Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Prinsip Kerja Kromatografi Kolom • • •
Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.
Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal. Silica gel ada 2 macam: 1.
GF245, dengan G melambangkan gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene, dan angka 245 menunjukkan besarnya panjang gelombang yaitu, 245 nm. Silika jenis ini sering digunakan pada kromatografi lapis tipis (TLC). 2. H, dengan tanpa adanya gypsum dan floroscene. Silika jenis ini biasa digunakan pada kromatografi kolom. Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Sementara itu, fasa gerak yang digunakan (dalam percobaan ini, CH2Cl2 : CH3OH = 99 : 1) sifatnya non-polar. Maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan : a. Kromatografi fase normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar. b. Kromatografi fas terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.
Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.
Cara pembuatannya ada dua macam a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberikapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi. b. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairanpengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolommelalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuksemua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat,setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorbenkemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahuludilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dindingkolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dandiatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yangkeluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografikolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),ukuran kolom (diameter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi (2)
IV.2 Pembahasan Pada praktikum kali ini dilakukan pemisahan dengan cara kolom konvensional dengan metode basah,yakni dengan mensuspensikan silica terlebih dahulu kemudian dimasukkandalam kolom.. Eluan tersebut adalah heksan 100%; heksan:etil 10:1, 5:1, 3:1, 1:1;etil 100%; etanol:etil 1:1, 3:1, 5:1; serta methanol 100%. Masing-masingeluan dibuat 30 mL, sehingga dari jumlah tersevut dapat
dihitung bahwa jumlah volume yang akan terisi sampel yang telah dipisahkan adalah 300 mldengan volume masing vial adalah 5 mL.Vial-vial tersebut secara berurutan akan mengandung senyawa nonpolar yang akan ditarik oleh senyawa non polar pula sebagao eluen. Itulahsebabnya dalam pembuatan eluen harus dibuat senyawa non polar ke polar.Penambahan eluen harus dilakukan 2 cm diatas sampel untukmenghindari sampel dan silica kering, sebab jika pada bagian silika ada yangbasah dan kering akan menyebabkan tidak meratanya eluen yang akandigunakan selanjutnya.
Keuntungan kolom 1. Hasil partisi yang diperoleh sangat bagus, sebab elusi terjadi secarawajar tanpa ada tekanan dari alat lain serta waktu kontak antara eluendengan sangat lama 2. Dapat digunakan pada sampel dengan sampel yang jumlah yang sedikit 3. Silika yang sudah digunakan dapt dicuci kembali sehingga lebih hematKerugian kolom1. Prosesnya tidak hemat waktu2. Alatnya konvensional dengan membutuhkan keahlian khusu s dalam penggunaannya
Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuatdengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasadigunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudahmenguap (non-volatile).
Silica gel adalah substansi-substansi yang digunakan untuk menyerap kelembapan dan cairan partikel dari ruang yang berudara/bersuhu. Silica gel juga membantu menahan kerusakan pada barang-barang yang mau disimpan. 2.Kromatografi Kolom
Kromatografi adalah proses pemisahan yang tergantung pada perbedaandistribusi campuran komponen antara fase gerak dan fase diam. Fase diam dapatberupa pembentukan kolom dimana fase gerak dibiarkan untuk mengalir(kromatografi kolom) atau berupa pembentukan lapis tipis dimana fase gerakdibiarkan untuk naik berdasarkan kapilaritas (kromatografi lapis tipis). Perludiperhatikan bahwa senyawa yang berbeda memiliki koefisien partisi yangberbeda antara fase gerak dan diam. Senyawa yang berinteraksi lemah denganfase diam akan bergerak lebih cepat melalui sistem kromatografi. Senyawadengan interaksi yang kuat dengan fase diam akan bergerak sangat lambat(Christian, 1994; Skoog, 1993)
Pemilihan solven eluentergantung pada jenis adsorben yang digunakan dan kemurnian senyawa
yangdipisahkan.
Solven
harus
mempunyai
kemurnian
yang
tinggi.
Keberadaanpengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada solven yang kurang polar akanmengganggu aktivitas adsorben
Silika gel adalah fasa diam yang paling sering digunakan untuk pemisahanproduk alam. Silika gel memberikan area permukaan yang sangat luas. Rata-rataukuran partikel silika gel yang digunakan dalam kolom kromatografi adalah 40– 200μm dengan ukuran pori sebesar 40 hingga 300 Å (Cannel, 1998).
