LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA “Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom”
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
TINJAUAN PUSTAKA 1. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini memungkinkan untuk melakukan pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Komponen tunggal yang ada pada sampel dijerap oleh fase diam yang telah dibentuk atau biasa digunakan silica gel yang terdapat pada kolom, namun apabila dialirkan pelarut secara kontinyu maka akan terjadi migrasi senyawa dan senyawa tersebut terbawa oleh pelarut sesuai dengan polaritasnya. Kecepatan eluasi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan eluasi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan baik. Dan apabila kecepatan eluasi terlalu besar maka pemisahan kurang baik dan tidak berdasarkan tingkat polaritas nya sehingga akan diperoleh fraksi yang sama dan menyebabkan fase diam cepat menjadi kering dan dikhawatirkan terjadi cracking. Permukaan adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama proses eluasi berjalan. Cara kerja kromatografi kolom adalah komponen tunggal ditahan pada fasa diam berupa adsorben karena telah terikat. Ketika eluen dialirkan, maka senyawa akan melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan kesesuaian kepolaran. Masingmasing senyawa dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda-beda dalam melewati kolom. Selama proses berlangsung, akan didapatkan beberapa fraksi. Masing-masing fraksi kemungkinan mengandung senyawa yang berbeda. Untuk mengujinya, fraksi hasil kromatografi kolom dapat diamati menggunakan KLT. Fraksi dengan Rf yang mirip, kemungkinan mengandung senyawa yang sama. Fraksi dapat diamati lebih lanjut meggunakan spektroskopi. Kromatografi kolom atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Persyaratan penting dalam penggunaan KLT adalah bahwa zat atau campuran zat yang akan dianalisis harus larut dalam pelarut atau campuran pelarut.
Jenis-jenis kromatografi antara lain : 1. Kromatografi padatan cair (LSC) Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel- partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer. 2. Kromatografi partisi Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian fasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC). Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam. 3. Kromatografi penukar ion (IEC) Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion. 4. Kromatografi eksklusi Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan danditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekulmolekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui
kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. 5. Kromatografi pasangan ion (IPC) Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi,
kromatografi
dengan
suatu
cairan
penukar
ion
dan
paired
ion
chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
Tinjauan Konstatnta Dielektrik
n-heksana
= 2.0
kloroform
= 4.8
etilasetat
= 6.0
methanol
= 30.0
semakin tinggi nilai konstanta dielektrik suatu pelarut, maka semakin polar senyawa pelarut tersebut. Proses penyiapan fasa diam dalam kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu (Sarker, 2006): a) Cara Basah Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan. b) Cara kering Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan. Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Sarker, 2006).
1. PROSEDUR KERJA o
Lakukan optimasi ekstrak dengan cara uji KLT terhadap ekstrak dengan menggantiganti eluen sampai diperoleh pemisahan yang baik. Eluen tersebut akan digunakan untuk fraksinasi.
o
Siapkan kurang lebih 50 gram silica gel.
o
Siapkan eluen dari butir (a) sebanyak 300 ml
o
Silica gel dimasukkan kedalam labu Erlenmeyer, kemudian ditambahkan sedikit eluen, kocok selama 15 menit.
o
Campur butir (d) tersebut dituang kedalam kolom sampai setinggi 10 cm dari atas.
o
Tuangkan ke dalam kolom sampai penuh, tutup deengan aluminium foil, biarkan semalam.
o
Timbang ekstrak sebanyak 1% dari jumlah silica gel yang digunakan, kemudian ekstrak ditambahkan sedikit pelarut (etanol/methanol) ad larut dicampur denga silica gel sama banyak, diaduk-aduk menggunakan gelas pengaduk sampai homogeny dan kering.
o
Eluen dialirkan sampai permukaannya 0,5 cm diatas permukaan silica gel
o
Ekstrak yang sudah dikeringkan dengan silica gel, dimasukkan kedalam kolom (diatas permukaan silica gel), lalu ditambahkan eluen kira-kira setinggi 3 cm. eluen dialirkan/diteteskan sambil dituangi eluen baru sampai kolom terisi penuh dengan eluen, sementara penetesan tetep dilakukan. Kecepatan penetesan diatur.
o
Penempungan eluen setiap vial sebanyak 5 ml.
o
Dilakukan uji KLT untuk setiap kelipatan 10 vial (vial no. 1, 10, 20, 30, 40 dst). Pada uji KLT, fase gerak yang digunakan adalah sama dengan fase gerak pada kromatografi kolom.
o
Bila uji KLT memberikan noda yang sama, maka fraksi diantaranya dapat digabung.
o
Bila uji KLT memberikan noda yang berbeda, maka uji KLT dilakukan pada vial diantaranya (bila vial no 10 dan 20 berbeda, maka vial no 15 dilakukan uji KLT)
o
Penetesan dihentikan bila vial terakhir sudah tidak memberikan noda pada uji KLT.
2. HASIL PENGAMATAN
Sinar
λ
Fase diam
: Kiesel Gel 254
Fase gerak
: Heksan : Etil Asetat (4:1)
Sinar
λ
Harga Rf: Fraksi 1 (Vial 1-6)
Rf:
4,1
Rf : Rf :
8
=0,5152
4,8 8
=0,6000 Fraksi 2 (vial 7-10)
5,3 8
=0,6625
Rf : Rf :
2,5 8
=0,3125
3,5 8
=0,4375
Rf : Rf : Rf :
3,7 8
=0,4625
4,1 8
=0,5125
Rf :
8
2,3 8
=0,2875
2,6 8
=0,3250
3 8
Rf : Rf : Rf : Rf :
3,5 8
=0,4375
Rf : Rf : Rf :
8
Rf : Rf :
Rf
:
5,5 8
Fraksi 4 (Vial 23-38)
Rf : Rf : Rf : Rf :
1,2 8
=0,1500
1,7 8
=0,2125
2,6 8
=0,3250
5,0 8
=0,6250
=0,4825
4,2 8
=0,5250
5,0 8
=0,6250
5,5 8
=0,6875
1,2 8
=0,1500
1,8 8
=0,2250
2,6 8
=0,3250
5,0 8
=0,6250
Fraksi 7 (Vial 51-60)
Rf :
=0,6375
3,7
Fraksi 5 (Vial 39-43)
Rf :
8
=0,6000
Rf : =0,3750 Rf :
5,1
4,8
Fraksi 3 (vial 11-22)
Rf :
Rf :
1,3 8
=0,1625
2,0 8
=0,2500
5,0 8
=0,5250
Fraksi 6 (Vial 44-50)
Rf : Rf : Rf : Rf :
1,2 8
=0,1500
1,9 8
=0,2375
2,6 8
=0,3250
5,0 8
=0,6250
=0,6875
PEMBAHASAN
Fraksinasi merupakan suatu prosedur yang digunakan untuk memisahkan golongan utama kandungan yang satu dari kandungan golongan utama yang lainnya. Fraksinasi merupakan prosedur pemisahan komponen-komponen berdasarkan perbedaan kepolaran tergantung dari jenis senyawa yang terkandung dalam tumbuhan. Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian campuran dengan memakai kolom. Sebelum melakukan percobaan kromatografiperlu dipastikan kondisi dari eluennya, seperti pemilihan pelarut yang cocok. Pada pemisahan menggunakan kromatografi kolom ini, campuran yang akan dipisahkan diletakkan dibagian atas kolom yang terlebih dahulu telah dibuat.pelarut fase gerak dibiarkan mengalir melewati kolom, karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat (gravitasi) atau didorong dengn tekanan. Pita senyawa larut bergerak melalui kolom dengan laju berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi-fraksi ketika keluar dari kolom ( sudjadi 1986). Pada praktikum kromatografi ini digunakan metode kromatografi kolom basah, dimana silica gel tersebut dilarutkan terlebih dahulu atau disuspensikan didalam cairan atau pelarutnya yang nantinya akan digunakan, kemudian dimasukkan kedalam kolom sedikit demi sedikit dan perlahan, pastikan tidak terdapat gelembung udara yang ada di dalam kolom. Penambahan pelarut atau eluen harus tetap dilakukan terus menerus yang fungsinya mecegah terjadinya kerusakan atau pecahnya kolom yang diakibatkan adanya rongga udara. Tambahkan kolom tersebut hingga batas tanda sambil keran bawah tabung dibuka. Setelah kolom berada pada batasnya, tutp bagian bawah keran. Sambil menunggu kolom preparatif siap untuk digunakan, maka kita persiapkan ekstrak atau campuran yang nantinya akan dipisahkan. Pertama ekstrak dikeringkan dengan silica gel hingga berbentuk butir-butir yang menyerupai pasir. Kemudian ditambahkan dengan eluen untuk melarutkan dan setelah itu dimasukkan kedalam tabung diatas kolom yang telah dibuat sebelumnya. Setelah itu ditambahkan eluen hingga batas pada tabung sekitar 3 cm. kemudian eluen dialirkan keluar tabung melalui kran bawah, sambil eluen dialirkan keluar kolom, penambahan eluen harus tetap dilakukan untuk mencegah keringnya kolom didalam tabung. Jika kolom masih berwarna putih maka penambahan eluen serta pengeluaran eluen tetap dilakukan sampai seluruh kolom sudah tidak berwarna putih seperti
awalnya. Setelah kolom kromatografi tidak berwarna maka mulai diatur kecepatan tetesan yang keluar dari tabung kolom kromatografi tersebut, cairan yang keluar dari tabung kolom kromatografi tersebut ditampung dalam vial yang sudah dikalibrasi sebesar 5 ml pada tiap tabungnya. Sambil tetap ditambahkan eluen dari atas tabung hingga didapat 60 vial. Dari 60 vial tersebut kita tutup dan diberikan lubang udara pada penutup vial tersebut, dan dibiarkan selama 3 hari. Setelah itu fraksi dalam vial tersebut dilarutkan terlebih dahulu dengan eluennya, setelah itu baru dilakukan uji KLT pada tiap-tiap fraksi yang sudah didapat. Dari hasil KLT tersebut didapatkan gambaran atau nilai Rf smentara yang nantinya akan dikelompokkan lagi. Dari fraksi yang sama kemudian fraksi-fraksi tersebut dijadikan satu dan di lakukan uji KLT untuk yang kedua.
3. DOKUMENTASI
MemasukkanekstrakPsidium guajava
Proses fraksinasi
4. KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan maka dapat ditarik kesimpulan, fraksinasisecarakromatografikolomdariekstraktanaman Psidiumguajavadenganeluen n-heksana : etilasetatdenganperbandingan 4:1menghasilkan 7 fraksi. Pelarut
yang
digunakanpadakromatografikolomharusdioptimasiterlebihdahuludanharusdilakukanpe nggantianpelarutsecarabertahap, non polar-semi polar-polar agar terbentukfraksi yang beragam. harusdipilih pula eluen yang tepatuntukmelakukananalisapada KLT.
