KROMATOGRAFI KOLOM
I. TUJUAN Mempelajari cara pemisahan suatu campuran dengan kromotografi kolom.
II. TEORI Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik
pengotornya
maupun
hasil isolasinya.
Sebelumnya
dilakukan
percobaan tarhadap kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna. Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat padat aktif sepertialumino dan selika gel sebagai fase diam. Zat yang dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat diserap dari larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga terjadi
pemisahan
kromatogram.
dalam
kolom.
Hasil
pemisahan
ini
disebut
Umumnya pada kromatografi kolom digunakan campuran homogen seperti campuran gas dilakukan pada suatu penyerap (absorbent). Komponen penyusun campur akan diserap oleh adsoben adalah 1 : 50. Metode ini dapat memisahkan zat dari 100 mg sampai 5 mg bahkan lebih. Pemisahan campuran baik bila harga Rf = 0.6. Teknik kromatografi kolom paling sesuai untuk pemisahan hasil isolasi dari pengotornya. Pemisahan
dengan
kromatografi kolom biasanya
digunakan
absorben yang paling umum : alumunium oksida (Al 2O3) yang mempunyai daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga penggunaan memberikan hasil yang baik. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut. Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan absorben, komponen cairan lainya akan mengalir kebawah . Jadi semakin lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu mengalir ke bawah. Bila kecepatan gerak cairan itu lebih besar dari pada kecepatran absorbsi oleh absorben. Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar
akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :
Kromatografi Fase Normal Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.
Kromatografi Fase Terbalik Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal. Cara pengisian kolom terbagi dua , yaitu : 1. Cara basah
-
Isi dasar kolom dengan kapas
-
Masukkan eluen
-
Campurkan dengan rata sebagai adsorben dan eluen menjadi homogen
-
Jangan tersentuh atau diguncangkan ± 6 jam
-
Setelah stabil, masukkan eluen dan zat, lalu keluarkan eluen 2. Cara kering
-
Isi tabung dengan kapas
-
Masukkan eluen
-
Masukkan adsorben kering sedikit demi sedikit
-
Lalu di aduk
Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat: - Daya serap adsorben. - Sifat pelarut. - Suhu sistem kromotografi.
Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh : Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat. Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa. Ukuran artikel absorben. Rongga udara dalam absorben.
Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan terganggu. Faktor yang mempengaruhi proses pemisahan: -
Daya serap adsoben.
-
Jenis / sifat eluen.
-
Suhu kromatografi.
-
Pelarut yang digunakan.
III. PROSEDUR KERJA 3.1 Alat dan Bahan Adapun bahan-bahan dan peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah sebagai berikut : a.
Alat
Kolom kromatografi, alat gelas berupa kolom sebagai tempat fase diam dan media proses kromatografi. Botol vial, botol kecil dengan volume 10 mL sebagai wadah penampung hasil pemisahan. Standar dan klem, sebagai alat bantu untuk rangkaian alat kromatografi.
Gelas piala, sebagai wadah pelarut. Batang pengaduk dan corong, sebagai alat bantu untuk mengalirkan pelarut ketika memasukkannya ke dalam kolom. b. Bahan Hasil ekstrak buah naga (pada objek sokletasi) sebagai sampel uji. Silika sebagai bahan untuk fase diam. Eluent / fase gerak, berupa campuran heksan dengan etil asetat dengan perbandingan tertentu. Kapas, sebagai bahan pembatas dan penahan pada serbuk silika
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil dan Data Dari praktikum Kromatografi Kolom yang dilakukan didapatkan data-data sebagai berikut : Sampel
: ekstrak buah naga (hasil dari objek sokletasi).
Jenis Eluen
: campuran heksan dengan etil asetat, dengan sistem SGP (step gradien polarity)
Tabel Pengamatan.
No
Perbandinga
.
Heksan : Etil
Warna Zat
Asetat 1
10:0
bening
2
8:2
bening
3
6:4
Orange muda
4
4:6
orange muda
5
2:8
orange
6
0:10
orange
4.2 Pembahasan Pemisahan ekstrak buah naga ini dilakukan dengan metode kromatografi kolom, dengan sistem pelarut SGP (Step Gradieny Polarity). Langkah ini diambil
karena
belum
diketahui
jenis
eluen
yang
cocok
dengan
pemisahan ini. Sistem pelarut SGP dilakukan dengan cara menggantikan / mengubah kepolaran dari eluen yang digunakan secara bertahap. Eluen tersebut merupakan campuran dua jenis pelarut dengan kepolaran berbeda. Dengan mengubah perbandingan campurannya kita dapat menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini. Pada pengerjaannya di awali dengan satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser tingkat kepolarannya dengan mencampurkannya dengan pelarut etil asetat. Pencampuran dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan secara bertahap, hingga diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat saja sebagai eluen. Dengan ini diharapkan dapat memberikan pemisahan yang lebih baik. Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar 100 tetesan per menitnya. Aliran eluen diatur agar tidak terlalu cepat agar komponen dapat terpisah dengan. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu lambat agar proses tidak terlalu lama. Eluen mengalir
mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom dengan memanfaatkan gaya gravitasi. Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap, keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan masing-masing komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai dengan sifatsifat masing-masing komponen.. Komponen ini dibawa oleh pelarut dan tertampung
pada
vial
penampung.
Hasil
pemisahan
dapat
diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut. Kita bisa
saja
mendapatkan
komponen
murninya
dengan
pemekatan,
meskipun hasilnya tidak terlalu banyak. Untuk lebih memastikan tingkat kemurnian dari hasil pemisahan dapat kita uji dengan metode Kromatografi Lapisan Tipis. Hasil yang ada pada masing-masing vial tersebut kita uji dengan KLT sehingga bisa kita lihat apakah pada masing-masing benar-benar hanya mengandung satu komponen. Kelebihan dari metode ini jika dibandingkan dengan KLT adalah bahwa kita dapat melakukan pemisahan untuk sampel dengan jumlah yang lebih banyak. Di samping itu, kita juga bisa memperoleh hasil pemisahan tersebut dan menampungnya. Proses pemisahan pada kromatografi kolom ini bisa dikatakan sebagai bentuk sederhana dari teknik kromatografi yang dilakukan
dengan instrument kinerja tinggi. Kita juga bisa melakukan pemisahan dengan jenis eluen lain, atau dengan jenis absorben lainnya. Kolom di sini hanya sebatas berfungsi sebagai wadah. Bahan yang digunakan sebagai fase diam dapat berupa macam, baik itu dengan memanfaatkan prinsip partisi ataupun absorbsi.
V. KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Setelah melakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa dengan kromatografi kolom kita dapat memisahkan komponen penyusun dari suatu sampel bahan alam. Hasil pemisahannya disimpan dalam 6 botol vial secara terpisah untuk masing-masing jenis eluen. 5.2 Saran Belum dapat dipastikan apakah pada masing-masing vial benar-benar hanya terdapat satu jenis komponen. Untuk lebih memastikan kita dapat menguji masing-masing vial dengan menggunakan metode Kromatografi Lapisan Tipis.
Tugas Sebelum Pratikum 1. Bagaimana cara memilih eluen untuk kromatografi kolom? Jawab : Dengan meneteskan pada plat lapis tapis, jika KLT hasilnya bagus dari totolan suatu zat dan berbentuk bulatan maka eluen tersebut baik untuk kromatografi kolom. 2. Faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi proses pemisahan? Jawab :
-
Pemilihan adsorben sebagai fase diam
-
Kepolaran pelarut yang akan dipisahkan
-
Laju elusi atau aliran fase gerak
3. Jelaska metoda pengelusian yang digunakan pada kromatografi kolom! Jawab : a.
Step graden polarity, dimana noda yang tampak sehingga hasil kromatografi kolom pada plat KLT sangat berdekatan.
b. Kokratik, dimana noda yang tampak sehingga hasil kromatografi kolom pada plat KLT berimpit dengan kepolaran.
DAFTAR PUSTAKA http://asyharstf08.wordpress.com/2010/02/25/kromatografi-kolom-danlapis-tipis
http://wiro-pharmacy-blogspot.com/2009/10/kuliah-kromatografi-kolombagian 1.html
http://www.chem-istry.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian_material/ kromatografi
http://www.chem-is-try.org/wp-content/migrated_images/analisis/ column1.gif
LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS BAB I PENDAHULUAN
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi. Kromatografi telah didefinisikan terutama sebagai suatu proses pemisahan yang digunakan untuk pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler. Kromatografi bergantung pada pembagian-ulang molekul-molekul campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi adsorbs, kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah: partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya kromatografi kolom), kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam tiap kasus terjadi distribusi antara fase ‘cair’ yang terserap secara ‘stasioner’ dan
zat-alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu pendukung; dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastic. Hanya akan dibahas aspekaspek yang dipilih dari kromatografi partisi pada selulosa dengan rujukan khusus ke analisis anorganik. Maksud percobaan adalah untuk mengetahui metode penentuan kima secara kromatografi lapis tipis. Tujuan percobaan adalah untuk memisahkan campuran senyawa fase dengan metode kromatografi lapis tipis dan untuk mengetahui nila Rf Prinsip percobaan adalah adsorbs dan partisi dimana adsorbs adalah penyerapan pada pemulaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu saat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan.
BAB II PEMBAHASAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan peramabatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan KLT dikembangkan oleh Ismailoff dan Schraiberpada tahun (1938). Tekniknya menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis sepreti lempeng kaca, aluminium atau plat inert. Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai factor resensi, Rf: Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan: a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr) b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel) c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukat ion) d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel) Pada fase gerak, pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam Tabel 25, yang meliputi (sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol) benzene, sikloheksana, dan eter petroleum. KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu: 1. Waktu pemisahan lebih cepat 2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi. 3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.
Aspirin, phenacetin dan kofein (APC) sering digunakan dalam kombinasi sebagai sediaan antipiretik analgetik. Penentuan dan identifikasinya sangat penting yang dapat dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Prosedur di sini mengikuti Ganshirt dan Malzachur dan penyiapan lempeng sederahan menurut metode Less dan De Muria. Noda ditampakkan dengan semprotan permanganat dalam suasana asam, yang akan mengoksidasi senyawa sampel hingga menghilangkan warna permanganate.
BAB III METODE KERJA A. Alat-alat yang digunakan 1. Batang pengaduk 2. Bejana KLT (chamber) + tutup 3. Botol semprot 4. Erlenmeyer 5. Gelas kimia 6. Gelas objek / plat KLT 7. Isolasi 8. Pipa kapiler B. Bahan-bahan yang digunakan 1. Asam asetat glacial 2. Asam kromat 3. Asam sulfat 4. Benzene 5. Dietileter 6. Kalium permanganate 7. Kloroform 8. Methanol absolute 9. Sampel 10. Silika gel 11. Zat pembanding C. Cara kerja 1. Penyiapan lempeng 1.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan 1.2 Dibersihkan 8 glas objek (25mm x 75mm) dengan larutan asam kromat. Kemudian asam sulfat, dibilas dengan air dan dikeringkan 1.3 Dibuat bubur, dari 3gram silika gel G dan 6 ml air diaduk dengan mortis. 1.4 Bubur yang sudah jadi dilapiskan pada plat (glas objek) dengan menggunakan batang pengaduk dengan ketebalan sekitar 0,1mm sampai 0,3mm.
1.5 Dikeringkan, setelah kering dipindahkan glas objek ke oven dan diaktifkan pada suhu 1000C Selma 1 jam. 1.6 Plat atau lempeng yang sudah diaktifkan disimpan dalam desikator. 2. Penyiapan pengembang kromatografi 2.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan 2.2 Dipipet 1ml methanol absolute, 18,090 ml asetat glacial, 60,301ml, dietileter, dan 120,60ml benzene 2.3 Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dihomogenkan 2.4 Dimasukkan ke dalam chamber secukupnya 2.5 Dijenuhkan chamber dengan menutup sambil digoyang kemudian didiamkan. 3. Penotolan sampel 3.1 Disiapkan alat dan bahan 3.2 Sampel dilarutkan dalam kloroform 5-10mg/ml, kemudian ditotolkan pada ujung lempeng (kurang lebih 1,5cm dari ujung) menggunakan pipet halus (pipa kapiler untuk penentuan titik leleh). Diameter totolan boleh lebih dari 3cm. 3.3 Dianginkan sampai kering. 4. Eluen dengan larutan pengembang 4.1 Disiapkan alat dan bahan 4.2 Lempeng yang sudah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber, kemudian ditutup dengan segera. 4.3 Setelah permukaan pelarut naik kurang lebih 5cm atau kira-kira 1cm dari ujung atas, diangkat lempeng dari chamber. 4.4 Diberi tanda posisi pelarut lalu dikeringkan di ujung 4.5 Dimasukkan ke dalam oven beberapa menit untuk menghilangkan pelarut organik.
URAIAN BAHAN 1. Asam asetat (FI edisi III, hal 42) Nama resmi
: ACIDUM ACETICUM GLACIALE
Nama lain
: Asam asetat glacial
Rumus molekul
: C2H2O2
Berat molekul
: 60,05
Pemerian
: Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas, tajam, jika
diencerkan dengan air, rasa asam Kelarutan
: Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%) P
dan dengan gliserol P Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat
Kegunaan
: Zat tambahan
2. Asam kromat (FI edisi III, hal 650) Larutkan 84gram kromtrioksida P dalam 700ml air, tambahan 400ml asam sulfat P perlahan-lahan sambil diaduk. 3. Asam sulfat (FI edisi III, hal 58) Nama resmi
: ACIDUM SULFURICUM
Nama lain
: Asam sulfat
Rumus molekul
: H2SO4
Berat molekul
: 98,07
Pemerian
: cairan kental seperti minyak, korosit, tidak berwarna, jika
ditambahkan ke dalam air menimbulkan panas. Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat.
Kegunaan
: Zat tambahan
4. Benzen (FI edisi III, hal 658) Benzen P C6H6, cairan tidak berwarna, transparan mudah terbakar pemerian cairan transparan: tidak berwarna, mudah menyala. 5. Coffeinum (FI edisi III, hal 175) Nama resmi
: COFFEINUM
Nama lain
: kofein
Rumus molekul
: C8H10N4O2
Berat molekul Pemerian
: 194,19 : serbuk hablur berbentuk jarum, meningkat biasanya
menggumpal putih, tidak berbau, rasa pahit. Kelarutan
: agak sukar larut dalam air dan etanol 95% P,
mudah larut dalam kloroform P. Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup baik.
Kegunaan
: Stimulan saraf pusat kardiafik.
6. Dietil eter (FI edisi III, hal 650) Nama resmi
: DIETIL ETER
Nama lain
: Dieti, eter
Rumus molekul RJ Jarak didih
: C2H5O : 0,714 gram – 0,78 gram : Tersuling sempurna pada suhu antara 340C dan 360C.
7. Methanol (FI edisi III, hal 706) Nama resmi
: METANOLUM
Nama lain
: methanol
Rumus molekul
: CH2OH
Berat jenis
: 0,796 – 0,798
Pemerian
: Cairan jernih tidak berwarna, bau khas
Kelarutan jernih tidak berwarna.
: Dapat bercampur dengan air membentuk cairan
Pembahasan Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fitokimia dengan adsorbs pada lapisan tipis adsorben dikenal dengan namaThin Lager Chormatografi ( TLC). Prinsip kerja KLT adalah partisi dan adsorbs dimana aleum sebagai fase gerak dan lempeng KLT sebagai fase diam. KLT sebagai salah satu metode instrumental yang sering digunakan, karena mempunayi keuntungan antara lain sebagai berikut : 1. Peralatan yang diperlukan sedikit 2. Waktu analisis yang cepat 3. Hasil pemisahan lebih baik 4. Daya pemisahan tinggi 5. Pengerjaannya sederhana dan mudah 6. Harganya terjangkau Dalam praktikum yang telah digunakan fase gerak yaitu eluen dan terdiri dari methanol absolute, asam asetat glacial, dietil eter, dan benzene dengan perbandingan 1 : 18 : 60 : 120, dan fase diam digunakan lempeng KLT yang mana telah dilapisi dengan silika gel yang berfungsi sebagai penyerap atau penyangga atau sampel dan eluen. Sebelum lempeng yang dielusi dengan sampel dimasukkan kertas saring. Chamber yang berisi eluen yang akan merambat keluar melalui kertas saring. Alasan mengapa eluen harus dijenuhkan yaitu agar tekanan dalam chamber sama agar noda yang dihasilkan sesuai dengan diinginkan
