipase From Bacillus sp. Journal Biotechnology and Applied Biochemistry. Vol. 36. Hlm 7-12. Punjab University. Chandigarh. Efendi, S. 2001. Karakterisasi Enzim Lipase Intraseluler dengan Aktivitas Esterifikasi dari Kpaang Rhizopus oryzae TR 32. Tesis. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bogor. Lehninger, A.L. 1995. Dasar-dasar Biokimia I. Erlangga. Jakarta. Nuraida, L. 2000. Eksplorasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dengan aktivitas Esterifikasi Tinggi dari Kapang Indigenus. Laporan Tahunan Pertama Penelitian Hibah Bersaing VIII/I Perguruan Tinggi. FATETA-IPB. Bogor. Sumarsih, S. 2002. Uji Aktivitas Lipolitik Beberapa Bakteri Hasil Isolasi dari Pelabuhan Tanjung Perak dan Produksi Lipase dari Strain Terpilih. JIPTUNAIR. Surabaya. Suhartono, M.T. 1989. Enzim dan Bioteknologi. PAU Bioteknologi IPB. Bogor. Suhendra, L., Trenggono, Hidayat, C. 2004. Aktifitas Hidrolisis dan Esterifikasi Lipase Ekstrak Kecambah Biji Wijen ( Sesamun Indicum). Prosiding Seminar Nasional dan Kongres Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan Indonesia (PATPI). Jakarta, 17-18 Desember 2004. Wang, I.C. 1979. Fermentation and Enzymes Technology. John Wiley and Sons. New York.

ISBN : 978-979-1165-74-7

III-277

Pemurnian Lipase Dari Bakteri

Recommend Documents