LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI KOLOM, KROMATOGRAFI CAIR VAKUM, DAN MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography) EKSTRAK DAUN JAMBU BIJI (Psidium guajava L.)
OLEH: PUTRI SAKINAH YAYU PERMATASARI SILVA MALIKU REZKY APRHODYTA HUTRI ARDIYANTO NAHDIAH W
N111 12 109 N111 13 004 N111 13 026 N111 13 312 N111 13 519 N111 13 521
KELOMPOK IV GOLONGAN SENIN PAGI ASISTEN: DIAN MEGAWATI AMIN PUTRI MAKASSAR 2015
BAB I PENDAHULUAN I.1
Latar Belakang Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak
berhubungan dengan sifat spesifik senyawa. Analisis meliputi pengambilan cuplikan,
pemisahan
dimaksudkan,
senyawa
pemekatan
pengganggu,
terlebih
dahulu
isolasi
sebelum
senyawa
yang
identifikasi
dan
pengukuran. Banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906. Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak,
memperkolasi
melalui
celah-celah
fasa
diam.
Gerakan
fasa
menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dan sering dilakukan di laboratorium. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif.
Oleh karena itu untuk memisahkan komponen-komponen
yang terdapat dalam ekstrak sampel maka dilakukan dengan metode
kromatografi kolom, kromatografi cair vakum, dan MPLC (Medium Pressurre Liquid Chromatography).
I.2
Maksud Percobaan
1. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan metode kromatografi kolom. 2. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan metode kromatografi cair vakum. 3. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan metode MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography).
I.3
Tujuan Percobaan
1. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi kolom berdasarkan tingkat kepolarannya. 2. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi cair vakum berdasarkan tingkat kepolarannya. 3. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography) berdasarkan tingkat kepolarannya.
I.4
Prinsip Percobaan
1. Pemisahan senyawa dengan metode kromatografi kolom berdasarkan absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam dengan cara melarutkan campuran yang akan diuji dalam sedikit pelarut lalu dimasukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Karena adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen, senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut/dengan tanpa tekanan udara masing-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. 2. Pemisahan senyawa dengan
metode
kromatografi
cair
vakum
berdasarkan pemisahan secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat dengan bantuan pompa vakum. 3. Pemisahan senyawa dengan
metode
MPLC
pemisahan di bawah tekanan. BAB II TINJAUAN PUSTAKA II.1 Kromatografi
berdasarkan
prinsip
Kromatografi adalah cara pemisahan zat khasiat dan zat lain yang ada dalam sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir (2). Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama (3). Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari campuran
bersama-sama.
Komponen-komponen
yang
berbeda
akan
bergerak pada laju yang berbeda pula (3). Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertimggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (4).
II. 2
Kromatografi Kolom
Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan untuk pemurnian senyawa di laboratorium (5).
Gambar 1. Alat Kromatografi Kolom Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampelsampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa
panjang
kolom
harus
sekurang-kurangnya
10
kali
ukuran
diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan (6).
Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relatif zat terlarut melalui sistem. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon (5). Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing-masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri (dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut. Kromatografi kolom terdiri dari 2 fase yaitu (7): 1. Fase Diam
Fase stationer dalam kromatografi kolom adalah zat padat (adsorben). Fase diam yang paling umum digunakan adalah silica gel yang diikuti alumina. Fungsi dari fase diam adalah untuk menahan sampel bergerak di sepanjang kolom. 2. Fase Gerak Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi kolom berupa campuran pelarut atau pelarut murni (eluent). Fungsi fase gerak adalah mengalirkan analit (sampel) untuk bergerak di sepanjang fase diam sampai akhirnya terelusi. Ukuran penyerap untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Kemasan kolom biasanya 63-250 µm, untuk kolom yang dijalankan dengan gaya
tarik
bumi,
kolom
yang
dijalankan
dengan
tekanan, apakah
menggunakan udara atau pompa, biasanya mengandung partikel 40-63 µm atau lebih halus (8). Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam : (7) a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi. b. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi. Pada kromatografi kolom ukuran silika 1:100 karena berdasarkan penelitian/pengalaman itu merupakan perbandingan yang paling tepat untuk panjang kolom dalam menghasilkan pemisahan senyawa yang baik, mengingat pemisahan dipengaruhi oleh panjang dan diameter kolom, semakin panjang kolom semakin baik untuk melakukan pemisahan. Pada kromatografi cair vakum digunakan 1:10 karena kapasitas dari gelas masir tidak mencukupi jika menggunakan perbandingan 1:100, jadi biasanya menggunakan perbandingan 1:10, intinya pemisahan dipengaruhi oleh panjang dan diameter dari silika, semakin panjang dan lebar diameternya, maka pemisahan akan semakin baik. (12) Kromatografi kolom dari larutan dibutuhkan tabung pemisah tertentu yang diisi dengan bahan sorpsi dan juga pelarut pengembang yang berbeda. Tabung pemisah yang diisi dengan bahan sorpsi disebut kolom pemisah.
Tergantung dari masalah bahan pemisahan dapat digunakan tabung filter dengan gelas berpori yang pada ujung bawah menyempit (tabung Allihn) atau tabung gelas, yang pada ujung bawah menyempit dan dilengkapi dengan kran. Tabung bola jarang digunkan. Perbandingan panjang tabung terhadap diameter pada umumnya adalah 40:1. Harga 20 berlaku sebagai batas bawah (9). Pengisisan tabung pemisah dengan adsorben, yang juga disebut kemasan kolom, harus dilakukan secara hati-hati, harus rata. Aluminium oksida atau silika gel dapat diisikan kering ke dalam tabung pemisah. Agar pengisian rata, tabung setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu. Adsorben lainnya harus diisikan sebagai suspensi, terutama jika zat ini menggelembung dengan pelarut pengembang. Yang umum dilakukan adalah, adsorben dibuat seperti bubur dengan pelarutelusi, kemudian dimasukkan ke dalam tabung pemisah. Sebagai bahan sorpsi digunakan bahan yang sama dengan kromatografi lapis titpi yaitu silika gel, aluminium oksida, poliamida, selulosa, selanjutnya juga arang aktif dan gula tepung. Tergantung dari cara pengembangan dapat dibedakan kromatografi elusi, kromatografi garis depan dan kromatografi pendesakan (9). Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertical (10). Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),
ukuran kolom (diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum (10). Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara, nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan
partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya,
zat
terlarut
akan
terpisahkan
membentuk
beberapa
lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat terlarut dengan persamaan berikut. R = (jarak yang ditempuh zat terlarut)/(jarak yang ditempuh pelarut/fasa mobil) (11). Kromatografi kolom karena memiliki aliran konstan solusi eluted melewati
detektor
dalam
berbagai
konsentrasi,
detektor
harus
plot
konsentrasi dari sampel eluted selama perjalanan waktu. Plot konsentrasi sampel terhadap waktu disebut kromatogram. Resolusi mengungkapkan tingkat pemisahan antara komponen-komponen dari campuran. Semakin tinggi resolusi kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom memberi (12). Faktor-faktor yang digunakan untuk evaluasi kinerja kolom yaitu (12): 1. Efisiensi Kolom Kromatografi Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling sederhana adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi. 2. Resolusi (Daya Pisah) Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat pemisahan
komponen
dalam
suatu
campuran
dengan
metode
kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang (overlapping) atau tidak ada tumpang tindih sama sekali. Resolusi komponen-komponen dalam kromatografi tergantung pada waktu retensi relatif pada sistem kromatografi tertentu dan tergantung pada lebar puncak. 3. Faktor Asimetri (Faktor Pengekoran) Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran (tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak simetri. Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak setangkup), maka suatu perhitungan asimetris merupakan cara yang berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi. Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekulmolekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya,
dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama. Dalam bidang klinik, teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat. Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam. Pada metode kromatografi kolom mempunyai keuntungan dan kerugian, yaitu (14): Keuntungan: 1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif
2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran 3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi Kerugian: 1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual 2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.
Kromatografi Kolom Isap : 1. Suction Colomn Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. (12) 2. Rapid-Sigel Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. . (12) 3. Press Colomn Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi. . (12)
II. 3 Kromatografi Kolom Vakum
Kromatografi kolom vakum merupakan kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas
kering
dalam
keadaan
vakum
agar
diperoleh
kerapatan
maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya (9).
Gambar 2. Alat Kromatografi Vakum Cair Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas kering biasanya dengan penyerap mutu kromatografi lapis tipis10-4 µg pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh
kemasan yang maksimum, kemudian vakum dihentikan dan pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan kedalam permukaan penjerap lalu divakum lagi, kolom dihisap sampai keringdan kolom sekarang siap dipakai (9). Fraksi 1
Pelarut Heksana Heksana-etil
2 3
asetat Etil asetat Etil asetat-
4
Komposisi 100
Volume (ml) 100
50:50
100
100
100
75:25
100
50:50
100
25:75
100
metanol Etil asetat5 metanol Etil asetat6
metanol 7 Metanol 100 100 Tabel 1. Urutan pelarut yang digunakan dalam Kromatografi Cair Vakum Salah
satu
cara
pemisahan
adalah
kromatografi
cair
vakum,
kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5 cm, kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran ini digenis sampai homogen, dikeringkan dandimasukkan ke dalam corong G-
3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas saring. Elusi diawali dengan pelarut nonpolar dilarutkan dengan kombinasi pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap kali elusi adalah sebagai berikut: untuk bobot ekstrak sampai lima gram diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut. Dalam hal ini diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum. Masing-masing
ekstrak
ditampung
dalam
wadah
terpisah
sehingga
menghasilkan sejumlah fraksi (10). Kromatografi cair vakum dapat digunakan untuk fraksinasi dan memurnikan fraksi. Metode KCV digunakan karena lebih efektif dan efisien dalam pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi. Kromatografi cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para ilmuwan dari Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk separasi menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini adalah kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Kromatografi cair vakum pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan produk-produk natural dari laut. Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu corong Buchner yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan
fase diam yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam kromatografi lapis tipis (70-230 mesh) (11). Corong Buchner yang berisi fase diam ini digunakan dalam kondisi vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan yang dihasilkan oleh kromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi gravitasi namun diperlukan
waktu
yang
lebih
singkat.
Cara
asli
yang
diperkenalkan oleh Coll menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek sedangkan target menggunakan kolom yang lebih panjang untuk meningkatkan daya pisah (11). Kromatografi
Vakum
Cair
mempunyai
keuntungan
yang
utama
dibandingkan kolom konvensional yaitu (12): 1
Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100μl/menit).
2
Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3
Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal sampel klinis. Adapun kerugian dari KCV (Kromatografi Vakum Cair) yaitu (12): 1. Membutuhkan waktu yang cukup lama 2. Sampel yang dapat digunakan terbatas
II.4
MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography) (15) Middle Pressure Liquid Chromatography (MPLC) adalah salah satu
dari berbagai jenis teknik kromatografi kolom preparatif. Pemisahan di bawah tekanan memungkinkan penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil dan meningkatkan keragaman fase diam yang dapat digunakan. Pada dasarnya MPLC atau yang dikenal dengan Sepacore adalah pemisahan yang menggabungkan keuntungan dari kromatografi kolom dan vakum, senyawa yang dapat dipisahkan dari instrumen ini adalah senyawa metabolit sekunder meliputi senyawa alkaloid, streoid/terpenoid, flavanoid, tannin, fenolik, saponin dan senyawa metabolit sekunder lainnya.(2) MPLC diperkenalkan pada tahun 1970 sebagai salah satu teknik yang efisien untuk pemisahan preparatif senyawa organik. MPLC mampu mengatasi salah satu kelemahan utama dari Low Pressure Liquid Chromatography (LPLC), yaitu terbatasnya sampel yang dapat digunakan. Metode pemisahan ini sekarang sering digunakan baik sendiri atau dalam kombinasi dengan alat preparatif umum lainnya seperti kromatografi kolom terbuka, kromatografi Sash, LPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi preparatif (HPLC). Perbedaan antara kromatografi cair tekanan rendah, tekanan menengah, dan tekanan tinggi didasarkan pada rentang tekanan yang diterapkan dalam teknik ini. MPLC memungkinkan pemisahan senyawa dalam jumlah besar, dan tidak seperti kromatografi kolom terbuka dan
kromatografi Sash, MPLC dapat meningkatkan hasil pemisahan yang diperoleh dan waktu yang diperlukan lebih singkat. Pengepakan bahan dengan ukuran partikel yang lebih rendah di bawah tekanan meningkatkan kualitas pemisahan serta fase padatnya dapat digunakan kembali. Instrumen MPLC ini terdiri dari pompa untuk pelarut, sistem injeksi sampel, dan pengemasan kolom. Pemisahan produk dapat diikuti secara manual dengan memonitor dengan kromatografi lapis tipis (TLC) atau secara otomatis dengan detektor dan perekam yang terhubung ke kolom outlet. Senyawa yang dipisahkan dikumpulkan oleh kolektor fraksi. 1 Pompa Pemisahan kromatografi 0,1-100 g sampel dalam beberapa jam membutuhkan laju aliran 5-200 ml/menit, dengan tekanan maksimum 40 bar. Kriteria untuk memilih pompa MPLC meliputi: rentang laju aliran; ada tidaknya peredam, yang menyediakan laju aliran dan tekanan selama proses
pemisahan
dan
meningkatkan
reprodusibilitas
pemisahan;
keberadaan perangkat pemutus tekanan; dan adanya pembuat gradien. 2 Kolom Kolom adalah titik pusat ketika mengoptimalkan pemisahan kromatografi preparatif dan kriteria seperti jumlah sampel yang akan dimurnikan, jumlah bahan kemasan, dan penjang serta diameter kolom, harus dipertimbangkan dengan cermat. Kolom MPLC umumnya terbuat dari kaca tebal yang dilapisi denga plastik pelindung dan dapat menahan tekanan sampai 50 bar; Namun, beberapa kolom dari beberapa produsen
tidak bisa menahan tekanan melebihi 20 bar. Kolom juga bervariasi dalam penjang dan diameternya (i.d.), ukuran kolom ini digambarkan sebagai volume pengisian. Volume pengisian ini berkisar antara 63 ml (9 mm (i.d.) x 100 mm) sampai 15000 ml (105 mm i.d. x 1760 mm). Pemilihan dimensi kolum bergantung pada jumlah sampel yang akan dipisahkan, dengan kisaran antara 0,1 g dengan kolom paling kecil hingga 100 g dengan kolom yang besar. 4 Detektor dan Rekorder Monitoring pemisahan MPLC dapat dilakukan dengan KLT dari fraksi yang terkumpulkan. Deteksi secara online juga rutin digunakan dengan detektor panjang gelombang tunggal
UV/Vis. Detektor UV biasanya didesain
untuk tujuan analisis dan fungsinya tidak memberi manfaat besar dalah pemisahan preparatif. Akomodasi untuk laju aliran tinggi merupakan prasyarat untuk detektor kromatografi preparatif. 5 Kolektor Fraksi Pengumpulan
otomatis
dari
fraksi
dapat
dilakukan
dengan
menghubungkan kolektor fraksi dengan outlet kolom atau detektor. Volume dari fraksi yang terkumpulkan bergantung pada diameter internal kolom dan laju aliran. Pada standar pengaturan MPLC, kolektor frraksi memiliki total kapasitas tube 240 x 20 ml, 120 x 50 ml, atau 48 x 250 ml.
Gambar 3. Medium Pressure Liquid Chromatography II.2
Uraian Bahan
1.
Etil asetat (1) Nama Resmi
: Etil asetat
Nama Lain
: Etil asetat
RM
: CH3CO.O.C2H5
Pemerian
: Cairan, tidak berwarna, bau khas
Kelarutan
: Larut dalam 15 bagian air, dapat bercampur dengan etanol (95%)P dan dengan eter P.
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup baik
Kegunaan
: Sebagai eluen dan larutan partisi
2. n-Heksana (1) Nama resmi Nama lain RM/BM Pemerian
: HEXAMINUM : Heksamina : C6H12N4 / 140,19 : hablur mengkilap, tidak berwarna atau serbuk hablur putih, tidak berbau, rasa membakar dan manis kemudian agak pahit. Jika di panaskan
dalam suhu ± 260⁰ menyublim. Kelarutan
: larut dalam 1,5 bagian air, dalam 12,5 ml etanol (95 %) P dan dalam lebih kurang 10 bagian kloroform P
Penyimpanan Kegunaan
: dalam wadah tertutup baik : antiseptikum
BAB III METODE KERJA III. 1
Alat dan Bahan
III.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom, statif, botol vial, botol coklat, gelas ukur, dan pipet tetes. III.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan ekstrak jambu biji yang tidak larut heksan (non polar), kapas, silica, n-heksan, etil asetat dan kapas.
III.2 Cara Kerja Kromatografi Kolom 1. 2. 3. 4.
Disiapkan alat dan bahan Dibuat gradian konsentrasi sesuai eluen terbaik yang didapatkan Dimasukkan kapas kedalam kolom Kemudian dimasukkan silika yang sebelumnya telah disuspensikan
dengan n-heksan dan dimampatkan 5. Dimasukkan kertas saring sesuai besar diameter kolom 6. Dimasukkan sampel sebanyak 1 gram 7. Dimasukkan gradient konsentrasi eluen dari yang paling non polar hingga paling polar 8. Ditampung hasil dalam botol vial
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil Percobaan No Eluen 1 Heksan : Etil asetat = 10:1 2 Heksan : Etil asetat = 8:1 3 Heksan : Etil asetat = 6:1 4 Heksan : Etil asetat = 4:1 5 Heksan : Etil asetat = 1:3 6 Heksan : Etil asetat = 1:3 7 Heksan : Etil asetat = 1:4 8 Heksan : Etil asetat = 1:6 LABORATORIUM FITOKIMIA 9FAKULTAS Heksan : Etil asetat = 1:8 FARMASI 10UNIVERSITAS Heksan HASANUDDIN : Etil asetat = 1:10 11 Etil asetat 100%
Jumlah (ml) Warna fraksi 50 ml Kekuningan 50 ml Kekuningan 50 ml Kekuningan 50 ml Kekuningan 50 ml Bening 50 ml Bening 50 ml Kehijauan 50 ml Kehijauan LABORATORIUM FITOKIMIA 50 ml Kehijauan FAKULTAS FARMASI 50 ml Kekuningan UNIVERSITAS HASANUDDIN 50 ml Bening
IV.2 Gambar Hasil Percobaan
Penimbangan ekstrak 1 gram
Penimbangan silika
LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
Deret eluen yang digunakan
LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
Proses kromatografi kolom
LABORATORIUM FITOKIMIA FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN
Penampungan fraksi hasil pemisahan Fraksi hasil pemisahan dengan kromatograifi kolom
BAB V PEMBAHASAN Pada percobaan ini dilakukan pemisahan komponen senyawa pada sampel ekstrak daun jambu biji (P. guajava) dengan menggunakan kromatografi kolom. Alat dan bahan disiapkan, kemudian ditimbang silika sebanyak 100 gram. Silika kemudian disuspensikan dengan n-heksan, lalu dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding sembari dimampatkan agar tidak ada gelembung udara dan keran kolom dibuka. Setelah silika mencapai dua per tiga dari tinggi kolom, dimasukkan kertas saring ke dalam kolom, lalu dimasukkan sampel yang telah diserbukkan sebelumnya dengan silika. Ekstrak sampel yang digunakan yaitu ekstrak hasil partisi metode ECP yaitu ekstrak tidak larut heksan, karena senyawa yang ingin diisolasi adalah senyawa flavanoid yang sifatnya semi polar sampai polar . Setelah itu, dimasukkan eluen mulai dari yang paling non polar, dan ditampung hasil fraksi yang dihasilkan dalam vial yang telah dikalibrasi 5 ml.
Dimasukkan eluen atau campuran eluen berikutnya dari yang kurang polar hingga yang paling polar. Ditampung hasilnya dalam vial. Eluen yang digunakan adalah heksan:etil asetat = 10:1, heksan:etil = 8:1, heksan:etil asetat = 6:1, heksan:etil asetat = 4:1, heksan:etil asetat = 1:3, heksan:etil asetat = 1:4, heksan:etil asetat = 1:6, heksan:etil asetat = 1:8, heksan:etil asetat = 1:10, dan etil asetat 100% masing-masing sebanyak 50 ml. Elusi yang dilakukan pada kromatografi kolom dilakukan dari eluen non polar ke eluen polar, agar pemisahan yang terjadi dapat menghasilkan pemisahan senyawa yang baik, dimana ketika eluen polar yang terlebih dahulu dilewatkan, maka senyawa yang sifatnya polar maupun non polar akan ikut terelusi, karena kemampuan yang dimiliki oleh pelarut polar dapat melarutkan senyawa yang sifatnya polar dan non polar sehingga pemisahan tidak terjadi, berbeda ketika eluen non polar yang dilewatkan terlebih dahulu, kemampuan eluen non polar hanya dapat melarutkan/mengelusi senyawa non polar. Hasil partisi yang tertampung adalah 68 vial dengan berbagai variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.
BAB VI PENUTUP VI.1 Kesimpulan Dari kromatografi kolom yang dilakukan dengan menggunakan ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava) di dapatkan hasil fraksi sebanyak 68 vial dengan berbagai variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.
VI.2 Saran Semoga komunikasi antar praktikan dan asisten bisa lebih terjaga sehingga segala hal yang berkaitan dengan praktikum dapat berjalan dengan baik dan tidak terjadi kesalahpahaman.
DAFTAR PUSTAKA 1. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Departemen Kesehatan RI. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta. 2. Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar: Yogyakarta. 3. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung. 4. J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB: Bandung. 5. K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. Penerbit ITB: Bandung.
6. Skoog DA, West DM, Holler FJ. 1996. Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th edition. New York: Saunders College Publishing. Hal. 1725. 7. Alam, Gemini, dkk. 2011. Penuntun Pratikum Senyawa Bioaktif. Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin : Makassar 8. Kisman .Dr. Sastro ,ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2 , Gadjah Mada University Press, Yogyakarta 9. Johnson, Edward. 1991.Dasar Kromatografi Cair Penerbit ITB. Bandung 10. Soediro. I., dkk. 1986.
Kromatografi
Cepat
Sebagai
Cara
Fraksinasi Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia 11. Adriana, Renalitha Devri. 2009. Skripsi : Aktivitas Antiplasmodium Fraksi Non
Polar
Ekstrak
Etanol
Rimpang
Temu
Mangga.
Universitas
Muhammadiah Fakultas FarmasI. Surakarta 12. Meronda, G.Rahmah. 2008. Kromatografi, Makalah. FFUH. Dikutip dari Kromatografi Makalah journal. Makassar 13. Anonim. 2007. Kromatografi Kolom . (Online) http://www.chem-is-try.org. Diakses tanggal 14 November 2011 14.
Roy
J. Gritter,
James M.
Bobbit, Arthur
E. S.,
1991.
Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung. 15. Hostettmann, K and C. Terreaux. 2000. Medium-Pressure Liquid Chromatography. Academic Press.
University
of
Lausanne,
Lausanne,
Switzerland:
A.
LAMPIRAN Skema Kerja Kromatografi Cair Vakum Penyiapan Ekstrak Ekstrak ditimbang
Ekstrak herba Eupatorium Oderatum dikeringkan dengan penambahan silika Sedikit demi sedikit
Digerus hingga kering
Sisa silika disimpan
B.
Ekstrak siap digunakan
Proses Partisi Disiapkan gelas masir dan erlenmeyer
Dirangkai alat vakum
Dimasukkan silica halus mampatkan Dimasukkan ekstrak kering
Dimasukkan kertas saring
Dimasukkan perbandingan eluen
Dinyalakan pompa vakum
Ditampung dimangkok
Diuapkan
Kromatografi Kolom
Penyiapan Bubur Silika Ditimbang silika kasar dan ekstrak
Diperoleh bobot silika kasar 100x dari ekstrak
Dibagi menjadi 2 bagian
Bagian pertama dimasukkan di cawan porselen Bagian kedua untuk penyiapan sampel
Dibasahkan dengan pelarut hexan
Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya
Diamkan beberapa saat (sekali-sekali diaduk)
Silika siap digunakan
Penyiapan Ekstrak Ekstrak ditimbang
Ekstrak dikeringkan dengan penambahan sisa silika tadi
Sedikit demi sedikit
Digerus hingga kering
Sisa silika disimpan
Ekstrak siap digunakan
Proses Partisi Dirangkai alat kolom
Dimasukkan kapas pada buret kolom
Dimasukkan bubur silika mampatkan Dimasukkan ekstrak kering
Dimasukkan kertas saring
Dimasukkan perbandingan eluen
Ditampung di vial
Diuapkan
