Pembuatan Suspensi Bakteri

Pembuatan Suspensi Bakteri Pembuatan suspensi bakteri ungu dilakukan dengan mengambil isolat yang merupakan koloni tunggal 1 ose kemudian dimasukkan ke dalam NB cair  dalam tabung reaksi, setelah itu kemudian dilakukan inkubasi selama 2x24  jam pada pada suhu ruang. 1. Penghitunga Penghitungan n Jumlah Jumlah Bakteri Bakteri Bakteri ungu non sulfur yang telah diremajakan kemudian diambil 1 ose menggunakan jarum ose secara aseptis, kemudian dimasukkan ke dalam 100 ml media cair cair NB ( Nutrient  Nutrient Broth) Broth) dan dan diink diinkub ubasi asi selam selamaa 2x24 2x24 jam. jam. Kemudian Kemudian dilakukan dilakukan penghitunga penghitungan n bakteri secara langsung langsung menggunaka menggunakan n  Haemocytometer.  Haemocytometer. Adapun langkah-langkahnya adalah sebagai berikut :  Haemocytometer  r  dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian dikeringkan 1. Haemocytomete dengan tissue. 2. Cover glass diletakkan di atas alat hitung.

3.Sus 3.Suspe pens nsii bakte bakteri ri ungu ungu non non sulfu sulfurr diamb diambil il meng menggu gunak nakan an pipe pipett tetes tetes secukupnya, kemudian diteteskan pada parit kaca alat hitung. Suspensi sel dibiarkan menyebar karena adanya daya kapilaritas.

4.Sel dibiarkan sejenak diam di tempat dengan tujuan agar tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas. 5.Alat hitung diletakkan pada meja benda, kemudian dicari fokusnya pada  perbesaran 40x10. 6.Perhitungan mulai dilakukan secara kasar, apakah diperlukan pengenceran atau tidak. Jika dalam satu kotak sedang terdapat sel-sel yang banyak dan  bertumpuk, maka penghitungan tidak akan akurat sehingga diperlukan  pengenceran dengan perbandingan 1:5 atau 1:10. 7.Sampel kemudian dihitung, paling tidak sebanyak 5 kotak sedang (lebih  banyak lebih baik). Hasil penghitungan kemudian dirata-rata, hasil rataan dimasukkan ke dalam rumus kotak sedang. Jika dilakukan pengenceran, maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran. 2. Analisis Pola Spektra Bakteri Ungu Nonsulfur  Analisis pola spektra bakteri ungu nonsulfur dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV-vis. Pengukuran pola spektra ini dilakukan dengan menganalisis sel utuh bakteri ungu yang telah dibuat suspensi. Adapun langkahnya adalah sebagai berikut : 1.

Membuat suspensi cair bakteri.

2.

Menghidupkan spektrofotometer dengan menekan tombol on.

3.

Mengkalibrasi

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar  yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.

Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu  juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut ( soluble  protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang  biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang  berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.

Ekstraksi. Dalam suatu proses kimia akan melibatkan suatu proses pemisahan,  proses pemisahan tersebut terdapat beberapa jenis antara lain. distilasi, absorpsi, desorpsi,kristalisasi, adsorpsi, leaching,membrane. Ekstraksi adalah suatu proses  pemisahan dari bahan padat maupun cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses yang  bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven pengekstraksi. Ekstraksi berkelanjutan diperlukan apabila padatan hanya sedikit larut dalam  pelarut. Namun sering juga digunakan pada padatan yang larut karena efektivitasnya Proses pemisahan secara ekstraksi dilakukan jika campuran yang akan dipisahkan berupa larutan homogen (cair-cair) dimana titik didih komponennya hampir sama atau berdekatan. Proses pemisahan dari campuran melibatkan tiga langkah yaitu:    Langkah pencampuran 

  Langkah pembentukan fase kedua yang kemudian diikuti dengan terwujudnya  keadaan kesetimbangan.   Langkah pemisahan  Pada ekstraksi fase cairan kedua akan segera terbentuk ketika sejumlah solven (Mass Separating Agent) ditambahkan kedalam fase campuran atau cairan satu. Kontak antara fase cairan satu dan fase cairan kedua dipertahankan sehingga akan terjadi suatu kesetimbangan. Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah: Tipe persiapan sampel Waktu ekstraksi Kuantitas pelarut Suhu pelarut Tipe pelarut Sebagai tenaga pemisah digunakan solven. Beberapa solven yang biasa digunakan antara lain : Caustic soda, Propan, furfural, naptha, amyl acetate, butanol, ethyl acetate ammonia, benzene, nitrobenzen , tri butyl phosphate, hexane, methanol, ethanol, petroleum eter. Solven sebagai tenaga pemisah dalam operasi ekstraksi  juga memiliki persyaratan sebagai berikut:   Daya larut terhadap solute cukup besar.    Sama 

sekali tidak melarutkan diluen atau hanya sedikt melarutkan diluen.

  Antar solven dengan diluen harus mempunyai perbedaan density yang cukup.    Antara 

solven dengan solute harus mempunyai perbedaan titik didih atau tekanan uap murni yang cukup.   Tidak 

beracun.

  Tidak bereaksi baik terhadap solute maupun diluen.    Murah.    Mudah didapat.  Hery Santosa, 2002) Dalam percobaan yang akan dilakukan digunakan solven n heksane. Alasan pemilihan solven dikarenakan telah memenuhi syarat seperti tersebut diatas serta daya larut terhadap karotenoid yang cukup baik (N. Othman et al, 2010) 2.7. Spektrofotometri. Spektrofotometer merupakan suatu alat untuk  mengukur transmitansi atau absorbansi suatu contoh sebagai fungsi dari panjang gelombang dan salah satu cabang analisis instrumental yang membahas segala sesuatu tentang iteraksi sinar dengan molekul adalah spektrofotometri. Unsur-unsur  yang terdapat pada spektrofotometer antara lain : Sumber energi radiasi: kontinyu dan dan meliputi daerah spektrum yang sesuai. Monokhromator: Alat untuk mengisolasi suatu berkas sempit dari panjang gelombang yang mempunyai spektrum yang luas dari suatu sumber. Wadah untuk contoh : Biasa disebut cuvert Detektor : Tranducer yang mengubah energi radiasi menjadi isyarat listrik  Penguat : Membuat isyarat listrik menjadi cocok untuk diamati. Sistem pembacaan : Dapat mempertujukan besarnya isyrat listrik.

 Penerapan spektrofotometrik Hukum Beer : Absorbans, log (Po/P), radiasi monokromatik berbanding lurus dengan konsentrasi sutu spesies penyerap dalam larutan.

Hukum Bouguer (Lambert) : Bayangkan suatu medium penyerap yang homogen dalam lapisan-lapisan yang sama tebal. Tiap lapisan menyerap radiasi monokromatik yang memasuki lapisan itu dalam fraksi yang sama seperti lapisanlapisan lain. Dengan semuanya yang lain sama, maka absorbans itu berbanding lurus dengan panjang jalan yang melewati medium Prinsip analisis kuantitatif  dengan spektrofotometri UV / sinar tampak berdasarkan persamaan Lambert –  Beer: A = λ b c A : Absorbans λ : Absortivitas molar larutan b : Lebar sel yang dilewati sinar c : Konsentrasi analit Hubungan antara warna dengan panjang   gelombang sinar tampak.: Panjang gelombang warna yang diserap warna komplementer 400-435 nm  un gu (lembayung) hijau kekuningan 450-480 nm    biru kuning 480-490 nm  biru  kehijauan orange 490-500 nm  hijau kebiruan  merah 500-560 nm  hijau merah anggur 560-580 nm  hijau kekuningan ungu (lembayung) 580-595 nm  kuning biru 595-610 nm  orange biru kek 610-750 nm m  erah hijau kebiruan Penentuan kadar merupakan hubungan antara absorbansi dan konsentrasi. Pengukuran larutan sampel dapat dilakukan sebagai  berikut :    Ambil larutan sampel    Asamkan dengan HCl sampai ph 1    Encerkan dengan aquadest    Mengukur 

T pada λ tertentu

  Menghitung konsentrasi  Cara analisis yang biasa digunakan : 1. Cara langsung Dengan membandingkan absorbans sampel dengan larutan standar → konsentrasi dan panjang gelombang tertentu 2. Kurva kalibrasi Hubungan absorbansi dan konsentrasi (R.A Day & A.L Underwood , 1992)

 penumbuhan bakteri ungu nonsulfur dilakukan dengan mengukur secara langsung kultur dengan metode spektrofotometer. Sebanyak satu ose bakteri Photobacterium  phosphoreum ditanam dalam media padat dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam hingga terbentuk koloni tunggal. Koloni tunggal tersebut dicuplik dan diinkubasi ke dalam 100 ml media cair selama 20 jam dengan kecepatan putar 200 rpm pada suhu kamar. Sebanyak 4,5 ml kultur hasil inkubasi pada media pertama dipindahkan ke dalam 450 ml media cair kedua dan diinkubasi dengan kecepatan  putar 200 rpm pada suhu kamar selama 20 jam. Seiring berjalannya inkubasi secara  bersamaan dilakukan sampling pengukuran waktu untuk mengetahui kerapatan sel setiap dua jam selama 24 jam. Hasil sampling tersebut ditentukan dengan spektrofotometer UV-Vis (Ultraviolet-Visible) pada panjang gelombang 660nm. Sel dipanen pada kerapatan sel 4x10-9 sel/ml. Untuk memperoleh ekstrak kasar, sampel hasil sampling, disentrifugasi dengan kecepatan putar 6000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 0C, agar cairan fermentasi dan supernatannya terpisah. Supernatan dicuci dengan air suling dingin sebanyak tiga kali untuk menghilangkan sisa-sisa media dan sel-sel yang mati. Setiap kali pencucian, dilakukan sentrifugasi dan penimbangan untuk mengetahui berat molekul supernatan yang tertinggal. Kemudian supernatan tersebut disuspensi dalam larutan buffer fosfat 0,05 M pH 7 (sebanyak 1 gram sel basah dalam 5 ml buffer fosfat)selama 20 jam. Supernatan yang telah disuspensi tersebut dipecah dengan alat sonikasi selama 5 menit dalam keadaan dingin sebanyak 5 kali. Hasil sonikasi diinkubasi kembali selama 1 jam, yang selanjutnya disentrifugasi selama 20 menit

 pada kecepatan putar 12000 rpm pada 40C. Ekstrak kasar yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi  proteinnya. Untuk mengendapkan protein yang ada di ekstrak kasar dilakukan fraksionasi ammonium sulfat dengan derajat kejenuhan 25-85 %. Penambahan ammonium sulfat dilakukan sambil mengadukaduk larutan ekstrak kasar secara  perlahan dengan pengaduk magnet pada suhu 4 0C. Larutan ekstrak kasar kemudian didiamkan selama satu malam

sambil diaduk secara perlahan agar pengendapan berlangsung sempurna. Untuk  memisahkan endapan dengan supernatan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan putar 7000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh ditentukan aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Selanjutnya, LBPP dimurnikan menggunakan kolom dietilaminoetil cellulosa (DEAE cellulosa) ukuran 2x45cm yang diregenerasi dengan 200 ml larutan NaCl pada konsentrasi 2M. DEAE cellulosa dicuci dengan 2 liter air suling dingin dan disetimbangkan dengan 2 liter larutan buffer fosfat pada pH 7,0 dan konsentrasi 0,02 M. DEAE cellulosa harus selalu dijaga pada PH 7,0. Selanjutnya 10 ml sampel LBPP dimasukkan kedalam kolom dan kemudian dielusi dengan larutan buffer fosfat. Elusi ini bertujuan untuk mengikatkan LBPP pada matrik  DEAE cellulosa. Protein lain yang tidak  diinginkan dibiarkan melewati kolom. LBPP yang terikat pada kolom dielusi dengan gradien NaCl sebanyak 200 ml dengan konsentrasi 0,5 M dan ditampung dalam fraksi-fraksi dengan kecepatan 1 ml/menit. Untuk mengetahui fraksi-fraksi yang mengandung LBPP dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Setelah pola serapan LBPP diketahui, kemudian diuji aktivitasnya dan konsentrasinya. Fraksi-fraksi yang ada aktivitasnya digabung dalam sebuah tabung reaksi dan dipekatkan dengan ammonium sulfat pada 40-75 % saturasi. Untuk mendapatkan LBPP kemurnian tinggi digunakan gel filtrasi kromatografi Sephadex G-100 berukuran 2x60cm. Kolom gel tersebut diseimbangkan selama satu malam dengan 0.35 M buffer fosfat  pada pH 7.0. LBPP yang telah dipisahkan dari DEAE cellulosa dielusi dengan 0.02 M buffer fosfat pada pH 7.0 dan ditampung dalam fraksi-fraksi

dengan kecepatan 1 ml/menit. Untuk mengetahui fraksi-fraksi yang mengandung LBPP dilakukan pengukuran serapannya pada panjang gelombang 280 nm. Setelah pola serapan LBPP diketahui, kemudian diuji aktivitasnya dan konsentrasinya. Fraksi-fraksi yang ada aktivitasnya digabung dalam sebuah tabung reaksi dan dipekatkan dengan ammonium sulfat pada 40-75 % saturasi. Penentuan aktivitas dilakukan dengan cara mengukur intensitas cahaya maksimum dari fraksi-fraksi LBPP menggunakan alat spektrofotometer fluorosensi model F-2000. Satuan aktifitas dinyatakan dalam quanta sec-1 ml-1 dan satuan aktifitas spesifik dalam quanta sec-1 mg-1. Satuan aktivitas total dinyatakan dalam quanta sec-1 yang diperoleh dari  perkalian kecepatan per satuan mg enzim dengan mg enzim. Kondisi yang diperlukan agar terjadi proses biolumunisensi adalah 1 ml dari 5x10-5 M FMNH2 dimasukkan kedalam 1,2 ml campuran LBPP, 100  L dodekanal, O2 dan 0,02 M  buffer fosfat pH 7. Pengukuran aktivitas biolumunisensi dilakukan pada kondisi pada 25 0C dimana FMNH2 harus diinjeksi secara cepat. Setiap fraksi-fraksi LBPP seperti ekstrak kasar, fraksionasi pada 25-85% saturasi, DEAE cellulosa, gel filtrasi, diuji aktivitasnya sesuai langkah-langkah yang telah dijelaskan. Konsentrasi protein diuji menggunakan metode Lowry, dengan bantuan bovine serum albumin (BSA) sebagai standar. Absorbansi pada 750 nm digunakan sebagai dasar   pengujian konsentrasi protein. Untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim setelah  pemurnian, maka dilakukan elektroforesis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDSPAGE). Karakterisasi sifat-sifat fisika dari LBPP dilakukan dengan mengukur spektrum serapan (eksitasi) dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis dan spektrum pemancaran cahaya dengan menggunakan spektrofotometer fluorosensi model

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Pembuatan Tempe gemboes  xa.yimg.com/kq/groups/22975017/ 

Dari

Ampas

Tahu. http://

Anonim. 2006. Tinajuan Tentang Media Pertumbuhan. http://www.ojimori.com/2011/07/09/tinjauan-tentang-media-pertumbuhan bakteri/ Elfiati, Deni. 2005. Peranan Mikroba Pelarut Fosfat Terhadap Pertumbuhan Tanaman . Fakultas Pertanian Jurusan Kehutanan USU, Medan. Fadilah, Sperisa Distatntina, Enny Kriswiyanti Artati, dan Arif Jumari. 2008. Pengaruh penambahan Glukosa dan Yeast Terhadap Biodelignifikasi Ampas Batang Aren. Universitas Negeri Sebelas Maret, Surakarta. Ginting, Cipta. 2010. Media PDA. Universitas Lampung, Lampung. Handayani, Sri. 2004. Biobenefication Of Quartz Using  Aspergillus niger .  Buletin  Bahan Galian Industri 8 (22) : 24-29. Isa, Ishak. Bioleaching Logam Timbal (Pb) dari Sedimen dengan Menggunakan Bakteri Thiobacillus ferrooxidans (Bioleaching Of Heavy Metals from Sediments Using Thiobacillus ferrooxidans). 2004.  Jurnal Tanah dan  Lingkungan 6 (2) : 59-62.

Maryanty, Yanty, Hesti Pristianti, dan Paulina Ruliawati. 2010. Produksi Crude  Lipase Dari Aspergillus niger Pada Substrat Ongok Menggunakan Metode Fermentasi Fasa Padat. Universitas Diponegoro, Semarang. Sastro, Yudi, Donny Widianto, Dan Irfan D. Prijambada. 2005. Pengaruh Batuan Fosfat dan Kerapatan Inokulum Terhadap Ketahanan Hidup Aspergillus  Niger dan Kemampuannya Melarutkan Fosfat Setelah Dipeletkan Dengan Batuan Fosfat. Jurnal Tanah dan Lingkungan 7 (2) : 77-80. Suyoto. 2009. Pengaruh Inokulasi Cendawan Endofit Akar  Aspergillus niger  Dan Perlakuan Fosfat Terhadap Pertumbuhan Tanaman Padi Gogo (Oryza  sativa) Dan Jagung ( Zea mays). Institut Pertanian Bogor, Bogor. Wahyudi, Tatang, Sri Handayani, Ngurah Ardha Suratman, Stefanus Suryo Cahyono, dan Deden Amirudin. 2008. Pengembangan Bioteknologi Untuk  Pengolahan Mineral (Studi Kasus : Ekstraksi Fosfat Dari Endapan Fosfat Alam Dengan Metode Bio). Tekmira, Bandung. Wahyudi, Tatang. 2009. Perubahan Morfologi Dan Kimia Batuan Pembawa Fosfat Akibat Pelindian Dengan  Aspergillus niger .  Jurnal Teknologi Mineral dan  Batubara 5 (13) : 47 – 56. Yunilas. 2009. Bioteknologi Jerami Padi Melalui Fermentasi sebagai Bahan Pakan Ternak Ruminansia. http;//repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/805/1/09E01417.pdf  Zindhy. 2009. Pembuatan Media PDA. http://www.scribd.com/doc/37946830/Bab5-Pembahasan-Bab-6-Kesimpulan