LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA II KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL TUMBUHAN KELOR (MORINGA OLIEFERA L)
OLEH: NAMA
: SETIANTI RAHAYU MUHLIS
STAMBUK
: 15020130081
KELAS
: C.3
KELOMPOK : II ASISTEN
: MUS MUALIM S.Farm
PROGRAM STUDI FARMASI LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMA FAAKULTAS FARMASI MAKASSAR 2016
BAB I PENDAHULUAN 1.1.
Latar Belakang Pengobatan tradisional yang menggunakan bahan-bahan alam telah sangat berkembang hingga saat ini, dan sangat menarik minat masyarakat pada umumnya untuk kembali menggunakan bahanbahan alam sebagai obat karena mempunyai beberapa kelebihan dibandingkan dengan obat-obat sintesis. Oleh sebab itu perlu dilakukan pemisahan senyawa bermanfaat dari tanaman untuk dapat di manfaatkan secara maksimal. Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan)
terutama
untuk
keperluan
dalam
bio-farmasi.
Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekulmolekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama.
Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat. Karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung
pada
sifat
kelarutan
senyawa
yang
akan
dipisahkan. Berdasarkan uraian tersebut, maka akan membahas tentang metode kromatografi kolom. 1.2. Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1. Maksud Percobaan Adapun maksud dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui dan memahami cara penggunaan serta prinsip kerja kromatografi kolom
konvensional menggunakan fraksinasi
kasar
daun kelor
(Moringa Oliefera L). 1.2.2. Tujuan Percobaan Adapun senyawa
tujuan
kimia
percobaan
fraksinasi
kasar
ini
yaitu
untuk memisahkan
daun Johar
(Cassia folium)
menggunakan kromatografi kolom konvensional berdasarkan warna dan tingkat kepolaran. BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Uraian Tanaman 1. Klasifikasi Sampel (itis.gov) Kelor (Moringa Oliefera L). Kingdom : Plantae Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Ordo
: Brassicales
Famili
: Moringaceae
Genus
: Moringa
Spesies : Moringa oliefera L. 2. Morfologi Tanaman (Bose, 2007) Moringa oleifera L. dapat berupa semak atau dapat pula berupa pohon dengan tinggi 12 m dengan diameter 30 cm. Kayunya merupakan jenis kayu lunak dan memiliki kualitas rendah. Daun tanaman kelor memiliki karakteristik bersirip tak sempurna, kecil, berbentuk telur, sebesar ujung jari. Helaian anak daun memiliki warna hijau sampai hijau kecoklatan, bentuk bundar telur atau bundar telur terbalik, panjang 1-3 cm, lebar 4 mm sampai 1 cm, ujung daun tumpul, pangkal daun membulat, tepi daun rata. Kulit akar berasa dan berbau tajam dan pedas, dari dalam berwarna kuning pucat, bergaris halus, tetapi terang dan melintang. Tidak keras, bentuk tidak beraturan, permukaan luar kulit agak licin,
permukaan dalam agak berserabut, bagian kayu warna cokelat muda, atau krem berserabut, sebagian besar terpisah. 3. Kandungan Kimia dan Manfaat tumbuhan (Bose, 2007) Moringa oleifera L. mengandung kombinasi senyawa yang unik
yaitu
merupakan
isotiosianat
dan
zat
terdapat
yang
glukosinolat. dalam
Isotiosianat berbagai
(ITC)
tanaman,
termasuk Moringa oleifera L., dan memiliki potensi sebagai agen kemopreventif. Secara in vivo, isotiosianat telah menunjukkan aktivitas sebagai agen antikanker. Di alam isotiosianat berada dalam bentuk benzil isotiosianat (BITC), phenetil isotiosianat (PEITC), atau phenyl isotiosianat (PITC). Isotiosianat terlepas dari tanamannya melalui aksi enzim mirosinase setelah sel tanaman itu rusak, seperti saat dipanen atau saat dikunyah. Atas dasar faktafakta tersebut berbagai penelitian mengenai isotiosianat telah banyak dilakukan.
B. KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL Pada
kromatografi
kolom,
campuran
yang
akan
dipisahkan
diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolomkarena aliran yang
disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom. Metode ini mdrupakan contoh kromatografi elusi karena linarut dielusi dari kolom (Sastrohamidjojo, 1985). Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih
banyak
digunakan.
Kromatografi
kolom
digunakan
untuk
memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al 2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam (Wijayakusuma, 1996): a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi. b. cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya,
serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silikaatau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolomkromatografi
berkerja
berdasarkan
skala
yang
lebih
besar
menggunakanmaterial terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal (Sudjadi,1994). Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri (dielusi)dengan fase gerak berupa pelarut (Gritter,1991). Sampel yang mengandung campuran senyawa dituangkan ke bagian atas dari kolom, kemudian dielusi dengan pelarut sebagai fase gerak. Setiap senyawa/komponen dalam campuran akan didorong oleh fase gerak dan sekaligus ditahan oleh fase diam. Kekuatan senyawa ditahan oleh fase diamakan berbeda dengan senyawa lainnya. Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),ukuran kolom (diameter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi (Gritter,1991). Untuk kromatografi kolom , kolom tertentu diisi dengan bahan penjerap /sorpsi dan pelarut pengembang dengan tingkat kepolaran yang berbeda. Kolom yang diisi dengan bahan penjerap /sorpsi yang disebut kolom pemisah. Penggunaan kolom tergantung dari masalah pemisahan yaitu kolom berfilter dengan gelas bepori, yang pada ujung bawah
menyempit (tabung allihn) atau tabung gelas yang pada bagian bawah menyempit dan dilengkapi dengan kran sedangkan tabung bola jarang digunakan. perbandingan panjang tabung trhadap diameter pada umumnya ialah 40:1. Pengisian kolom dengan adsorben yang juga disebut pengemasan kolom , harus dilakukan dengan hari-hari dengan permukaan yang rata. Aluminium oksida atau silika gel dapat dikemas dengan metode kering kedalam kolom . Agar pemisahan rata, tabung diisi sambil diketuk-ketuk menggunakan tangan atau benda lunak lainnya pada dinding kolom (Stahl,1991). Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan kranUkuran keseluruhan kolom beragam beragam , tetapi biasanya penjang sekurang-kurang 10 kali garis tengah dalammnya dan mungkin juga sampai 100 kalinya. Ukuran kolom banyaknya penjerap ditentukan oleh bobot campuran linarut (ekstrak) yang akan dipisahkan .Sifat ,derajat atau tingkat keaktifan penjerap da ukuran partikelnya betul-betul penting dalam pengembangan sistem kromatografi . Ukuran penjerap biasanya lebih besar daripada untuk KLT . Kemasan kolom biasanya 63-250 meter untuk kolom yang dijalannkan oleh gaya gravitasi (Raymond et al,2006). Ada 3 pendekatan yang digunakan untuk memilih pelarut meliputi (Anonim,2013) : 1. Penelusuran pustaka
Pemilihan
pelarut
berdasarkan
pendekatan
ini
biasanya
dilakukan pada senyawa yang telah diketahui atau dipublikasikan 2. Berdasarka profil KLT Pendekatan ini akan mempermudah penentuan sistem eluen yang digunakan pada proses kolom karena dapat dilakukan dalam waktu singkat dengan jumlah pelarut yang lebihh hemat sebelum diterapkan pada kolom. Intinya sistem eluen KLT dapat diterapkan langsung pada sistem eluen kolom jika sedah dianggap cocok. 3. Landaian bertahap Sistem landain bertahap mengikiti sistem deret eluotropi. Pendekatan ini mulai dari kepolaran terendah sampai tertinggi untuk mendapatkan hasil kromatogram yang sesuai. Pengemasan Fase Diam /penjerap 1.
Cara kering ( Raymond et al. 2006) Selapisan kapas/pasir bersih diletakkan didasar kolom, penjerap dituangkan kedalam kolom sedikit demi sedikit.Setiap pernambahan silika gel, permukaannya diratakan dan dimanpatkan.Alat pemanpat ini dapat berupa sumbat karet/bahan lunak yang dipasang pada ujung batang kaca atau gagang stik. Setelah semua penjerap dimasukkan, pada bagian atas dilapisi kertas saring sehingga jika ditambahkan eluen, permukaan penjerap tetap rata.Eluen kemudian dimasukkan menggunakan pipet tetes secara
memutar
sambil
membuka
kran
kolom
pada
bagian
bawah.Eluen dibiarkan mengalir ke bawah melalui dan membasahi 2.
penjerap sampai eluen tersebut tepat sampai dikran kolom. Cara basah ( Raymond et al. 2006 )
Selapisan kapas/pasir bersih dimasukkan kedalam kolom, dan tabung diisi sepertiga dari volume kolom. Pelarut yang dipakai dalam proses pengemasan sama dengan pelarut yang akan digunakan pada kromotografi atau pelarut yang kepolarannya lebih rendah. Penjerap dibuat lumpuran menggunakan
eluen
tersebut lalu
dituangkan
kedalam kolom. Lumpurkan dapat dimasukkan sekaligus atau sedikit demi sedikit. Selama proses pengemasan, tabung dapat diketuk-ketuk pada semua sisi secara perlahan-lahan dengan sumbat karet atau bahan yang lunak agar diperoleh lapisan yang seragam. Kran dapat dibuka atau ditutup selama penambahan, namun tetap memperhatikan permukaan pelarut agar tetap merendam seluruh permukaan penjerap. Hal ini untuk mencegah masuknya udara dalam ruang antar partikel silika gel yang dapat menyebabkan gangguan pada proses isonasi. Jika pelarut yang dipakai untuk membuat lumpuran berbeda dengan
pelarut
yang
dipakai
pada
kromotografi,
pelarut
lumpuran harus didesak keluar dengan pelarut pengelusi terlebih 3.
dahulu sebelum cuplikan ditambahkan. Cara kemas basah Cara ini dapat dibuat dengan mengisi tabung setengahnya dengan pelarut, lalu penjerap dalam keadaan kering dimasukkan kedalam kolom berupa aliran halus melalui corang .penjerap dibiarkan mengendap sementara tabung diketuk-ketuk ( seperti cara basah dan kering) agar terbentuk kemasan yang seragam dan mampat. Jika
penjerap dimasukkan seluruhnya sekaligus, biasanya diperoleh kemasan fasediam dalam kolom yang sangat baik. Pelarut berlebih dikeluarkan dari tabung agar diperoleh kolom penjerap dan dapat pula ditambahkan selapisan pasir yang telah dicuci untuk menutupi kertas saring. Keterbatasan kromatografi kolom-terbuka klasik ialah sebagai berikut (Gritter,1991): 1. Pemisahan lambat 2. Penjerapan eluen yang tidak bolak-balik 3. Tidak dapat dipakai jika partikel terlalu kecil.
BAB III
Metode Kerja
A. Alat Adapun alat yang digunakan pda praktikum kali ini adalah batang pengaduk, corong kaca, kolom kaca, guntik, botol kaca, dan vial. B. Bahan Adapun bahan yang digunakan pada prakktikum kali ini adalah eluen (n-hekan dan etil asetat), kapas, aluminium foil,kertas saring, silika gel, dan fraksi dari daun kelor. C. Cara Kerja 1. Disiapkan alat dan bahan 2. Dimasukkan kapas pada ujung kolom (dasar kolom) 3. Dimasukkan eluen
4. Dimasukkan silika gel sebanyak 40 gram secara perlahan-lahan ditunggu beberapa saat sehingga mampat 5. Dimasukkan kertas saring 6. Dimasukkan sampel perlahan-lahan 7. Dimasukkan perbandingan eluen satu-satu mulai dari non-polar hingga polar, perbandingannya yaitu: n-Heksan: Etil Asetat 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan 0:10. Masing-masing eluen dibuat 50 mL. Ditampung dalam vial hingga mencapai volume 5 mL dan dipisahkan berdasarkan warna. BAB IV HASIL a.
Hasil Kromatografi Kolom Konvensional
1.
Gambar Kromatografi Kolom Konvensional
2.
Gambar
Hasil
Fraksi-Fraksi
Kromatografi
Kolom
Konvensional Fraksi 1
Fraksi 2
Fraksi 3
Fraksi 4
Fraksi 5
Fraksi 6
Fraksi 7
Fraksi 8
Fraksi 9
Fraksi 10
Fraksi 11
Fraksi 12
pemisahan fraksi berdasarkan warna
3.
Gambar Noda Lempeng
4.
Gambar Lempeng dibawah UV.
BAB V PEMBAHASAN Kromatografi kolom konvensional adalah metode kromatografi klasik yang sampai saat ini masih banyak digunakan. Kolom kromatografi digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya gravitasi. Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom.
Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom Sistem pelarut dilakukan dengan cara menggantikan / mengubah kepolaran dari eluen yang digunakan secara bertahap. Eluen tersebut merupakan
campuran
dua
jenis
pelarut
dengan
kepolaran
berbeda.Dengan mengubah perbandingan campurannya kita dapat menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini.Pada pengerjaannya di awali dengan satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser tingkat kepolarannya dengan mencampurkannya dengan pelarut etil asetat.Pencampuran dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan secara bertahap, hingga diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat saja sebagai eluen.Dengan ini diharapkan dapat memberikan pemisahan yang lebih baik. Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar 100 tetesan per menitnya.Aliran eluen diatur agar tidak terlalu cepat agar komponen dapat terpisah. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu lambat agar proses tidak terlalu lama. Eluen mengalir mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom dengan memanfaatkan gaya gravitasi. Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap, keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan masing-masing komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai dengan sifat-
sifat masing-masing komponen. Komponen ini dibawa oleh pelarut dan tertampung pada vial penampung. Hasil pemisahan dapat diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut. Proses pemisahan pada kromatografi kolom ini bisa dikatakan sebagai bentuk sederhana dari teknik kromatografi yang dilakukan dengan instrument kinerja tinggi. Kita juga bisa melakukan pemisahan dengan jenis eluen lain, atau dengan jenis absorben lainnya. Kolom di sini hanya sebatas berfungsi sebagai wadah. Bahan yang digunakan sebagai fase diam dapat berupa macam, baik itu dengan memanfaatkan prinsip partisi ataupun absorbsi. Vial-vial tersebut secara berurutan akan mengandung senyawa nonpolar yang akan ditarik oleh senyawa non polar pula sebagai eluen. Itulah sebabnya dalam pembuatan eluen harus dibuat senyawa non polar ke polar. Penambahan eluen harus dilakukan 2 cm diatas sampel untuk menghindari sampel dan silica kering, sebab jika pada bagian silika ada yang basah dan kering akan menyebabkan tidak meratanya eluen yang akandigunakan selanjutnya. Keuntungan kromatografi kolom 1. 2. 3.
Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi Kerugian kromatografi kolom 1. Dibutuhkan kemampuan teknik dan manual 2. Membutuhkan waktu yang lama 3. Sampel yang dapat digunakan terbatas
BAB VI A. KESIMPULAN Berdasarkan hasil percobaanini, maka dapat disimpulkan bahwa dari hasil kromatografi kolom konvensional di peroleh sebanyak 10 fraksi yang dipisahkan berdasarkan tingkat kepolaran dan 6 fraksi berdasarkan perbedaan warna. B. SARAN Bimbingan dari asisten sangat kami harapkan dalam melakukan suatu praktikum agar praktikan dapat mengerjakan praktikum dengan baik
DAFTAR PUSTAKA Anonim., 2013., “Penuntun Praktikum Fitokimia II”.,UMI; Makassar Sudjadi., 1994., “Metode Pemisahan”.,Kanisius, Yogyakarta. Gritter J.R, dkk., 1991., “Pengantar Kromatografi”., Penerbit ITB, Bandung. Raymond G. Reid and Satyajit D. Sarker, 2006.Isolation of natural Product by Low-Pressure Collum Chromatografi in Sharker SD., Latif,Z and Gray , Al (ED). Natural Product Isolation Humana Press.Inc. Totowa New jersey Sastrohamidjojo, Dr.H., 1985, ”Kromatografi”, Penerbit Liberty, Yogyakarta. Stahl, E.1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis. Terjemahan kosasih P., Iwang S., Penerbit ITB ;Bandung. Wijaya, Kusuma Hembing, 1996, “Tanaman Berkhasiat Obat di Indonesia”, Jilid IV, Pustaka Kartini, Jakarta.
LAMPIRAN A. Skema Kerja B. Gambar
