1. Apakah artinya bila indeks kemurnian < 1,75? Perlu dilakukan apa?
Angka tersebut menunjukkan hasil tidak murni karena terkontaminasi oleh protein. D NA yang didapatkan belum sesuai dengan standar, yang perlu dilakukan adalah melakukan is olasi ulang dengan pengendapan protein kembali untuk menghasilkan hasil yang sesuai.
2. Mengapa pada isolasi DNA darah, sel darah merah harus dilisiskan?
Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang tidak m engandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. A gar sel darah putih yang mengandung inti sel dapat diisolasi a tau dipisahkan dari sel darah me rah. 3. Jelaskan prinsip dan teknik isolasi dan purifikasi DNA!
Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengenda pkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan memisahkan DNA dari bahan lain se perti protein, lemak dan karbohidrat. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan cam puran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul bes ar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian ata s tabu ng. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pa da bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Teknik sentrifugasi t ersebut dilakukan Di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1 –3; LPCH 2005:2). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk me ngendapkan suatu komponen dari campuran. DNA yang biasa digunakan dalam tes ada dua yaitu DNA mitokondria dan DNA intis el. Perbedaan kedua DNA ini hanyalah terletak pada lokasi DNA tersebut berada dalam sel,y ang satu dalam inti sel sehi ngga disebut DNA inti sel, sedangkan yang sa t u t e r d a p a t d i mitoko mitokondr ndria ia dan dan disebu disebutt DNA mitok mitokond ondria ria.. Untuk Untuk tes tes DNA yang yang pali paling ng aku aku rat dalam tes DNA adalah inti sel, karena sel tidak pernah berubah seiring dengan perkawinan keturununnya. DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel: darah, seru m/plasma, jaringan, akar rambut, sperma. Teknik utama dari isolasi DNA adalah:
1) Penghancuran dinding sel. 2) Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS atau Triton X). 3) Membersihkan debris sel dengan proteinase. 4) Pencucian dengan menggunakan alkohol
Tahapan teknik isolasi DNA, yaitu: 1) Penghancuran membran sel dengan Cell Lysis Solution (CLS) 2)
Penghancuran membran inti dengan Nuclei dengan Nuclei Lysis Solution (NLS)
3) Pengendapan protein dengan Protein dengan Protein Precipitation Precipitation Solution (PPS) 4)
Pencucian DNA dengan isopropanol dan alkohol 70%
5) Rehidrasi DNA dengan Rehidration dengan Rehidration Solution
Tujuan sentrifugasi: 1) Sentrifuge pertama bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma 2) Sentrifuge kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari isi nukleus 3) Sentrifuge ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi
4. Jelaskan fungsi larutan pada isolasi DNA!
Berikut beberapa larutan yang digunakan pada isolasi DNA, antara lain: 1) larutan lysis I Fungsi larutan ini adalah untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanen an menggunakan sentrifus. EDTA sebagai kelator untuk mengikat ion Mg2+ untu k inaktivasi enzim DNase, glukosa untuk menyamakan potensial osmotik sel sela ma proses lysis menggunakan SDS agar sel bakteri tidak meledak seketika. 2) lysis solution Fungsi larutan ini adalah untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membr an sel (oleh SDS), dan mendenaturasi DNA kromosol namun tidak mendenaturasi DNA plasmid. DNA plasmid tidak terdenaturasi karena sifatnya yang covalently c losed circular DNA (cccDNA) 3) (neutralizing solution) Fungsi larutan ini adalah untuk menetralisir pH menghentikan denaturasi DN A kromosomal sehingga terbentuk presipitat DNA kromosom yang menempel den gan debris seluler, dan memisahkan DNA plasmid yang larut di dalam supernatan. 4) TNES urea
Fungsi : sebagai pelisis membrane sel 5) Proteinase Fungsinya sebagai enzim yang dapata mendegradasi protein 6) RNAse Fungsinya sebagai enzim yang dapat mendegradasi RNA 7) PCIAA (Phenol Chlorofom Isoamyl Alcohol) Fungsinya untuk untuk memisahkan komponen lipid dan polisakarida dari larutan 8) Etanol absolut Fungsinya untuk presipitasi DNA 9) Etanol 70% Fungsinya untuk memurnikan DNA 10) TE (Tris-EDTA) Fungsinya sebagai pelarut DNA atau RNA 11) Buffer Ekstraksi Karakteristik dan fungsi : untuk melisiskan membrane sel dan membrane fosfolipi d bilayer