PERCOBAAN V
JUDUL PERCOBAAN : KROMATOGRAFI KOLOM
TANGGAL PERCOBAAN : 28 Nopember 2016
Latar Belakang :
Definisi Kromatografi
Kromatografi terdiri dari dua fase, fase gerak dan fase diam, Menurut Alimin (2007:115), dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan, melekat pada permukaan padatan halus, bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori fasa diam. Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi atau bereaksi secara kimia. Pemisahan terjadi berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk keperluan analisis kualitatif, analisis kuantitatif dan pemurnian suatu senyawa. Dalam beberapa hal metode pemisahan kromatografi mempunyai kemiripan dengan metode pemisahan ekstraksi. Kedua metode ini sama-sama menggunakan dua fasa, dimana fasa satu bergerak terhadap fasa lainnya, kesetimbangan solut selalu terjadi di antara kedua fasa.
Ada beberapa pembagian kromatgografi, diantaranya kromatografi cair-cair, Menurut Khopkar (2008:223), Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran. Jika suatu zat terlarut dikocok dalam sistem dua pelarut yang tidak bercampur atau saling melarutkan maka zat terlarut akan terdistribusi di antara kedua fase.
Metode pemisahan dalam kimia diantaranya kromatografi, Menurut Hendayana (2006:127), menyatakan bahwa Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam.
Mengapa Perlu dilakukanya Pemisahan dengan Kromatografi Lapis Tipis
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam dibidang analisis karena kebanyakan sampel yang akan dianalisis berupa campuran. Untuk memperoleh senyawa murni dari suatu campuran, harus dilakukan proses pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran diantaranya ekstraksi, destilasi, kristalisasi dan kromatografi. Metode pemisahan pada kromatografi sangat tergantung dari jenis fase diam yang digunakan. Jenis fase diam yang digunakan menentukan interaksi yang terjadi antara analit dengan fase dia dan fase gerak. Metode pemisahan pada kromatografi terbagi Pemisahan berdasarkan polaritas. Metode pemisahan berdasarkan polaritas, senyawa senyawa terpisah karena perbedaan polaritas. Afinitas analit tehadap fase diam dan fase gerak tergantung kedekatan polaritas analit terhadap fase diam dan fase gerak (like dissolve like). Kromatografi kolom adalah pemisahan pertama yang berdasarkan perbedaan polaritas atau afinitas zat tersebut, setelah itu senyawa yang sudah dipisahkan dikarakterisasi dan dipisahkan lagi secara kromatografi kolom.
Penelitian Terdahulu Tentang Kromatografi Lapis Tipis
Percobaan tentang kromatografi pernah juga pernah dilakukan oleh A. R. Astiti Asih, dkk (2008 : Vol. 2 No. 2, 112) tentang isolasi senyawa golongan flavonoi Sebanyak 1,5 kg serbuk kering kulit batang Bungur dimaserasi dengan n-heksan, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksana. Residu dari kulit batang Bungur kemudian dikeringkan. Residu kulit batang Bungur yang telah kering tersebut dimaserasi lagi dengan menggunakan metanol, sehingga diperoleh ekstrak kental metanol. Ekstrak kental n-heksan dan ekstrak kental metanol kemudian ditimbang dan diuji fitokimia, jika ekstrak kental metanol yang positif flavonoid maka ekstrak kental metanol yang diperoleh kemudian ditambah metanol : air (7:3), dan ekstrak airnya dipartisi dengan etilasetat dan n-butanol sehingga diperoleh fraksi etilasetat, fraksi n-butanol dan fraksi air. Fraksi-fraksi ini dipekatkan, sehingga diperoleh fraksi etilasetat, fraksi n-butanol dan fraksi air. Pemisahan dan pemurnian senyawa flavonoid dapat dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kolom sampai diperoleh isolate yang positif flavonoid dan relatif murni yang dapat diuji kemurniannya menggunakan analisis KLT pada berbagai campuran fase gerak. Selanjutnya isolate relatif murni diidentifikasi menggunakan spektrofotometer Ultra Violet-Visibel dan spektrofotometer Inframerah. Pemisahan ekstrak kental n-butanol menggunakan Kromatografi Kolom dengan eluen n-butanol : asam asetat : n-heksan dengan perbandingan (3:3:2). Hasil Kromatografi Kolom adalah 100 fraksi (tiap fraksi 3 mL), yang selanjutnya diuji dengan Kromatografi Lapis Tipis untuk penggabungan. Fraksi-fraksi yang menampakan noda dengan pola pemisahan yang sama digabungkan, sehingga diperoleh 3 kelompok fraksi (F1, F2, F3) yang mempumyai pola pemisahan yang berbeda. Masing – masing fraksi (F1, F2, F3), diuapkan, ditimbang, serta diuji fitokimia, untuk mengetahui fraksi yang positif mengandung senyawa flavonoid.
Kromatografi kolom juga pernah dilakukan oleh Hernani (2002 : Vol. 1. No. 1, 22), Eluen yang digunakan untuk mengeluasi adalah campuran etil asetat + kloroform + petroleum eter = 5 + 95 + 5, etil asetat dan metanol. Sistem eluasi yang digunakan secara gradient. Sebelum contoh dimasukkan, kolom harus dikondisikan selama 1 malam sampai padatan isi kolom terlihat kompak. Timbang 2 g CNSL, kemudian dilarutkan dalam terpentin sampai terlarut secara sempurna. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam kolom secara hati-hati. Cairan yang keluar ditampung dalam tabung reaksi untuk setiap 3 ml. Setiap fraksi dianalisis dengan kromatografi lapis tipis dengan eluen campuran dietileter + sikloheksan = 3 + 1. Sebagai larutan penampak adalah serium (IV) sulfat. Fraksi-fraksi yang mempunyai jumlah noda yang sama dikumpulkan menjadi satu. Untuk analisis secara kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) menggunakan kolom Lichrosob OV 18; eluen campuran n-heksan + etil asetat = 2+1; kecepatan alir 0,5 ml/menit; detektor UV pada panjang gelombang 285 nm. Untuk analisis secara GCMS menggunakan kolom kapiler dengan panjang 20 m dan diameter dalam 0,25 mm. Suhu kolom terprogram 100-250 °C/10°C/menit. Temperatur injektor = 250°C, gas pembawa helium dengan kecepatan alir 10 ml/menit. Isolasi kardanol secara kolom kromatografi dengan isi silika gel menghasilkan rendemen 66,5 % dan indeks bias 1,5052. Hasil analisis secara KLT menunjukkan satu spot yang melebar pada harga Rf 0,63. Sedangkan analisis secara HPLC mendapatkan juga satu puncak. Dari identifikasi menunjukkan bahwa kardanol yang dihasilkan adalah monoolefin atau mempunyai satu ikatan rangkap dengan kemurnian 90 %.
Identifikasi senyawa KmnO4 juga pernah dilakukkan oleh Reni Rosalina, dkk (2015 : Vol. 18. No.2), Pelarut p.a. yang digunakan, yaitu kloroform (CHCl3), dan metanol (MeOH). Pelarut teknis yang dipakai adalah metanol (MeOH) dan meti-len klorida (CH2Cl2) Proses monitoring reaksi, pemisahan, dan pemurnian dilakukan dengan teknik kromatografi. Kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan pelat aluminium ber-lapis silika gel Merck Kieselgel 60 F254 dengan ketebalan 0,25 mm untuk memo-nitor reaksi, kromatografi kolom gravitasi (KKG) menggunakan silika gel Merck 60 (35-70 mesh) untuk proses pemurnian, kro-matografi radial (KR) menggunakan silika gel Merck Si-Gel 60 PF254 untuk proses pemurnian. Reagen Dragendroff digunakan sebagai pereaksi penampak noda pada KLT. Reaksi oksidasi dilakukan dalam sua-sana asam di mana pada suasana asam dengan kekuatan oksidasi yang besar, maka ion permanganat secara teoretis dapat mengoksidasi beberapa gugus fungsi pada kinin. Pada kinin terdapat beberapa gugus fungsi yang reaktif terhadap reaksi oksidasi yaitu olefin yang dapat teroksidasi menjadi diol atau produk fragmentasi, nitrogen pada cincin kuinuklidin yang dapat teroksidasi menjadi senyawa N-oksida, dan alkohol sekunder yang dapat teroksidasi menjadi keton atau produk fragmentasi. Produk epimer aldehid merupakan produk dari oksidasi yang terjadi pada gu-gus vinil pada kinin. Berdasarkan hasil tersebut, maka dapat diketahui bahwa metode reaksi dengan permanganat ini dapat digunakan untuk fungsionalisasi gugus vinil pada kinin. Sedangkan untuk pemutusan ikatan C-C yang menghasilkan kinin karboksilat masih diperoleh rendemen yang sangat sedikit, dan metode oksidasi dengan permanganat ini kurang selektif apabila digunakan pada substrat yang memiliki banyak gugus fungsi seperti kinin. Dari percobaan ini maka hasil yang didapatkan adalah Oksidasi kinin dengan kondisi yang dilakukan berhasil diperoleh senyawa kinin-1-N-oksida dan kininal.
Tujuan Penulisan
Adapun tujuan percobaan ini adalah untuk :
Mengetahui apa kelebihan dan kekurangan kromatografi kolom.
Mendeskripsikan bagaimana prinsip keja kromatografi kolom.
Memahami tekhnik-teknik dasar kromatografi kolom.
Tinjauan Pustaka
Pemisahan Kromatografi, Menurut Underwood (2002:224), Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom terabsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair padat, substrat padat bertindak sebagai fasa diam yang sifafnya tidak larut dalam fasa cair, fasa bergeraknya adalah cairan atau pelarut yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan bergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka diantara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fasa bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fasa bergerak.
Ada beberapa keuntungan dalam kromatografi, Menurut Alimin (2007:116), keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah
Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan rumit.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang mamadai untuk menerima sampel-sampel tanpa melamapaui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang-kurangnya sepuluh kali ukuran diameternya. Bahan pengemasnya, suatu adsorsben seperti alumina atau mungkin suatu resin pertukaran ion, dimasukkan dalam bentuk suspense ke dalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam di dalam hamparan basah dengan sedikit cairan tetap berada di atas permukaannya. Keran dibuka, dan permukaan cairan dibiarkan turun sampai mencapai puncak permukaan hamparan kemudian porsi kecil dari larutan sampel dipipet dengan hati-hati ke atas puncak permukaan hamparan. Larutan efluen keluaran dikumpulkan dalam sederatan fraksi volume yang tidak merepotkan. Larutan tersebut dapat menetes jatuh ke dalam sebuah gelas beker atau tabung uji tiap kali telah terkumpul sejumlah volume tertentu.
Alat dan Bahan
Alat
No.
Nama Alat
Ukuran
Jumlah
Gambar
1.
Gelas kimia
250 mL
-
2.
Gelas ukur
50 mL
-
3.
Batang statif
-
-
4.
Erlenmeyer
250 mL
-
Bahan
No.
Nama Bahan
Ukuran
Jumlah
Gambar
1.
Aluminum oksida
20 gram
-
2.
KMnO4
5 mL
-
3.
K2Cr2O7
5 mL
-
4.
1-Butanol
20 mL
-
Prosedur Kerja dan Pengamatan
No.
Prosedur Kerja
Hasil Pengamatan
Reaksi Perhitungan
1.
Didalam kolom kromatografi yang telah di bersihkan dimasukkan penjerap aliminium oksida yang dibasahi dengan air setinggi 10 cm.
-
2.
Melalui corong ditambah pelarut 1-butanol hingga mencapai 1 cm diatas permukaan penjerap, dimasukkan slika gel dan n-heksana sebanyak 20 ml.
-
3.
Dimasukkan 1 mL sampel KMnO4 dan K2Cr2O7 yang telah dicampurkan, kemudian dibuka keran kolom nya dan di biarkan cairan dalam kolom akan turun membawa komponen-komponen campurannya.
KMnO4 + KCrO7 Mn 2+ + CrO4
4.
Proses ini di teruskan hingga didapat semua komponen keluar dari kolom dan di tampung di tempat yang berbeda, hingga di dapat 3 fraksi. Disiapkan gelas kimi dibawah kran. Waktu yang dibutuhkan untuk keluar eluennya beberapa jam, lalu setelah eluennya keluar, di pisahkan dengan dua gelas kimia yang berbeda.
-
Pembahasan
Pada percobaan kromatografi kolom Fase diam nya adalah silica gel dan fase geraknya adalah hasil impregnasi antara ekstrak dan silica gel. Langkah pertama yang kami lakukan yaitu menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Didalam kolom kromatografi yang telah di bersihkan dimasukkan penjerap aliminium oksida yang dibasahi dengan air setinggi 10 cm. Kemudian dimasukkan slika gel dan n-heksana sebanyak 20 mL selanjutnya dimasukkan sampel KMnO4 dan K2Cr2O7 sebanyak 1 mL yang bewarna merah hati dan 10 mL larutan 1-butanol kemudian dibuka keran kolom nya dan di biarkan cairan dalam kolom akan turun membawa komponen-komponen campurannya, ternyata yang duluan keluar adalah K2Cr2O7 karena larutan tersebut lebih bersifat non polar. Proses ini di teruskan hingga semua komponen keluar dari kolom dan di tampung di tempat yang berbeda. Dan setelah ditunggu beberapa menit didapat fraksi2 nya. Yaitu, fraksi pertama bewarna keruh, yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke 3 tidak bewarna.
Menurut jurnal yang di kemukakan oleh Mursiti (2013 : Vol. 36, No. 2), Setiap fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom dianalisis dengan KLT menggunakan lampu UV. Uji alkaloid menggunakan pereaksi Dragendorff 130 dan 132. Fraksi yang positif merupakan fraksi yang mengandung alkaloid. Kemudian fraksi ini dianalisis lebih lanjut untuk identifikasi struktur dengan GC, spektrometer IR, UV, dan 169 HNMR. Hasil analisis menunjukkan bahwa dalam ekstrak diperkirakan terdapat senyawa alkaloid yakni 3,4,5-trietil-6-metoksi-2-metil-1,2-dihidro-piridin. Sedangkan pada praktikum di dapat 3 fraksi yaitu fraksi pertama bewarna keruh, yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke 3 tidak bewarna.
Penutup
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
Ekstraksi adalah Prinsip dasar kromatografi kolom adalah pemisahan senyawa menjadi komponen-komponennya berdasarkan perbedaan kecepatan perpindahan masing-masing komponen diantara dua fasa.
Pada percobaan di dapat perbedaan 3 fraksi yaitu yaitu fraksi pertama bewarna keruh, yang kedua bewarna kuning sedangkan fraksi yang ke 3 tidak bewarna.Pada percobaan kromatografi kolom Fase diam nya adalah silica gel dan fase geraknya adalah hasil impregnasi antara ekstrak dan silica gel.
Teknik kromatografi kolom berdasarkan terapan atau adsorpsi jenis fasa yang digunakan, dimana fasa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa gerak dengan menggunakan kolom dengan penambahan fasa gerak, ditampung, dipisahkan, dan diidentifikasi.
Saran
Dalam melakukan kegiatan praktikum ini, diharapkan Praktikan lebih berhati-hati, cermat, dan tidak ceroboh dalam melaksanakan percobaan agar mendapat hasil yang baik dan menghindari kesalahan. Pada percobaan selanjutnya diharapkan Lab kimia memilik alat yang cukup untuk pratikum sehinnga semua kelompok dapat melakukan pratikum sebagaiman harusnya.
DAFTAR PUSTAKA
Alimin.2007. Analisis Kuantitatif. Jakarta : Erlangga.
Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya.
Hernani. 2002. Isolasi Kardanol dari CNSL (Cashew Nut - Shell Liquid) Secara Kromatografi Kolom. Jurnal Bahan Alam Indonesia : Vol. 1. No. 1, 21-24, diakses tanggal 27 Oktober 2016.
Khopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga.
Mursiti 2013. Isolasi, Identifikasi, Dan Elusidasi Struktur Senyawa Alkaloid Dalam Ekstrak Metanol-Asam Nitrat Dari Biji Mahoni Bebas Minyak (Swietenia Macrophylla, King). Jurnal MIPA, 36 (2): 169-177, diakses tanggal 4 Desember 2016.
R. Astiti Asih, dkk. 2008. Senyawa Golongan Flavonoid pada Ekstrak N-Butanol Kulit Batang Bungur (Lagerstroemia Speciosa Pers.). Jurnal Kimia : Vol. 2 No. 2, diakses tanggal 27 Oktober 2016.
Reni Rosalina, dkk. 2015. Reaksi oksidasi dengan kalium permanganat (KMnO4) pada senyawa kinin. Jurnal Penelitian Teh dan Kina : Vol. 18. No.2, diakses tanggal 3 Desember 2016 .
10
