1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Praktikum
Praktikum yang dilakukan membahas tentang isolasi dan ekstraksi DNA dari inti sel. Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jumat,16 September 2011 dengan asisten dosen Hendri Gunawan. Praktikum ini dilakukan karena hal ini merupakan prinsip dasar dari bioteknologi. Sebelum mempelajari bioteknologi secara lebih mendalam, kita harus memahami cara mengisolasi dan mengekstraksi DNA dari inti sel. Sebab setiap makhluk hidup pasti memiliki DNA.
DNA memiliki karakteristik yang unik dan akan berbeda-beda pada tiap organisme. Dalam praktikum ini yang akan diamati adalah bentuk DNA dari DNA sel hewan (hati sapi dan hati ayam), dan sel tumbuhan (kecambah kacang hijau). Larutan yang digunakan adalah sukrosa 0,5M dingin, NaCl 1M dingin, larutan “sunlight”, “sunlight”, kloroform, dan etanol. Larutan sukrosa disini digunakan supaya cairan yang berada dalam sel hewan maupun tumbuhan dapat keluar karena adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar sel yang disebut juga lisis sel. se l.
NaCl dingin termasuk dalam kelompok garam. Garam memiliki fungsi utama yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Selain itu, garam juga menyebabkan protein terdenaturasi. te rdenaturasi. Pada akhir percobaan, terbentuk titik-titik atau at au globula. Hal ini merupakan DNA. Molekul DNA bersifat larut air, tapi tidak larut dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol, molekul DNA akan terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. Namun, yang tampak tersebut merupakan ribuan molekul DNA yang tergabung bersama. DNA murni sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari pigmen bahan
yang
diekstrak
DNA-nya
(Kimball,
1992).
Etanol
digunakan
untuk
mengelompokkan DNA yang melayang-layang dalam larutan sehingga menggumpal di permukaan larutan.
DNA ( Deoxyribonucleic acid ) merupakan informasi genetik utama pada sel hidup dan organisme. Pesan genetik disampaikan melalui rangkaian basa pada polinukleotida dari
1
2
DNA tersebut. DNA makromolekul pada sel hidup secara normal terlihat dalam bentuk polimer 2 nukleotida yang terhubung sehingga berbentuk seperti spiral atau yang biasa disebut dengan double helix. Dua polimer basa pada ikatan double helix ini dihubungkan oleh atom hidrogen. (Balasubramanian et al., 1996).
Isolasi adalah suatu cara untuk memisahkan satu mikrobia dari mikrobia lainnya yang bertujuan untuk mendapatkan spesies tunggal dengan sifat-sifat yang diinginkan. Sel dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di dalamnya. Prinsip prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. (Kimball, 1992). Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Lewis, 2003).
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: 1. Isolasi jaringan 2. Dinding dan membran sel dilisiskan 3. Diekstraksi dalam larutan 4. Dipurifikasi 5. Dipresipitasi (Lewis, 2003)
1.2. Tujuan dan Manfaat Praktikum
Tujuan dan manfaat dilakukannya praktikum ini adalah agar praktikan dapat mengetahui cara mengisolasi DNA, mengetahui cara mengekstraksi DNA dari inti sel, mengetahui cara pemurnian DNA, serta mengetahui dan membandingkan bentuk DNA pada sel hewan dan sel tumbuhan.
2. HASIL PRAKTIKUM
Hasil pengamatan isolasi dan ekstraksi DNA dari inti sel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Isolasi dan Ekstraksi DNA dari Inti Sel. Kel
Bahan
E1
Hati sapi sebelum ditambah etanol
Gambar DNA
Warna
Putih bening
Hati sapi sesudah ditambah etanol Putih keruh
E2
Hati sapi sebelum ditambah etanol Putih bening
Hati sapi sesudah ditambah etanol
Keterangan DNA berupa titik-titik yang melayang di atas permukaan
DNA berupa titik-titik yang berukuran lebih besar dan jumlahnya lebih banyak Titik-titik menyebar di permukaan
menyebar di seluruh bagian larutan Putih keruh
E3
Hati ayam sebelum ditambah etanol Merah muda
3
Larutan berwarna merah muda dan ada endapan putih di permukaan
4
Hati ayam sesudah ditambah etanol Putih keruh
E4
Hati ayam sebelum ditambah etanol Merah muda
Hati ayam sesudah ditambah etanol Putih keruh
E5
Kecambah kacang hijau sebelum ditambah etanol
Kecambah kacang hijau sesudah ditambah etanol
E6
Bening
Bening
Kecambah kacang hijau sebelum ditambah etanol
Larutan menjadi bewarna putih keruh karena ada endapan di seluruh bagian larutan
Ada endapan putih di permukaan
Ada endapan di seluruh bagian larutan
Gelembung menyatu di bawah
Gelembung menyebar di atas permukaan
Gelembung menyatu di bawah Bening
5
Kecambah kacang hijau sesudah ditambah etanol
Gelembung menyebar di atas permukaan Bening
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa hasil yang diperoleh kelompok E1 yang menggunakan sampel hati sapi, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna putih bening dengan DNA berupa titik-titik yang melayang di atas permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan DNA berupa titik-titik yang berukuran lebih besar dan jumlahnya lebih banyak. Kelompok E2 yang menggunakan sampel hati sapi, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna putih bening dengan titik-titik menyebar di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan titik-titik menyebar di seluruh bagian larutan. . Kelompok E3 yang menggunakan sampel hati ayam, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna merah muda dan ada endapan putih di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh karena ada endapan di seluruh bagian larutan. Kelompok E4 yang menggunakan sampel hati ayam, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna merah muda dengan ada endapan putih di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan ada endapan di seluruh bagian larutan. Kelompok E5 yang menggunakan sampel kecambah kacang hijau, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna bening dengan gelembung menyatu di bawah, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan tetap bewarna bening dengan gelembung menyebar di atas permukaan. Kelompok E6 yang menggunakan sampel kecambah kacang hijau, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna bening dengan gelembung menyatu di bawah, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan tetap bewarna bening dengan gelembung menyebar di atas permukaan.
3. PEMBAHASAN
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings, 1994). DNA mempunyai struktur pilinan utas ganda (double helix) yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri dari 2 macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang mempunyai struktur cincinganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun ( building block ) DNA terdiri atas 1 gula pentosa, 1 gugus fosfat dan 1 pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis, 2003). Molekul DNA pada semua macam sel terdiri atas unit – unit keempat mononukleotida utama yaitu d AMP, d GMP, d TMP, dan d CMP yang dihubungkan dalam suatu variasi deretan oleh ikatan fosfodiester. DNA suatu spesies atau organisme tertentu memiliki perbandingan dan urutan yang khas untuk keempat mononukleotida tersebut. Selain itu, berat molekul DNA untuk tiap macam organisme juga berbeda. Sel eukariotik mengandung beberapa kromosoma dan memiliki banyak molekul DNA dengan berat molekul yang sangat besar (Wirahadikusumah, 1989).
6
7
Metode ekstraksi DNA yang sering digunakan biasanya adalah ekstraksi CTAB dan RAPD. Menurut jurnal yang diterbitkan oleh Prana dan Hartati (2003),
salah satu
teknik yang dapat digunakan untuk memperoleh DNA yaitu RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), teknik molekuler berdasarkan teknologi PCR. Teknik ini cukup sederhana dan dapat dikerjakan dalam waktu relatif singkat dibanding teknik molekular lainnya. RAPD telah banyak digunakan dalam analisis keragaman berbagai jenis tanaman seperti Shorea laevis, Pinus radiata dan padi. Selain mempunyai keuntungan dalam segi teknis yaitu relatif sederhana, kuantitas DNA yang dibutuhkan hanya sedikit. Teknik ini mampu menyajikan hasil dalam waktu yang relatif singkat karena setelah proses amplifikasi DNA, hasil dapat segera divisualisasi. Selain itu, untuk teknik RAPD tingkat kemurnian DNA yang dibutuhkanpun tidak perlu terlalu tinggi atau dengan kata lain teknik ini toleran terhadap tingkat kemurnian DNA.Kelemahan teknik RAPD adalah tingkat keberulangannya (reproducibility) yang rendah.
Sedangkan menurut jurnal yang dibuat oleh Yun-Jiang Cheng (2003) metode yang sederhana
dan efisien
untuk ekstraksi
genom
DNA
dari
tanaman yang
mengandung kadar polisakarida tinggi adalah metode CTAB atau prosedur SDS yang menggunakan langkah pemurnian untuk
menghilangkan
polisakarida dengan
menggunakan eter dan 1,25 M NaCl. Metode CTAB bila dikombinasikan dengan eter NaCl dapat menghasilkan hasil yang memuaskan.
Pada praktikum ini kami menggunakan bahan, antara lain : hati sapi, hati ayam, kecambah kacang hijau, larutan sukrosa 0,5M dingin, larutan NaCl dingin 1M, larutan “Sunlight” 10%, larutan kloroform, larutan etanol dingin 95%, dan es batu. Sedangkan alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah timbangan analitik, erlenmmeyer, kain saring (kain kasa), gelas ukur, bekker glass, tabung sentrifuge, sentrifuge, pengaduk, pipet volume, pompa Pilleus, dan baskom.
Isolasi inti sel dilakukan dengan cara, pertama-tama hati sapi maupun hati ayam(untuk isolasi inti sel hewan) atau kecambah kacang hijau(untuk isolasi inti sel tumbuhan) ditimbang sebanyak 4 gram menggunakan timbangan analitik kemudian digerus hingga halus. Penggerusan ini termasuk proses homogenisasi dari fraksinasi sel. Dimana
8
fraksinasi ialah upaya memisahkan bagian sel dan mengambil organel yang diinginkan. Fraksinasi umumnya dimulai dengan homogenasi yang diikuti dengan ultrasentrifugasi. Homogenasi ialah upaya penggerusan jaringan agar sel-sel pecah dan isinya diletakkan dalam medium homogenat dengan buffer yang menjaganya dari kerusakan. Sehingga dari proses ini, akan dihasilkan isi sel termasuk inti sel yang akan dianalisa DNA-nya dan dengan penambahan sukrosa, isi sel ini akan terjaga dari kerusakan (Muslim,2003). Kemudian ditambahkan 20 ml larutan sukrosa dingin 0,5M. Sukrosa ditambahkan untuk membantu sentrifugasi dalam memisahkan fraksi homogen. Larutan sukrosa berfungsi sebagai larutan isotonis yang dapat menstabilkan keadaan di dalam sel. Selain itu larutan sukrosa juga berfungsi untuk membersihkan sel dari pengotor-pengotor protein. (Kimball,1992). Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam dua tabung sentrifuge, dan ditimbang, lalu disentrifuge selama 10 menit, dan kemudian cairannya dibuang. Hal tersebut sesuai dengan teori Harley (2005) yaitu supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya. Endapan yang didapat dalam tabung sentrifuge ditambah masingmasing 10 ml larutan sukrosa dingin 0,5M. Setelah itu, larutan dalam kedua tabung sentrifuge dicampur menjadi satu dalam bekker glass dan disaring menggunakan kain saring. Menurut Kimball (1992), larutan disaring untuk menghilangkan debris, seperti membran sel, protein yang mengendap, potongan-potongan bahan yang tidak dapat dihancurkan seluruhnya. Menurut teori dari Suyitno (1989) filtrasi atau penyaringan adalah salah satu cara untuk memisahkan antar partikel padat dengan partikel fluida termasuk gas. Pada penyaringan campuran yang terdiri atas partikel padat yang terdispersi dalam fase cair atau gas, dilewatkan dengan melalui medium berpori. Partikel padat yang tidak lolos pada pori-pori medium akan tertahan sedangkan cairan akan lolos melalui pori-pori medium tersebut. Cairan yang lolos dari medium tersebut disebut dengan filtrat dan partikel padatan yang tertahan dikenal dengan cake. Sebagai medium penyaring, dapat digunakan kain saring, anyaman kawat, dan anyaman plastik. Larutan yang didapat, disentrifuge kembali selama 10 menit, setelah disentrifuge selama 10 menit, dibuang cairannya dan diambil endapannya. Menurut Kimball (1992) prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik
9
sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.
Tahap selanjutnya adalah melakukan ekstraksi DNA. Inti sel hewan atau tumuhan yang sudah didapatkan, ditambah dengan 20 ml NaCl dingin dan 0,2 ml larutan “sunlight” 10%. NaCl dingin yang termasuk dalam kelompok garam berfungsi untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Selain itu, garam juga menyebabkan protein terdenaturasi. Kutub positif dari NaCl (Na2+) mengarah ke DNA yang bersifat negatif. Hal ini menimbulkan shield di sekitar molekul DNA dan menyebabkannya berkumpul (coalesce). Hal ini membuat DNA dapat terpresipitasi ketika ditambahkan alkohol. Selain itu, garam juga menyebabkan protein terdenaturasi. Sabun “sunlight” berfungsi untuk mengikat kation. Lapisan lemak bilayer dari membran sel dan nukleus dipecah oleh sabun, seperti lauryl atau laureth sulfate yang terkandung dalam sampo dan sabun pencuci piring. Sampo dan sabun pencuci piring juga mengandung EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid ), yang mengikat kation seperti Mg 2+. Kation bertindak sebagai kofaktor yang membantu enzim bekerja. Salah satu enzim yang berperan ialah nuklease, yaitu dengan menguraikan DNA(Kimball,1992). Kemudian campuran tersebut diaduk dalam baskom berisi es batu hingga mengental, setelah campuran tersebut mengental ditambahkan 0,2 ml kloroform. Pengadukan dilakukan dalam baskom berisi es batu untuk menjaga suhu agar tetap stabil dan tidak merusak DNA. Menurut Kimball (1992) penambahan reagen-reagen tersebut memiliki tujuan khusus. Pemberian larutan kloroform menurut Kimbal (1992) berfungsi untuk memisahkan DNA dari membran sel yang memiliki berat molekul lebih besar. Penambahan ini juga dapat menyebabkan lisisnya membran sel serta terdenaturasinya protein – protein sel seperti endonuklease. Lisisnya membran sel akan memudahkan molekul – molekul DNA terpisah dari kompleks CTAB, protein, dan senyawa – senyawa polisakarida.. Lalu disentrifugasi ± selama 10 menit dengan kecepatan maksimal, lalu cairan yang didapat dari sentrifugasi dipindahkan ke dalam erlenmeyer (cairan diambil, endapan dibuang) setelah itu difoto. Kemudian larutan tersebut ditambah dengan etanol sebanyak 30 ml dan difoto kembali. Etanol berfungsi untuk mendeteksi adanya DNA dalam bahan pangan(Kimball,1992). Perubahan yang terjadi pada larutan diamati.
10
Langkah-langkah yang dilakukan pada percobaan ini sudah sesuai dengan pendapat Harley (2005) yang mengatakan bahwa isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: 1. Isolasi jaringan yang diinginkan. 2. Dinding dan membran sel dilisiskan Menggunakan larutan pelisis yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. 3. Diekstraksi dalam larutan Setelah dilakukan inkubasi, jaringan yang telah bercampur dengan larutan pelisis tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleusnya. 4. Dipurifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan jaringan dari zat-zat lainnya. 5. Dipresipitasi Tahap terakhir ini, bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi. Prinsip utama dalam melakukan isolasi DNA adalah sentrifugasi dan presipitasi.
Pada hasil praktikum dapat dilihat bahwa hasil yang diperoleh kelompok E1 yang menggunakan sampel hati sapi, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol
11
bewarna putih bening dengan DNA berupa titik-titik yang melayang di atas permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan DNA berupa titik-titik yang berukuran lebih besar dan jumlahnya lebih ban yak. Kelompok E2 yang menggunakan sampel hati sapi, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna putih bening dengan titik-titik menyebar di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan titik-titik menyebar di seluruh bagian larutan. Kelompok E3 yang menggunakan sampel hati ayam, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna merah muda dan ada endapan putih di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh karena ada endapan di seluruh bagian larutan. Kelompok E4 yang menggunakan sampel hati ayam, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna merah muda dengan ada endapan putih di permukaan, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan menjadi bewarna putih keruh dengan ada endapan di seluruh bagian larutan. Kelompok E5 yang menggunakan sampel kecambah kacang hijau, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna bening dengan gelembung menyatu di bawah, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan tetap bewarna bening dengan gelembung menyebar di atas permukaan. Kelompok E6 yang menggunakan sampel kecambah kacang hijau, larutan yang diperoleh sebelum ditambah etanol bewarna bening dengan gelembung menyatu di bawah, sedangkan setelah ditambah etanol, larutan tetap bewarna bening dengan gelembung menyebar di atas permukaan.
Hasil yang diperoleh tiap kelompok berbeda-beda. Hal itu karena sampel yang digunakan juga berbeda. Bila dilihat dari jumlahnya, seharusnya jumlah DNA pada hewan lebih banyak daripada yang lain karena sel DNA hewan ukurannya lebih besar (Kimball, 1992), namun pada hasil praktikum tidak nampak perbedaan dari segi jumlah DNAnya. Sementara pada warnanya, semua larutan setelah ditambah etanol akan berwarna lebih keruh dari sebelumnya. Karena menurut Kimball (1992) molekul DNA bersifat larut air, tapi tidak larut dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol, molekul DNA akan terpresipitasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. Hal inilah yang menyebabkan larutan menjadi bertambah keruh.
12
Namun pada hasil praktikum terdapat perbedaan dengan teori yang ada yaitu larutan sampel pada kelompok 5 dan 6 sebelum dan setelah ditambah etanol tidak terdapat perubahan, yaitu tetap bewarna bening, hal ini mungkin disebabkan adanya kesalahan saat memisahkan endapan dan cairan setelah sentrifugasi yaitu masih ada endapan dan cairan yang bercampur, atau bisa juga alat yang dicuci kurang bersih sehingga reagen bercampur dengan bahan lain dan tidak bekerja sebagaimana mestinya karena menurut Hadioetomo (1993) kondisi lingkungan sangat menentukan dalam isolasi D NA.
Pada hasil praktikum dapat dilihat hasil yang didapat terdapat titik-titik atau gelembung. Menurut Kimball (1992) titik-titik atau gelembung yang terbentuk tersebut merupakan molekul-molekul DNA. Molekul DNA bersifat larut air, tapi tidak larut dalam alkohol. Akibatnya, ketika DNA kontak dengan alkohol, molekul DNA akan terpresipi tasi dalam alkohol dan dapat terlihat secara visual. Namun, yang tampak tersebut merupakan ribuan molekul DNA yang tergabung bersama. DNA murni sebenarnya tidak berwarna. Warna yang tampak saat pengamatan berasal dari pigmen bahan yang diekstrak DNAnya (Kimball, 1992). Semua sel mengandung DNA namun beberapa jaringan mempunyai aktifitas deoksiribonuklease yang tinggi sehingga menyebabkan DNA pecah menjadi fragmen yang lebih kecil. Oleh karena itu sample yang baik sebagai sumber DNA mempunyai syarat mengandung DNA tinggi namun mempunyai aktifitas deoksiribonuklease rendah. DNA diendapkan sebagai massa berserat berwarna putih dengan penambahan ethanol. (Tranggono, 1989). Dalam proses ekstraksi DNA, ditambahkan larutan etanol. Penambahan ini berfungsi untuk membantu mendeteksi adanya DNA dalam bahan pangan. Dalam ekstraksi, DNA yang dihasilkan akan terdapat pada lapisan atas larutan yang ditambahkan ethanol, karena DNA tidak larut ethanol. Sehingga dapat diamati dengan melihat lapisan atas dari campuran tersebut (Mazmur, 1961). Namun pada hasil praktikum ini justru DNA terlihat di seluruh bagian larutan setelah penambahan etanol. Kesalahan ini mungkin disebabkan karena adanya kesalahan saat memisahkan endapan dan cairan setelah sentrifugasi yaitu masih ada endapan dan cairan yang bercampur, atau bisa juga alat yang dicuci kurang bersih sehingga reagen bercampur dengan bahan lain.
13
Menurut Fatchiyah (2006), semakin tinggi kadar air (makin beningnya larutan), maka sel yang terlarut akan semakin sedikit sehingga DNA yang terpresipitasi juga semakin sedikit. Hal inilah yang menyebabkan warna larutan menjadi berbeda antara satu bahan dengan yang lainnya. Semakin keruh larutan maka DNA yang terpresipitasi pun semakin banyak. Hasil yang diperoleh sesuai dengan teori tersebut sebab hati sapi merupakan bahan yang paling padat dan paling sedikit mengandung kadar air bila dibandingkan dengan bahan lainnya sehingga larutan yang berisi inti sel hewan yang diambil dari sampel hati sapi dan hati ayam berwarna lebih keruh daripada larutan yang berisi inti sel tumbuhan yang diambil dari sampel kecambah kacang hijau.
Pada hasil pengamatan yang telah dilakukan, tidak terlihat bentuk double helix seperti pada teori di semua larutan yang telah dibuat. Menurut teori Zanta (2006) hal ini disebabkan karena ukuran DNA yang terlalu kecil sehingga sulit untuk dilihat. Selain itu mungkin ada DNA yang terpotong atau tergulung sehingga terlihat seba gai titik-titik. DNA terdapat di dalam sel, sel tersebut berukuran sangat kecil juga dan sulit dilihat tanpa menggunakan mikroskop, apalagi DNA yang terdapat di dala mnya.
4. KESIMPULAN
DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik.
Prinsip utama dalam melakukan isolasi dan ekstraksi DNA adalah presipitasi dan sentrifugasi.
DNA larut air, tetapi tidak larut alkohol.
Tahap-tahap isolasi adalah isolasi jaringan, pelisisan dinding sel, pengekstrasian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
Homogenasi ialah upaya penggerusan jaringan agar sel-sel pecah dan isinya diletakkan dalam medium homogenat dengan buffer yang menjaganya dari kerusakan, sehingga akan dihasilkan isi sel termasuk inti sel yang akan dianalisa DNA-nya
Larutan sukrosa berfungsi sebagai larutan isotonis yang menstabilkan keadaan di dalam sel dan membersihkan sel dari pengotor-pengotor protein.
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan dua substansi berdasarkan perbedaan berat jenisnya.
Penyaringan dilakukan untuk menghilangkan debris, seperti membran sel, protein
yang mengendap,
potongan-potongan bahan
yang tidak
dapat
dihancurkan seluruhnya.
Sebagai medium penyaring, dapat digunakan kain saring, anyaman kawat, dan anyaman plastik.
Penambahan NaCl ditujukan untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil.
Sabun “sunlight” berfungsi untuk mengikat kation, dan memecah l apisan lemak bilayer dari membran sel dan nukleus.
Pengadukan pada suhu dingin pada ekstraksi sel bertujuan agar suhu tetap stabil dan DNA tidak rusak.
Larutan kloroform berfungsi untuk memisahkan DNA dari membran sel yang memiliki berat molekul lebih besar dan menyebabkan lisisnya membran sel serta terdenaturasinya protein – protein sel seperti endonuklease.
14
15
Warna larutan paling keruh terdapat pada hati sapi karena hati sapi merupakan sampel yang paling padat sehingga DNA yang terpresipitasi pun semakin banyak.
Etanol berfungsi untuk mendeteksi adanya DNA dala m bahan pangan.
Ekstraksi DNA dari sel tumbuhan berwarna bening, sedangkan ekstraksi DNA dari sel hewan berwarna keruh.
Jumlah DNA pada hewan lebih banyak daripada yang lain karena sel DNA hewan ukurannya lebih besar.
Semarang,22 September 2011 Praktikan:
Asisten Dosen:
Erika Saraswati
10.70.0027
Samuel Christianto Hardha
10.70.0058
Noni Jouvita
10.70.0062
Kiki Ria Kristianti
10.70.0121
-Hendri Gunawan
5. DAFTAR PUSTAKA
Balasubramanian, C.F.A. Bryce, K. Dharmalingam, J. Green, Kunthala Jayaraman. (1996). Concept inBiotechnology. Universities Press. India. Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press. Hadioetomo, R. S. (1993). Mikobiologi Dasar dalam Praktek, Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. P. T. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Harley, J.T. (2005). Regulatory exercises in microbiology. 6th ed. McGraw-Hill Company, Boston: xiv + 466 hlm. Kimball, J.W. (1992). Biologi jilid 1 edisi 5. Erlangga. Jakarta. Klug, W.S. & M.R. Cummings. (1994). Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm. Lewis, R. (2003). Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills Company, Inc., Boston. Mazmur, L. (1961). A Procedure for the Isolation of DNA from Microorganism. Journal of Molecular Biology. www.ncbe.reading.as.uk/NCBE/Protocols?PDF/PeaDNA.pdf Muslim, C. (2003). Biologi Molekuler Sel. Jurusan Biologi Universitas Bengkulu. Bengkulu. Prana,Titik & Sri Hartati (2003) Identifikasi Sidik Jari DNA Talas (Colocasia esculenta L. Schott)Indonesia dengan Teknik RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Skrining Primer dan Optimalisasi Kondisi PCR. http://www.unri.ac.id/jurnal/jurnal_natur/vol5%282%29/titik.pdf Suyitno. (1989). Petunjuk Laboratorium Rekayasa Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan & Gizi UGM. Yogyakarta. Tranggono, B. Setiaji, dkk. (1989). Petunjuk Laboratorium Biokimia Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Wirahadikusumah, M. (1989). Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. ITB. Bandung. 16
17
Yun, Jiang Cheng, et al.(2003) An Efficient Protocol for Genomic DNA Extraction From Citrus Species. https://secure.cisti-icist.nrccnrc.gc.ca/cisti/journals/ispmb/ispmb21/r03-016.pdf Zanta,C.A.(2006). Biotechnology in a lunchbox:Extract DNA from fruit and make a smoothie!!!UIUC-Hughes Biotechnology Education and outreach Program(www.life.uiuc.edu/hughes/footlocker). Diakses tanggal 21 September 2011
6. LAMPIRAN
6.1. Jurnal
6.2. Laporan Sementara
18
