BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme adalah makhluk yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dibawah mikroskop. Di alam terdapat banyak mikroorganisme yang hidup. Mikroorganisme yang terdapat di alam tersebut terdapat dalam bentuk kumpulan massa sel atau koloni. Untuk mempelajari suatu jenis koloni dan sifat mikroorganisme tersebut, diperlukan teknik pembiakan mikroorganisme terlebih dahulu. Setelah di biakan, kita perlu menghitung atau menentukan banyaknya mikroba untuk mengetahui seberapa jauh sampel itu tercemar oleh mikroba. Didalam dunia mikrobiologi, dikenal beberapa istilah seperti inokulasi, kultur dan isolasi. Inokulasi adalah suatu usaha menumbuhkan mikroorganisme dari suatu sumber ke media pertumbuhan steril. Biakan bakteri tersebut disebut dengan kultur. Menghitung atau menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan (makanan, minuman, dan lain-lain) dilakukan untuk mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar tercemar oleh mikroba. mikroba. Dengan mengetahui mengetahui jumlah jumlah mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikrobiologi dari bahan tersebut. Bahan yang dapat dikatakan baik jika jumlah mikroba yang terkandung dalam bahan tersebut masih di bawah jumlah standar yang ditentukan oleh suatu lambaga. Salah satu jenis mikroorganisme adalah bakteri. Bakteri merupakan organisme uniselular yang tumbuh dengan cara pembelahan biner yaitu satu sel membelah secara simetris. Bakteri tidak dapat dilihat dengan mudah secara kasat mata. Namun, pada kenyataannya bakteri bisa berada di manapun termasuk pada makanan maupun dalam tubuh manusia termasuk pada saluran ekskresi. Urin atau air seni atau air kencing adalah cairan sisa yang d iekskresikan oleh ginjal yang kemudian akan dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Eksreksi urin diperlukan untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah
1
yang disaring oleh ginjal dan untuk menjaga homeostasis cairan tubuh. Urin disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter menuju kandung kemih, akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Urin terdiri dari air dengan bahan terlarut berupa sisa metabolisme (seperti urea), urea), garam terlarut, dan materi organik. Normalnya, air seni (urin) itu steril atau bebas dari kuman (bakteri), virus, dan jamur, namun mengandung cairan, garam, dan zat-zat sisa. Infeksi pada saluran kemih terjadi bila organisme mikro, biasanya bakteri dari saluran cerna, berpindah ke ujung saluran kemih (utetra) yang terbuka dan mulai berkembangbiak. Uretra adalah saluran yang mengalirkan urin dari kandung kemih keluar tubuh. Maka dari itu, percobaan teknik pembiakan mikroorganisme dan penentuan angka kuman sangat penting dilakukan untuk mengetahui banyaknya jumlah bakteri atau kuman yang terdapat pada urin sehingga nantinya akan dapat diketahui kondisi kesehatan seseorang tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah teknik penanaman bakteri (inokulasi) pada sampel urine dengan metode tuang? 2. Bagaimanakah teknik penghitungan angka kuman pada sampel urine? 3. Bagaimanakah hasil penghitungan angka kuman yang dilakukan pada sampel urine?
1.3 Tujuan 1.3.1 Tujuan Umum
Mahasiswa dapat malakukan penanaman bakteri (inokulasi) pada sampel urine untuk kemudian melakukan penghitungan angka kuman terhadap sampel urine tersebut sehingga hasilnya dapat diugunakan sebagai diagnosis terhadap kondisi kesehatan seseorang.
2
yang disaring oleh ginjal dan untuk menjaga homeostasis cairan tubuh. Urin disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter menuju kandung kemih, akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Urin terdiri dari air dengan bahan terlarut berupa sisa metabolisme (seperti urea), urea), garam terlarut, dan materi organik. Normalnya, air seni (urin) itu steril atau bebas dari kuman (bakteri), virus, dan jamur, namun mengandung cairan, garam, dan zat-zat sisa. Infeksi pada saluran kemih terjadi bila organisme mikro, biasanya bakteri dari saluran cerna, berpindah ke ujung saluran kemih (utetra) yang terbuka dan mulai berkembangbiak. Uretra adalah saluran yang mengalirkan urin dari kandung kemih keluar tubuh. Maka dari itu, percobaan teknik pembiakan mikroorganisme dan penentuan angka kuman sangat penting dilakukan untuk mengetahui banyaknya jumlah bakteri atau kuman yang terdapat pada urin sehingga nantinya akan dapat diketahui kondisi kesehatan seseorang tersebut.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah teknik penanaman bakteri (inokulasi) pada sampel urine dengan metode tuang? 2. Bagaimanakah teknik penghitungan angka kuman pada sampel urine? 3. Bagaimanakah hasil penghitungan angka kuman yang dilakukan pada sampel urine?
1.3 Tujuan 1.3.1 Tujuan Umum
Mahasiswa dapat malakukan penanaman bakteri (inokulasi) pada sampel urine untuk kemudian melakukan penghitungan angka kuman terhadap sampel urine tersebut sehingga hasilnya dapat diugunakan sebagai diagnosis terhadap kondisi kesehatan seseorang.
2
1.3.2 Tujuan Khusus
1. Untuk mengetaui teknik penanaman (inokulasi) bakteri pada sampel urine dengan metode tuang. 2. Untuk mengetahui teknik pnghitungan angka kuman pada sampel urine. 3. Untuk mengetahui hasil penghitungan angka kuman yang dilakukan pada sampel urine?
1.4 Manfaat 1.4.1 Manfaat Praktis
Dari praktikum ini diharapkan akan dapat bermanfaat bagi mahasiswa sehingga dapat menambah keterampilan mahasiswa dalam teknik penanaman (inokulasi) bakteri dan penghitungan angka kuman pada urine. 1.4.2 Manfaat Teoritis
1.
Memperluas pengetahuan mahasiswa khususnya mengenai teknik penanaman (inokulasi) bakteri dan teknik penghitungan angka kuman pada urine.
2.
Menjadi referensi di bidang keilmuan khususnya mikrobiologi dalam hal teknik penanaman (inokulasi) bakteri dan teknik penghitungan angka kuman.
3
BAB II DASAR TEORI
2.1 Urine
Urin atau air seni atau air kencing adalah cairan sisa yang d iekskresikan oleh ginjal yang kemudian akan dikeluarkan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Eksreksi urin diperlukan untuk membuang molekul-molekul sisa dalam darah yang disaring oleh ginjal dan untuk menjaga homeostasis cairan tubuh. Urin disaring di dalam ginjal, dibawa melalui ureter menuju kandung kemih, akhirnya dibuang keluar tubuh melalui uretra. Fungsi utama urin adalah untuk membuang zat sisa seperti racun atau obat-obatan dari dalam tubuh. (Wikipedia,2012) 2.1.1
Sifat Fisis Urine
Sifat fisis urine terdiri dari: 1. Jumlah ekskresi dalam 24 jam ±1.500 cc tergantung dari pemasukan (intake) cairan dan factor lainnya. 2. Warna, bening dan bila dibiarka akan menjadi keruh. 3. Warna, kuning tergantung kepekatan, diet, obat-obatan dan sebagainya. 4. Bau, bau khas air kemih bila dibiarkan lama akan berbau amoniak. 5. Berat jenis 1,015-1,020. 6. Reaksi asam, bila lama-lama menjadi alkalis, juga tergantung pada diet (sayur menyebabkan reaksi alkalis dan protein menjadi reaksi asam. (Syaifuddin,1992) 2.1.2
Komposisi Urine
1. Urine terdiri dari kira-kira 95% air. 2. Zat-zat hasil nitrogen dan hasil metabolisme protein, asam urea, amoniak, dan kreatinin. 3. Elektrolit, natrium, kalsium, NH3, bikarbonat, fosfat, dan sulfat. 4. Pigmen (bilirubin, urobilin) 5. Toksin.
4
6. Hormon. (Syaifuddin,1992) 2.1.3
Ciri-Ciri Urine Normal
Rata-rata dalam satu hari 1-2 liter, tapi berbeda-beda sesuai jumlah cairan yang masuk. Warnanya bening oranye pucat tanpa endapan, baunya tajam, reaksinya sedikit asam terhadap lakmus dengan pH rata-rata 6.(Syaifuddin,1992) Normalnya, air seni (urin) itu steril atau bebas dari kuman (bakteri), virus, dan jamur, namun mengandung cairan, garam, dan zat-zat sisa. Infeksi pada saluran kemih terjadi bila organisme mikro, biasanya bakteri dari saluran cerna, berpindah ke ujung saluran kemih (utetra) yang terbuka dan mulai berkembangbiak. Uretra adalah saluran yang mengalirkan urin dari kandung kemih keluar tubuh. Sebagian besar infeksi disebabkan oleh satu tipe bakteri, Escherichia coli (E. coli), yang normalnya hidup di usus besar. (www.permatacibubur.com/en/see.php?id=Nov02-1f&lang=id) 2.1.4
Pengambilan Sampel Urine
Bahan urin untuk pemeriksaaan harus segar dan sebaiknya diambil pagi hari. Bahan urin dapat diambil dengan cara punksi suprapubik ( suprapubic puncture=spp), dari kateter dan urin porsi tengah ( midstream urine). Bahan urin yang paling mudah diperoleh adalah urin porsi tengah yang ditampung dalam wadah bermulut lebar dan steril. 1. Punksi Suprapubik
Pengambilan urin dengan punksi suprapubik dilakukan pengambilan urin langsung dari kandung kemih melalui kulit dan dinding perut dengan semprit dan jarum steril. Yang penting pada punksi suprapubik ini adalah tindakan antisepsis yang baik pada daerah yang akan ditusuk, anestesi lokal pada daerah yang akan ditusuk dan keadaan asepsis harus selalu dijaga. Bila keadaan asepsis baik, maka bakteri apapun dan berapapun jumlah koloni yang tumbuh
pada
biakan,
dapat
dipastikan
merupakan
penyebab
ISK.
(http://majalahkesehatan.com/infeksi-saluran-kemih-isk/)
5
2. Kateter
Bahan urin dapat diambil dari kateter dengan jarum dan semprit yang steril. Pada cara ini juga penting tindakan antisepsis pada daerah kateter yang akan ditusuk dan keadaan asepsis harus elalu dijaga. Tempat penusukan kateter sebaiknya sedekat mungkin dengan ujung kateter yang berada di dalam kandung kemih (ujung distal). Penilaian urin yang diperoleh dari kateter sama dengan hasil biakan urin yang diperoleh dari punksi suprapubik. (http://majalahkesehatan.com/infeksi-saluran-kemih-isk/) 3. Urine Porsi Tengah
Urin porsi tengah sebagai sampel pemeriksaan urinalisis merupakan teknik pengambilan yang paling sering dilakukan dan tidak menimbulkan ketidaknyamanan pada penderita. Akan tetapi resiko kontaminasi akibat kesalahan pengambilan cukup besar. Tidak boleh menggunakan antiseptik untuk
persiapan
pasien
karena
dapat
menyebabkan kultur false-negative.
mengkontaminasi
sampel
dan
(http://majalahkesehatan.com/infeksi-
saluran-kemih-isk/) Cara pengambilan dan penampungan urin porsi tengah pada wanita : 1. Siapkan beberapa potongan kasa steril untuk membersihkan daerah vagina dan muara uretra. Satu potong kasa steril dibasahi dengan air sabun, dua potong kasa steril dibasahi air atau salin hangat dan sepotong lagi dibiarkan dalam keadaan kering. Jangan memakai larutan antiseptik untuk membersihkan daerah tersebut. Siapkan pula wadah steril dan jangan buka tutupnya sebelum pembersihan daerah vagina selesai. 2. Dengan 2 jari pisahkan kedua labia dan bersihkan daerah vagina dengan potongan kasa steril yang mengandung sabun. Arah pembersihan dari depan ke belakang. Kemudian buang kasa yang telah dipakai ke tempat sampah. 3. Bilas daerah tersebut dari arah depan ke belakang dengan potongan kasa yang dibasahi dengan air atau salin hangat. Selama pembilasan tetap pisahkan kedua labia dengan 2 jari dan jangan biarkan labia menyentuh
6
muara uretra. Lakukan pembilasan sekali lagi, kemudian keringkan daerah tersebut dengan potongan kasa steril yang kering. Buang kasa yang telah dipakai ke tempat sampah. 4. Dengan tetap memisahkan kedua labia, mulailah berkemih. Buang beberapa mililiter urin yang mula-mula keluar. Kemudian tampung aliran urin selanjutnya ke dalam wadah steril sampai kurang lebih sepertiga atau setengah wadah terisi. 5. Setelah selesai, tutup kembali wadah urin dengan rapat dan bersihkan dinding luar wadah dari urin yang tertumpah. Tuliskan identitas penderita pada wadah tersebut dan kirim segera ke laboratorium.
Cara pengambilan dan penampungan urin porsi tengah pada pria : 1. Siapkan beberapa potongan kasa steril untuk membersihkan daerah penis dan muara uretra. Satu potong kasa steril dibasahi dengan air sabun, dua potong kasa steril dibasahi dengan air sabun, dua potong kasa steril dibasahi dengan air atau salin hangat dan sepotong lagi dibiarkan dalam keadaan kering. Jangan memakai larutan antiseptik untuk membersihkan daerah tersebut. Siapkan pula wadah steril dan jangan buka tutupnya sebelum pembersihan selesai. 2. Tarik prepusium ke belakang dengan satu tangan dan bersihkan daerah ujung penis dengan kasa yang dibasahi air sabun. Buang kasa yang telah dipakai ke tempat sampah. 3. Bilas ujung penis dengan kasa yang dibasahi air atau salin hangat. Ulangi sekali lagi, lalu keringkan daerah tersebut dengan potongan kasa steril yang kering. Buang kasa yang telah dipakai ke dalam tempat sampah. 4. Dengan tetap menahan prepusium ke belakang, mulailah berkemih. Buang beberapa mililiter urin yang keluar, kemudian tampung urin yang keluar berikutnya ke dalam wadah steril sampai terisi sepertiga sampai setengahnya.
7
Setelah selesai, tutup kembali wadah urin dengan rapat dan bersihkan dinding luar wadah dari urin yang tertumpah. Tuliskan identitas penderita pada wadah tersebut dan kirim segera ke laboratorium. (http://majalahkesehatan.com/infeksi-saluran-kemih-isk/ 2.2 Media Pertumbuhan Mikroorganisme
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.
Mikroorganisme
memanfaatkan
nutrisi
media
berupa
molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya. (Anoname,2008) 2.2.1
Bahan-Bahan Media Pertumbuhan
1 Bahan dasar
Air (H2O) sebagai pelarut.
Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 0
45 C.Gelatin juga memiliki fungsi yang sama seperti agar. Gelatin adalah
polimer
asam
amino
yang
diproduksi
dari
kolage.
Kekurangannnya adalah lebih banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya
juga sebagai pemadat media. Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat. 2 Nutrisi atau zat makanan Media harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; unsur mikro seperti Fe, Mg dan unsur pelikan/ trace element.
Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organic atau anorganik esuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof
8
memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. Sejumlah mikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea.
Vitamin-vitamin.
3 Bahan tambahan Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH akibat produksi asam organik hasil
metabolisme.
Antibiotik
ditambahkan
untuk
menghambat
pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan. 4 Bahan yang sering digunakan dalam pembuatan media
Agar, agar dapat diperoleh dalam bentuk batangan, granula atau bubuk dan terbuat dari beberapa jenis rumput laut. Kegunaannya adalah sebagai pemadat ( gelling) yang pertama kali digunakan oleh Fraw & Walther Hesse untuk membuat media. Jika dicampur dengan air dingin, agar tidak akan larut. Untuk melarutkannya harus diasuk dan dipanasi, pencairan dan pemadatan berkali-kali atau sterilisasi yang terlalu lama dapat menurunkan kekuatan agar, terutama pada pH yang asam.
Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati
seperti otot, liver, darah, susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai. Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan bagaimana cara memperolehnya.
Meat extract . Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,
limpa, plasenta dan daging sapi.
Yeast extract . Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau
pembuat alcohol. Yeast extract mengandung asam amino yang lengkap dan vitamin (B complex).
9
Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunkan dalam amilum, glukosa, fruktosa, galaktosa, sukrosa, manitol, dan lain-lain. Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah 0,5-1%. (Anoname,2008)
2.2.2
Macam-Macam Media Pertumbuhan
1. Medium berdasarkan sifat fisik
Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB ( Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB ( Nutrient Broth), LB ( Lactose Broth). (Anoname,2008)
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar .
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA ( Potato Dextrose Agar ) yang 10
mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract . (Anoname,2008)
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar .
Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain
dan
merangsang
pertumbuhan
mikroba
yang
diinginkan.
Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk
merangsang
E .coli
resisten
antibotik
dan
menghambat
kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.
Media diperkaya ( enrichment ) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar , dan lain-lain.
11
Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur.
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar .
Media diferensial Media
ini
bertujuan
untuk
mengidentifikasi
mikroba
dari
campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA ( Triple Sugar Iron Agar ) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni. (Anoname,2008)
2.3 Penanaman Bakteri (Inokulasi)
Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
12
1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca ( encast ) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelezar, 1986). 2. Pemindahan dengan dengan pipet Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelezar, 1986). 3. Pemindahan dengan kawat inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelezar, 1986).
2.3.1 Teknik Inokulasi
Bertujuan
untuk
mengisolasi
mikroorganisme
dari
campurannya
atau
meremajakan kultur ke dalam medium baru. (Anoname,2008) Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme yaitu : 1. Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah Inokulum digoreskan di permukan media agar nutrien dalam cawaan petridish dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan
13
terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni (Winarni, 1997). Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006)
Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni : a. Goresan T
(Anoname,2008) b. Goresan Kuadran Hampir sama dengan goresan T, namun berpola goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga masih mengandung
banyak
sel
mikroorganisma.
Goresan
selanjutnya
dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. (Anoname,2008)
(Anoname,2008)
14
c. Goresan radian
(Anoname,2008)
d. Goresan Sinambung Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru. (Anoname,2008)
(Anoname,2008)
2. Metode Tebar Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997).
................. ....
…………….. ………….....
15
3. Metode Tuang Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997). Robert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang masing – masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O 2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. (Anoname,2008)
4. Metode Tusuk Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,1997).
2.4 Perhitungan Angka Kuman
Menghitung atau menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan (makanan, minuman, dan lain-lain) dilakukan untuk mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh mikroba. Dengan mengetahui jumlah mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikrobiologi dari bahan tersebut. Bahan yang dapat
16
dikatakan baik jika jumlah mikroba yang terkandung dalam bahan tersebut masih di bawah jumlah standar yang ditentukan oleh suatu lambaga. Kandungan mikroba pada suatu bahan juga sangat menentukan tingkat kerusakannya, serta dapat ditentukan oleh tingkat kelayakan untuk dikonsumsi. (http://asriepdbgt.blogspot.com/2010/11/vbehaviorurldefaultvmlo.html) Jumlah mikroba dapat dihitung dengan beberapa cara, namun secara garis besar dibedakan menjadi: 1. Cara langsung
Hasil perhitungan secara langsung menunjukkan seluruh jumlah mikroba yang masih hidup maupun yang sudah mati. Caranya: a.
Pembuatan preparat sederhana yang diwarnai
b. Menggunakan ruang hitung (http://asriepdbgt.blogspot.com/2010/11/v-behaviorurldefaultvmlo.html) 2.
Cara tidak langsung
Cara perhitungan tidak langsung, hasil perhitungan jumlah mikroba baru dapat diperoleh kemudian setelah dilakukan perlakuan terlebih dahulu. Hasil perhitungan tidak langsung akan menunjukan jumlah mikroba yang masih hidup saja. Adapun caranya : a. Menghitung jumlah total mikroba (Total plate count = angka lempeng total) b. Cara pengenceran c. Memperkirakan jumlah terkecil mikroba yang ada (MPN = Most Probable Number) d. Cara kekeruhan (turbiditas) (http://asriepdbgt.blogspot.com/2010/11/v-behaviorurldefaultvmlo.html)
Plate Count
(hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan
17
perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya. Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut : 1. Satu koloni dihitung 1 koloni. 2. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni. 3. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni. 4. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni. 5. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak dihitung. 6. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.
1
2
3
4
5
6
(Anoname,2008) Standar perhitungan Jumlah koloni = jumlah koloni X 1/faktor pengenceran. a. Cawan yang dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300 koloni
18
b. Hasil yang dilaporkan terdiri dari 2 angka yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka ketiga lebih besar dari 5 maka harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. c. Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni, maka hanya koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumlah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung. d.
Jika semua pengenceran menghasilkan angka lebih dari 300 koloni maka hanya koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumah sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung.
e.
Jika semua pengenceran menghasilkan angka 30-300 koloni maka harus dibuat perbandingan. Jika perbandingannya < 2 maka yang dilaporkan adalah rata-rata pengenceran tetapi jika perbandingannya > 2 maka yang dilaporkan adalah pengenceran terendah.
f.
Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut meskipun salah satu dari cawan duplo tidak memenuhi syarat 30-300 koloni.
(Anoname,2008)
19
BAB III METODE
3.1 Waktu dan Tempat 3.1.1
Waktu Praktikum I
Hari/tanggal
: Kamis, 1 Maret 2012
Jam
: 08.00 wita-12.00 wita
Kegiatan
: Pembuatan media nutrient agar
Praktikum II
Hari/tanggal
: Jumat, 9 Maret 2012
Jam
: 08.00 wita-12.00 wita
Kegiatan
: Penanaman sampel urine
Praktikum III
3.1.2
Hari/tanggal
: Senin, 12 Maret 2012
Jam
: 08.00 wita-12.00 wita
Kegiatan
: Perhitungan angka kuman pada sampel urine
Tempat
Praktikum
bakteriologi
dilaksanankan
di
laboratorium
bakteriologi
Jurusan Analis Kesehatan Politeknik Kesehatan Kemenkes Denpasar.
3.1.3
Alat dan Bahan 1. Alat 0
a. Incubator 37 C b. Tabung reaksi c. Rak tabung d. Petri Dish e. Pipet ukur f.
Bunsen/lampu spiritus
20
g. Coloni counter h. Label i.
Gelas beker
j.
Erlenmeyer
k. Kapas lemak l.
Label
m. Bola Hisap n. Kompor listrik 2. bahan
a. Sampel
: Urine
b. Media
: Media Nutrient Agar
c. Reagen
: Aquadest Steril
3.2 Cara kerja
Langkah kerja
Pengambilan Sampel
Pengenceran (10-1,10-2,10-3)
Penanaman →Media NA
*Metode Tuang
Inkubasi 370C 2x24 jam
Penghitungan (coloni counter)
21
1. Pengenceran Disiapkan 3 tabung reaksi yang masing-masing diisi 9 ml aquadest.
Sampel Urine
Diambil 1ml
Dimasukkan ke TR 1
Dihomogenkan
-1
Pengenceran urine 10
Diambil 1ml
Dimasukkan ke TR 2
Dihomogenkan
-2
Pengenceran urine 10
Diambil 1ml
Dimasukkan ke TR 3
Dihomogenkan
-2
Pengenceran urine 10
22
2. Penanaman Diambil 1 ml 10
-3
Dituang+media NA Diambil 1 ml
10
-3
Dituang+media NA Diambil 1 ml
10
-3
Dituang+media NA
Pembuatan Kontrol
Diambil 1 ml Aquadest Steril
Dituang+media NA
0
3. Inkubasi pada suhu 37 C 4. Penghitungan angka kuman dengan coloni counter (jumlah koloni x faktor pengenceran)
23
BAB IV PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
Berdasarkan hasil perhitungan kuman yang dilakukan pada sampel urine pasien b didapatkan hasil sebagai berikut: No
Plate
Pengenceran
1 2 3 4
Kontrol I II III
-1 10 -2 10 -3 10
Jumlah Koloni 4 83 254
309
Perhitungan yang dapat mewakili jumlah kuman adalah pengenceran yang mengandung jumlah koloni 30-300 koloni per cawan petri. Jadi, dari hasil pengenceran, hanya plate pada pengenceran 10 sedangka pengenceran 10
-3
-1
dan 10
-2
yang memenuhi syarat,
tidak memenuhi syarat karena mengandung lebih dari 300
koloni. Sehingga, hasil perhitungang Total Plate Count pada sampel urine pasien b adalah sebagai berikut:
=
= =
( ) ( ) ()()
= 12.895 /mL
24
4.2 Pembahasan 4.2.1
Teknik Penanaman (Inokulasi) Bakteri pada Sampel Urine
sebelum melakukan penanaman, ada beberapa tahapan yang harus dilakukan antara lain: 1. Pengambilan Sampel
Pengambilan
sampel
urine
pada
pasien
dilakukan
dengan
menggunakan metode pengambilan sampel urine porsi tengah, yaitu dengan cara membuang beberapa mililiter urin yang pertama keluar, kemudian tampung urin yang keluar berikutnya ke dalam wadah steril sampai terisi sepertiga sampai setengahnya. Urine harus ditampung dalam wadah steril yang bertutup rapat dan tidak mudah pecah. 2. Pengenceran
Pada
dasarnya
pengenceran
dilakukan
terhadap
sampel
yang
diperkirakan jumlah kuman banyak, sehingga dapat dihitung jumlah koloni tiap-tiap platenya. Pengenceran sampel dilakukan sebagai berikut : 1. Disediakan 3 buah tabung reaksi yang masing-masing diisi label I,II,II 2. Masing-masing tabung tersebut kemudian diisi 9 mL aquadest steril. 3. Tabung I ditambahkan 1 ml urine. (1/100) 4. Dari tabung I dipipet 1 mL dan dimasukan ke tabung II (1/1000) 5. Dari tabung II dipipet mL dan dimasukan ke tabung III (1/10.000) Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Selain itu, pengenceran juga bertujuan untuk menciptakan kondisi yang nyaman bagi kuman untuk tumbuh, dan menghilangkan partikel-partikel yang mengganggu pertumbuhan bakteri sehingga viabilitasnya tinggi. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
25
3. Penanaman dengan metode Tuang
Penanaman (inokulasi) bakteri dilakukan pada media nutrient agar. Berdasarkan tujuannya, nutrient agar termasuk dalam media isolasi yang bersifat umum. Yaitu, media yang mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan hampir semua jenis mikroba. Sehingga media ini digunakan dalam teknik penanaman bakteri pada sampel urine yang akan dihitung total angka kumannya karena semua kuman yang ada dapat tumbuh. Metode Tuang merupakan salah satu teknik inokulasi. Metode tuang adalah Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997). Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Dari masing-masing pengenceran dipipet 1 mL dan ditanam pada media NA (Nutrien Agar).
Dari tabung I dipipet 1 mL dan dituang pada cawan petri I kemudian dilanjutkan dengan penuangan media NA pada cawan petri tersebut.
Dari tabung II dipipet 1 mL dan dituang pada cawan petri II kemudian dilanjutkan dengan penuangan media NA pada cawan petri tersebut.
Dari tabung III dipipet 1 mL dan dituang pada cawan petri III kemudian dilanjutkan dengan penuangan media NA pada cawan petri tersebut.
2. Selain penanaman sampel dibuat juga sebuah control yaitu dengan menggunakan aquadest sebanyak 1 mL yang dituang pada cawan petri dan ditambahkan media NA. Pembuatan control ini bertujuan sebagai indicator yang menunjukkan seberapa besar kontaminasi yang terjadi pada media pembiakan.
26
Penanaman (inokulasi) ini harus dilakukan secara aseptis yaitu teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi sehingga kultur manipulasi dan media kultur steril. 4. Inkubasi
Setelah selesai penanaman dengan metode tuang selanjutnya biakan o
diinkubasi pada incubator dengan sehu 37 C selama 2 x 24 jam atau selama dua hari. Inkubasi dilakukan bertujuan untuk memberikan waktu untuk kuman agar bisa berkembang biak dan menjadi koloni sehingga dapat dihitung. Suhu o
37 C merupakan suhu yang ideal untuk pertumbuhan bakteri atau kuman.
4.2.2
Teknik Penghitungan Angka Kuman pada Sampel Urine
Penghitungan jumlah koloni pada media pembiakan dilakukan dengan menggunakan alat coloni counter. Alat ini berguna untuk mempermudah perhitungan koloni yang tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya kaca pembesar. Selain itu alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan Petri dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset . Untuk mengetahui jumlah kuman yang terdapat dalam 1 mL sampel dilakukan dengan menghitung jumlah koloni kuman yang tumbuh pada media pembiakan. Perhitungan dilakukan dengan cara sebagai berikut : 1. Dihitung jumlah koloni kuman yang tedapat pada control. Syarat jumlah koloni pada control adalah < 10 2. Dihitung jumlah koloni kuman pada masing-masing plate. Jumlah koloni pada masing-masing plate memiliki syarat 30 > n > 300. Dengan n sama dengan jumlah koloni yang terhitung. Jumlah koloni harus lebih besar dari 30 dan lebih kecil dari 300 3. Untuk mengitung jumlah koloni kuman per 1 mL urine, dihitung dengan menggunakan rumus
27
( ) ( ) ( )
Keterangan : n1 = Jtumlah koloni pada plate I n2 = Jumlah koloni pada plate II n3 = Jumlah koloni pada plate III nk = Jumlah koloni pada control
4.2.3
Hasil Penghitungan Angka Kuman pada Sampel Urine
Dari perhitungan koloni yang dilakukan pada masing-masing plate pada -1
alat colony counter diperoleh hasil yaitu pada pengenceran I (10 ) diperoleh -2
jumlah koloni sebanyak 83 koloni, pada pengenceran II (10 ) diperoleh jumlah -3
koloni sebanyak 254 koloni, sedangkan pada pengenceran III (10 ) diperoleh jumlah kolony sebanyak 309 koloni. Pada penghitungan jumlah koloni pada media pembiakan, terdapat factor penganggu berupa jamur yang dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri pada media pembiakan. Hasil yang diperoleh ini kemudian dihitung lagi dengan menggunakan rumus untuk mengetahui jumlah angka kuman pada 1 mL urine. Namun dari data yang diperoleh tersebut hanya pada pengenceran I dan II yang dapat digunakan dalam perhutingan. Sedangkan pada pengenceran I tidak dapat digunakan karena syarat jumlah kuman yang dapat dihitung dan sesuai standar adalah 30-300 koloni per cawan. Bedasarkan hasil perhitungan terhadap data jumlah kuman yang ditemukan diperoleh hasil bahwa banyaknya jumlah kuman dalam 1 mL sampel urine adalah sebanyak 12.895 /mL.
28
Terdapat tiga kemungkinan yang terjadi dari hasil perhitungan jumlah koloni kuman yang dilakukan. Jika hasil perhitungan koloni kuman (colony Count) < 10.000 / mL urine menandakan tidak terjadi infeksi. Adanya kuman pada urine pasien kemungkinan karena infeksi suprapubik atau kateter. Jika hasil perhitungan koloni (colony count) antara 10.000 mL s/d 100.000/mL urine, menandakan pasien mengalami infeksi saluran kemih. Dan apabila perhitungan koloni (Coloni Count )> 100.000/mL urine, menunjukan bahwa pasien mengalami infeksi saluran kantung kemih. Sesuai dengan hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa pada pesien diindikasi mengalami infeksi saluran kemih. Infeksi pada saluran kemih terjadi bila organisme mikro, biasanya bakteri dari saluran cerna, berpindah ke ujung saluran kemih (utetra) yang terbuka dan mulai berkembangbiak. Uretra adalah saluran yang mengalirkan urin dari kandung kemih keluar tubuh.
29
BAB V PENUTUP
5.1 Simpulan
1. Teknik penanaman (inokulasi) bakteri dari sampel urine dimulai dengan pengambilan sampel dengan metode pengambilan sampel urine porsi tengah, kemudian sampel diencerkan dengan menggunakan metode pengenceran -1
-2
-3
bertingkat (10 , 10 , 10 ). Setelah pengenceran, dilakukan penanaman sampel dengan metode tuang pada media Nutrient Agar. Setelah mengeras, 0
biakan diinkubasi pada suhu 37 C selama 2x24 jam. 2. Penghitungan jumlah koloni pada media pembiakan dilakukan dengan menggunakan alat coloni counter. Jumlah koloni pada masing-masing plate yang memenuhi syarat adalah plate yang memiliki jumlah koloni 30 > n > 300. Penghitungan jumlah total kuman yang ada pada cawan menggunakan rumus :
( ) ( ) ( )
3. Bedasarkan hasil perhitungan terhadap data jumlah kuman yang ditemukan diperoleh hasil bahwa banyaknya jumlah kuman dalam 1 mL sampel urine adalah sebanyak 12.895 /mL. Sesuai dengan hasil tersebut dapat dinyatakan bahwa pada pesien diindikasi mengalami infeksi saluran kemih.
5.2 Saran
1. Disarankan kepada praktikan agar selalu melakukan teknik kerja aseptic mulai dari pembuatan media hingga penanaman bakteri agar kontaminasi dapat
ditekan
sehingga
didapatkan
hasil
penghitungan
yang
dapat
dipertanggungjawabkan.
30
DAFTAR PUSTAKA
Amalia, Rosyida, Rani Wulandari, dan Shinta Ayu Nurfaradila, 2010, Laporan Praktikum Mikrobiologi Penentuan Angka Kuman, Departemen Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia Anoname,Tt, Infeksi Saluran Kemih, diakses di: http://majalahkesehatan.com/infeksisaluran-kemih-isk/, diakses tanggal: 1 Maret 2012 Anoname, 2008, Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar, Purwokerto: Laboratorium Mikrobiologi Universitas Jenderal Soedirman Anoname,
2009,
Anatomi
dan
Fisiologi
Sistem
Perkemihan,
diakses
di:
http://www.wikipedia.com/anatomi-dan-fisiologi-sisitem-perkemihan, diakses tanggal: 1 Maret 2012 Anoname,
2010,
Jenis-jenis
Pemindahan
Mikroba,
diakses
di:
http://
www.scrib.com./doc/403051141, diakses tanggal: 1 Maret 2012 Anoname,
2010,
Perhitungan
Angka
Kuman,
diakses
di:
http://asriepdbgt.blogspot.com/2010/11/v-behaviorurldefaultvmlo.html, diakses tanggal: 1 Maret 2012 Anoname, 2012, Urine, diakses di: http://www.wikipedia.com/urine, dikses tanggal: 1 Maret 2012 Syaifuddin, 1992, Anatomi dan Fisiologi untuk Siswa Perawat, Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC
31
